khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng sự lên men ethanol từ nguyên liệu khoai mì

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


TRẦN NGỌC DIỄM
MSSV: LT10010

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
SỰ LÊN MEN ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU
KHOAI MÌ

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08
Cần Thơ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Tên đề tài:

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
SỰ LÊN MEN ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU
KHOAI MÌ

Giáo viên hướng dẫn:
ThS. Vũ Trường Sơn

Sinh viên thực hiện:
Trần Ngọc Diễm
MSSV: LT10010
Lớp: CNTP36LT
Cần Thơ, 2012

ii


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CAM ĐOAN


Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng sự
lên men ethanol từ nguyên liệu khoai mì’ do sinh viên Trần Ngọc Diễm thực
hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua.
Giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày ….. tháng ….. năm 2012.
Chủ tịch hội đồng

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang i

LỜI CẢM TẠ


Nhờ sự tận tình giúp đỡ của thầy cô và các bạn, đề tài tốt nghiệp của em đã hoàn
thành. Có được kết quả này, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:
Quý Thầy Cô Trường Đại học Cần Thơ đã giảng dạy và truyền đạt những kiến
thức quý báu cho em trong những năm học qua.
Thầy Vũ Trường Sơn, giảng viên Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm đã tận tình
hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để giúp em hoàn thành tốt
luận văn tốt nghiệp chuyên Ngành Công Nghệ Thực Phẩm.
Tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm cùng tất cả các
bạn trong phòng thí nghiệm đã động viên, đóng góp ý kiến và giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp.
Kính chúc quý thầy cô và các bạn dồi dào sức khỏe, thành công trong công việc.
Xin chân thành cảm ơn!

ii


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i
LỜI CẢM TẠ .............................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii

DANH SÁCH BẢNG....................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH....................................................................................................vi
TÓM TẮT...................................................................................................................vii
CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................1
1.1 Giới thiệu ............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................2
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU........................................................................3
2.1 Nguyên liệu khoai mì...........................................................................................3
2.2 Giới thiệu chung về hệ enzyme amylase ..............................................................6
2.2.1 α-amylase (α-1,4 glucan-4-glucanhydrolase, 3.2.1.1) ....................................7
2.2.2 β-amylase (α-1,4 glucan-mantohidrolase, 3.2.1.2) .........................................8
2.2.3 γ-amylase (α-1,4 glucan-glucohydrolase, 3.2.1.3)..........................................8
2.3 Cơ chất của amylase ............................................................................................9
2.3.1 Tinh bột ........................................................................................................9
2.3.2 Glycogen ....................................................................................................10
2.4 Cơ chế tác động của enzyme..............................................................................10
2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme ...........................................11
2.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ..................................................................11
2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ..............................................................................11
2.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme .................................................................12
2.5.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme ....................................................12
2.5.5 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm................................................................12
2.5.6 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa ................................................................13
2.6 Vi sinh vật trong bánh men thuốc bắc ................................................................13
2.6.1 Vi khuẩn .....................................................................................................13
2.6.2 Nấm men ....................................................................................................14
2.6.3 Nấm mốc ....................................................................................................14
2.7 Quá trình lên men rượu.....................................................................................15
2.7.1 Cơ chế của quá trình lên men ......................................................................16
2.7.2 Động học của quá trình lên men .................................................................17

2. 8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men.....................................................18
2.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ..............................................................................18
2.8.2 Ảnh hưởng của pH......................................................................................18
2.8.3 Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men .........................................................19
2.8.4 Ảnh hưởng của chất sát trùng......................................................................19
2.8.5 Ảnh hưởng của nồng độ rượu......................................................................19
2.9 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu.....................19
2.9.1 Sự tạo thành acid.........................................................................................19
2.9.2 Sự tạo thành rượu bậc cao ...........................................................................21
2.9.3 Sự tạo thành ester.......................................................................................21
2.10 Một vài quy trình sản xuất rượu từ tinh bột .....................................................21
2.10.1 Công nghệ sản xuất rượu gạo ....................................................................21
2.10.2 Quy trình sản xuất rượu từ sắn ..................................................................23
CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................25
Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang iii


3.1 Phương tiện thí nghiệm......................................................................................25
3.1.1 Địa điểm .....................................................................................................25
3.1.2 Thời gian ....................................................................................................25
3.1.3 Nguyên liệu ................................................................................................25
3.2 Phương pháp thí nghiệm ....................................................................................26
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước và thời gian lên men đến thể tích ethanol
sinh ra..................................................................................................................26
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men và thời gian lên men đến thể tích
ethanol sinh ra. ...................................................................................................29
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................................32
4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước và thời gian lên men đến thể tích ethanol sinh

ra.............................................................................................................................32
4.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men và thời gian lên men đến thể tích ethanol
sinh ra......................................................................................................................34
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................38
5.1 Kết luận.............................................................................................................38
5.2 Kiến nghị...........................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................39
PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .................................................. viii
Phụ lục A.1. Đo pH ............................................................................................... viii
Phụ lục A.2. Xác định hàm lượng cồn.................................................................... viii
PHỤ LỤC B: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ .....................................................................ix

iv


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG


Bảng 1: Thành phần hóa học trung bình của khoai mì....................................................5
Bảng 2: Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỉ lệ nước và thời gian lên men đến thể tích
ethanol sinh ra. ............................................................................................................27
Bảng 3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men và thời gian lên men
đến thể tích ethanol sinh ra. .......................................................................................31
Bảng 4: Kết quả khảo sát tỉ lệ nước và thời gian lên men ảnh hưởng đến thể tích ethanol
sinh ra. ........................................................................................................................32
Bảng 5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men và thời gian lên men đến thể tích

ethanol sinh ra .............................................................................................................35
Bảng phụ lục B1: Ảnh hưởng của tỉ lệ nước và thời gian lên men đến thể tích ethanol
sinh ra. .........................................................................................................................ix
Bảng phụ lục B2: Ảnh hưởng tỉ lệ nấm men và thời gian lên men đến thể tích ethanol
sinh ra. .......................................................................................................................xiv

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang v


DANH SÁCH HÌNH


Hình 1: Cánh đồng khoai mì..........................................................................................3
Hình 2: Khoai mì...........................................................................................................3
Hình 3: Cấu tạo củ khoai mì ..........................................................................................4
Hình 4: Thu hoạch khoai mì ..........................................................................................5
Hình 5: Vị trí phân cắt mạch của amylase......................................................................7
Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng....................................11
Hình 7: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng.....................................12
Hình 8: Nấm men Sacchoromyces cerevisiae...............................................................14
Hình 9: Nấm mốc Aspergillus .....................................................................................15
Hình 10: Qui trình sản xuất rượu gạo...........................................................................21
Hình 11 : Qui trình sản xuất rượu từ sắn ......................................................................23
Hình 12: Qui trình sản xuất rượu ngô ..........................................................................24
Hình 13: Qui trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu khoai mì........................................26
Hình 14: Khoai mì nấu chín và cắt nhỏ ........................................................................27
Hình 15: Khoai mì được xay nhuyễn ...........................................................................27
Hình 16: Các mẫu khoai mì được cho vào keo lên men................................................28

Hình 17: Bộ chưng cất thu nhỏ ....................................................................................29
Hình 18: Men Hải Anh Quang.....................................................................................29
Hình 19: Bọt khí sinh ra trong quá trình lên men .........................................................31
Hình 20: Sự thay đổi pH theo thời gian lên men ở các tỉ lệ nước được khảo sát ...........33
Hình 21: Sự thay đổi độ brix theo thời gian lên men ở các tỉ lệ nước được khảo sát .....34
Hình 22: Sự thay đổi pH theo thời gian lên men ở các tỉ lệ men được khảo sát ............36
Hình 23: Sự thay đổi độ brix theo thời gian lên men ở các tỉ lệ men được khảo sát ......37

vi


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT

Đề tài: “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng sự lên men ethanol từ nguyên liệu
khoai mì” thực hiện với 2 thí nghiệm:
i. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước và thời gian lên men đến thể tích ethanol
sinh ra.
ii. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men và thời gian lên men đến thể tích
ethanol sinh ra.
Đề tài đã thực hiện và thu được kết quả như sau:
Làm thí nghiệm với các tỉ lệ nước khác nhau 900 ml, 1000 ml, 1100 ml, 1200 ml
so với 1000g khoai mì được nấu chín ở cùng một tỉ lệ men là 0,6%, kết quả cho
thấy lượng nước ở 1000 ml cho hiệu quả lên men tốt do dung dịch cồn tuyệt đối
thu được nhiều nhất và thời gian lên men phù hợp nhất là 4 ngày.
Dựa vào các thông số tối ưu từ thí nghiệm 1 tiến hành thí nghiệm 2 ở các tỉ lệ
men khác nhau.Với tỉ lệ nấm men sử dụng là 0,6%; 0,8%; 1% và 1,2% nấm men

thuốc bắc trên 1000 g nguyên liệu khoai mì sau khi nấu chín thì dung dịch cồn
tuyệt đối thu được nhiều nhất ở tỉ lệ nấm men là 1% và thời gian lên men 3 ngày.

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang vii



Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu
Hiện nay, ethanol được sử dụng rộng rãi ngoài ứng dụng trong thực phẩm các đồ
uống có chứa cồn, ethanol còn được dùng cho nhiều ngành công nghiêp khác,
ethanol được sản xuất từ nguồn nguyên liệu chính là tinh bột. Ở nước ta nguồn
tinh bột tương đối dồi dào với các loại nông sản thế mạnh như gạo, ngô, khoai,
sắn (khoai mì)… Tuy vậy, không thể sản xuất ethanol với qui mô lớn từ gạo vì
vấn đề an ninh lương thực luôn là mối quan tâm hàng đầu ở mỗi quốc gia. Do đó
việc tìm một loại nguyên liệu vừa giá thành rẻ vừa đáp ứng được nhu cầu về
ethanol mà không ảnh hưởng đến an ninh lương thực là điều cần được quan tâm
và cây khoai mì (sắn) là một lựa chọn thích hợp cho nguồn sản xuất ethanol của
tương lai.
Khoai mì là cây trồng chủ lực ở Châu Phi, Châu Á và Nam Mỹ. Tại Việt Nam,
khoai mì hiện là cây lương thực xếp thứ tư trong các cây lương thực quan trọng
nhất và là nguồn thu nhập cho các hộ nông dân nhỏ.Theo truyền thống, cây có củ
đặc biệt là khoai mì được dùng như là lương thực cơ bản để thay thế cho gạo

trong lúc hạn hán hoặc mất mùa ở các vùng trung du miền núi. Ngày nay do tiến
bộ trong việc sản xuất lúa gạo nước ta mà tỉ lệ tiêu dùng khoai mì trong lương
thực giảm dần. Hiện nay người dân dùng khoai mì làm thức ăn cho gia súc hoặc
đem bán cho các nhà máy chế biến tinh bột khoai mì. Việt Nam hiện là một trong
những quốc gia lớn nhất xuất khẩu các sản phẩm được chế biến từ khoai mì,
được xếp thứ 2 sau Thái Lan.
Tinh bột được tìm thấy trong củ cây khoai mì được dùng làm bánh quy, bánh mì,
bánh xèo, bột nhào, bánh bao, bánh xốp, bánh mì vòng… Nước ép từ củ được lên
men thành rượu mạnh có tên “Kasiri”, rượu này được thêm đường và cô đặc
thành sirô có tên “Kasripo”. Loại siro này có khả năng khử trùng và được dùng
làm hương liệu.
Hầu hết các nước trên thế giới đều dùng cồn để pha chế rượu và cho các nhu cầu
khác như: y tế, nhiên liệu và nguyên liệu cho các ngành công nghiệp khác.
Tuỳ theo tình hình phát triển của mỗi nước, tỉ lệ cồn dùng trong các ngành rất đa
dạng và khác nhau. Ở các nước có nền công nghiệp rượu vang phát triển như
Italia, Pháp, Tây ban nha... cồn được dùng để tăng thêm nồng độ rượu. Một
lượng khá lớn cồn được dùng để pha chế các loại rượu mạnh, cao độ như
Whisky, Martin, Brandy, Napoleon, Rhum....

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang 1


1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Nhằm tăng giá trị của khoai mì và đa dạng hoá sản phẩm. Đề tài “Khảo sát một
số yếu tố ảnh hưởng sự lên men ethanol từ nguyên liệu khoai mì” được tiến
hành tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và
Sinh học ứng dụng – Trường Đại học Cần Thơ.
Đề tài thực hiện với 2 thí nghiệm:

Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước và thời gian lên men đến thể tích ethanol sinh
ra.
Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men và thời gian lên men đến thể tích ethanol
sinh ra.

2


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Nguyên liệu khoai mì.
Khoai mì (hay còn gọi là sắn) có tên khoa học là Manihot Esculenta và
một số tên khác mandioca, kelala, aipi, tapioca... Khoai mì là loại cây lương
thực ưa ẩm, sống thành bụi tập trung chủ yếu ở Braxin, nơi được coi là nguồn
gốc của khoai mì. Vào thế kỉ XVI khoai mì được người châu Á đem về trồng,
đến thế kỉ XIX thì phát triển sang các nước Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam.

Hình 1: Cánh đồng khoai mì
(Nguồn: />
Ở nước ta khoai mì được trồng phổ biến từ Bắc vào Nam, đặc biệt phát
triển ở các vùng đồi núi trung du và đã trở thành một loại cây màu quan trọng
trong cơ cấu nông nghiệp cũng như trong đời sống nông dân.
Khoai mì Việt Nam bao gồm nhiều loại giống. Nhân dân ta thường căn cứ
vào kích thước, màu sắc củ, thân, gân lá mà tiến hành phân loại. Tuy nhiên người
ta thường phân thành 2 loại: Khoai mì đắng và khoai mì ngọt.

Hình 2: Khoai mì
(Nguồn: />
Thân : Thuộc loại cây gỗ cao từ 2 đến 3m, giữa thân có lõi trắng và xốp nên
rất yếu.


Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang 3


Lá: Có gân lá nổi rõ ở mặt sau, thuộc loại lá đơn mọc xen kẽ, xếp trên thân
theo chiều xoắn ốc. Cuống lá dài từ 9 đến 20cm có màu xanh, tím hoặc xanh
điểm tím.
 Hoa: Là hoa đơn tính có hoa đực và hoa cái trên cùng một chùm hoa. Hoa cái
không nhiều, mọc ở phía dưới cụm hoa và nở trước hoa đực nên cây luôn luôn
được thụ phấn của cây khác nhờ gió và côn trùng.
 Quả: Là loại quả nang, có màu nâu nhạt đến đỏ tía, có hình lục giác, chia
thành ba ngăn, mỗi ngăn có một hạt.
 Rễ: Mọc từ mắt và mô sẹo của hom, lúc đầu mọc ngang sau đó cắm sâu
xuống đất. Theo thời gian chúng phình to ra và tích lũy bột thành củ.
 Củ: Khoai mì hai đầu nhọn, chiều dài từ 25 ÷ 200 cm, trung bình khoảng
40÷50 cm. Đuờng kính củ thay đổi từ 2 ÷ 25 cm, trung bình 5 ÷ 7 cm. Nhìn
chung kích thước cũng như trọng lượng củ thay đổi theo giống, điều kiện canh
tác và độ màu của đất.


Hình 3: Cấu tạo củ khoai mì
Nguồn: />
Phần vỏ gỗ: Chiếm 1 ÷ 3% , chủ yếu là cellulose và hemicellulose, chức

năng của nó có nhiệm vụ bảo vệ cả về cơ học và hóa học. Trong vỏ gỗ hoàn toàn
không có tinh bột nên trong chế biến phải loại bỏ hoàn toàn nhưng trong bảo
quản phải giữ, hạn chế tróc vỏ.
Vỏ cùi: Chiếm 3 ÷ 10%, thành phần chủ yếu là cellulose, gần như không có
tinh bột nhưng chứa nhiều dịch bào (nhựa).
Thịt cùi: Chiếm tỉ lệ lớn nhất, chứa nhiều tinh bột và protein. Đây là phần
dự trữ chủ yếu các chất dinh dưỡng của củ. Đối với sản xuất ethanol thì thành
phần quan trọng nhất là glucid lên men được, gồm tinh bột và một số đường.
Glucid trong tự nhiên được chia làm ba nhóm chính là: monosaccharide, oligo và
polysaccaride. Monosaccharide là những glucid đơn giản.Trong đó lại chia ra :

4


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

monosaccharide trioza, tetroza, pentoza, và hexoza. Trong thiên nhiên phổ biến
nhất là hexoza và pentoza. Hexoza là glucid lên men được, dưới tác dụng của
nấm men đa số hexoza sẽ biến thành rượu và CO2. Pentoza thuộc loại glucid
không lên men được. Oligosaccharrit là những glucid chưa từ 2 đến 10 gốc
monosaccharide. Trong thiên nhiên phổ biến nhất là oligo chứa 2 hoặc 3 gốc
mono. Trong đó disaccharide dễ dàng chuyển hoá thành rượu và CO2 dưới tác
dụng của hệ enzyme amylase nấm men, còn trisaccharide chỉ lên men được 1/3.

Hình 4: Thu hoạch khoai mì

(Nguồn: />
Bảng 1: Thành phần hóa học trung bình của khoai mì

Thành phần

Đơn vị trọng Thành phần chế biến được của củ sắn
lượng 100g
Củ tươi
Củ khô
Bột
Tinh bột

Năng lượng
Độ ẩm
Protein
Chất béo
Đường bột
Xơ
Tro
Canxi
Lân
Sắt
Natri
Kali
Thiamine
Riboflavin
Niaxin
Vitamin C

calo
%
g

g
g
g
g
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg

135
65.6
1.0
0.2
32.4
1
0.9
2,5
32
0.9
2
394
0.95
0.04
0.6
34

135
15.7
1.4
5.0
80.6
1.2
1.8
96
81
7.9
0.06
0.05
0.8
-

363
9.1
1.1
0.5
32.8
2.2
21
84
37
1.0
11
9.6
0.02
0.03

0.6
-

354
12.0
0.5
0.3
86.9
0.5
-

(Nguồn: Cao Văn Hùng, 2001).

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang 5


2.2 Giới thiệu chung về hệ enzyme amylase
Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi
nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực quốc dân khác. Các enzyme
amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy
mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Bây giờ, người ta thu chúng chủ
yếu từ canh trường vi khuẩn, nấm sợi và một vài nấm men. Amylase là hệ
enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme
thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết nội phân tử trong polysaccharide
đồng với sự tham gia của nước.
R.R.’ + H – OH
RH + R’OH
Hiện nay người ta đã biết có sáu loại amylase được xếp thành hai nhóm:

endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào).
Endoamylase: gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm
enzym khử nhánh được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay αdextrin 6-glucanohydrolase), khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết
bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase: gồm β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy
phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
Các dạng amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH, nhiệt
độ, mức độ polymer hóa của cơ chất. Các enzyme amylase từ các nguồn khác
nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy
phân khác nhau. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
 Hoạt động của amylase:
α-amylase
Tinh bột

Dextrin + oligosacchride
Pullulanase
Dextrin không nhánh
β-amylase
Maltose

Dextrin
Amyloglucosidase
Glucose

6


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 5: Vị trí phân cắt mạch của amylase.
(Nguồn: />
2.2.1 α-amylase (α-1,4 glucan-4-glucanhydrolase, 3.2.1.1)

 Đặc tính
Là một metaloenzyme trong phân tử có ít nhất một phân tử Ca2+ có tác dụng làm
bền cấu trúc bậc 2, 3 của phân tử enzyme.
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau: mỗi
loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu, song chúng đều khá giàu
tyrosine và tryptophan nhưng ít methionin.
α-amylase được hoạt hóa bởi ion đơn hóa trị nếu chúng có nguồn gốc động
vật và vi sinh vật. Nếu có nguồn gốc động vật thì được hoạt hóa bởi ion hóa trị II.
Hoạt hóa bởi ion hóa trị I như sau: Cl- > Br - > I -. Chúng bị kìm hãm bởi ion kim
loại nặng như Cu2+, Hg2+,… α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng
khá bền nhiệt (bền nhất trong hệ enzyme amylase).
 Cơ chế tác dụng lên mạch amylase và amylopectin
α-amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 glucozit nằm ở phía bên trong
phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen, polyose đồng loại) một cách ngẫu nhiên
không theo một trật tự nào cả. Vì thế người ta gọi nó là enzyme amylase nội phân
(endoamylase).
α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà thủy phân cả hạt tinh bột
nguyên lành, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của enzyme α-amylase,
amylase bị phân giải khá nhanh olygosaccharide gồm 6 ÷ 7 gốc glucose. Sau đó
các polyglucose này lại bị phân cắt dần và bị phân giải chậm đến mạch
maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm
thủy phân của amylase chứa 87% maltose và 13% glucose. Dưới tác dụng của
enzyme α-amylase amylopectin cũng bị phân giải khá nhanh, nhưng vì α-amylase
không phân cắt được liên kết α-1,6 glucozit nên dù có kéo dì thời gian thủy phân

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang 7


nhưng sau cùng sản phẩm có khoảng: 72% maltose, 19% glucose còn có dextrin
phân tử thấp và izomaltose là 8%. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.2.2 β-amylase (α-1,4 glucan-mantohidrolase, 3.2.1.2)

 Đặc tính
β-amylase là một loại albumin, tâm xúc tác của nó có chứa các nhóm –SH và
nhóm –COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin. β-amylase chỉ phổ
biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm. Trong vi khuẩn
không có β-amylase. Còn sự tồn tại β-amylase trong nấm sợi cho đến nay vẫn
chưa được chứng minh.
β-amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng
như: Cu2+, Hg2+, urea, idoacetamide, iodine, ozon…pH tối thích trong dung dịch
tinh bột thuần khiết là 4,6 còn trong dung dịch nấu là 5,6. Nhiệt độ tối thích trong
tinh bột thuần khiết là 40 ÷ 50 oC, trong dung dịch nấu là 60 ÷ 65 oC, β-amylase bị
vô hoạt ở 70oC.
 Cơ chế tác dụng lên mạch tinh bột
β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucozit trong tinh bột,
glycogen, polysaccharide đồng loạt, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ
đầu không khử của mạch. Maltose có cấu hình β được tạo thành β-amylase được
gọi là enzyme ngoại phân (exoamylase).
β-amylase phân giải 100% amylase thành maltose và phân giải 54 ÷ 58%
amylopectin thành maltose. Do mỗi nhánh của amylopectin có từ 20 ÷ 26 gốc
glucose nên sau khi thủy phân tạo thành 10 ÷ 12 phân tử maltose. Khi gặp liên
kết α-1,4 glucozit đứng kế cận liên kết α-1,6glucozit thì β-amylase ngừng tác
dụng, phần saccharide còn lại là dextrin có màu tím đỏ với iodine. Độ nhớt dung

dịch giảm. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
β-amylase
Tinh bột

54 ÷ 58 % maltose + 42 ÷ 46% β- dextrin.

(Glucogen )
2.2.3 γ-amylase (α-1,4 glucan-glucohydrolase, 3.2.1.3)

 Đặc tính
So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng
củ rượu etylic, aceton, không bền với ion kim loại nặng như: Cu 2+, Hg2+,…có
trong nấm mốc và một vài vi khuẩn. Hoạt động tốt ở nhiệt độ 50oC hoạt lực tối
đa trong vùng pH = 3,5 ÷ 5.

8


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

 Cơ chế tác dụng lên amylase và amylopectin
Enzym γ-amylase có khả năng xúc tác cả liên kết α-1,4 glucozit, α-1,6 glucozit
trong tinh bột, glycogen,polysaccharide đồng loại, cả maltose và các
oligosaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một. Chúng không
thủy phân được các dextrin vòng. Khi thủy phân tinh bột cùng với việc tạo thành
glucose còn có thể tạo thành olygosaccharde. Ngoài ra, γ-amylase còn có thể
phân cắt các liên kết α-1,2; 1,3 glucozit nữa. (Nguyễn Công Hà, 2000).
2.3 Cơ chất của amylase

2.3.1 Tinh bột

Tinh bột là nhóm cacbohydrate, ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ như
khoai lang, khoai tây, khoai mì…Trong các loại ngũ cốc, các hạt có công thức
tổng quát là (C6H12O6)n. Tinh bột từ nguồn khác nhau đều cấu tạo từ amylose và
amylopectin. Các loại tinh bột giống nhau về thành phần nhưng tỉ lệ amylose và
amylopectin khác nhau. Tuy có sự khác biệt nhau như vậy, nhưng đa phần đều
chứa khoảng 20 ÷ 30% amylose và 70 ÷ 80% amylopectin. Trong thực vật, tinh
bột được xem như là chất dự trữ năng lượng quan trọng.
Amylose được cấu tạo từ những gốc glucose và liên kết với nhau bởi nối 1,4
–glucoside nên tạo thành mạch thẳng. Số gốc glucose trong phân tử amylose có
thể tạo thành 200 ÷ 1000 và tương ứng với phân tử lượng là 34200 ÷ 162000.
Amylose dễ tan trong nước nóng và tạo nên độ nhớt của dung dịch.
Amylopectin cấu tạo từ những gốc glucose nhưng ngoài các nối α – 1,4 –
glucoside thì trong phân tử amylopectin còn nối với nhau bởi các α- 1,6
glucoside thường rất ít so với α – 1,4 – glucoside nhưng rất bền. Mạch chính của
amylopectin có khoảng 400 ÷ 2000 gốc glucose, các mạch nhánh bao gồm 15 ÷
18 gốc và cách đều 8 ÷ 9 gốc. Tùy theo loại nguyên liệu số gốc glucose trong
phân tử amylopectin có thể từ 600 ÷ 6000, tương đương với phân tử lượng 96120
÷ 961200. Tinh bột là chất keo háo nước điển hình nhưng không hòa tan trong
nước lạnh, trong rượu và este. Trong nước nóng tinh bột sẽ hút nước và trương
nở và tạo gel. Mức độ trương nở tùy thuộc vào nhiệt độ. Khi tăng nhiệt độ lên
đến (60 ÷ 85 0C) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột dạng gel.
Dưới tác dụng của enzyme amylase tinh bột bị thủy phân do các liên kết
glycoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo hai
mức độ: dịch hóa và đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo sản phẩm trung
gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm sẽ là maltose và
glucose.

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang 9


2.3.2 Glycogen

Glycogen là một loại carbohydrate được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ
thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển
hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật liên kết lại với nhau bởi liên kết α -1,4 –
glycoside ở các vị trí phân nhánh glucose nối với nhau bằng liên kết α -1,6 –
glycoside. Glycogen có số mạch nhánh nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở vào
khoảng 2 ÷ 3 triệu. Glycogen dễ tan trong nước. Glycogen được cấu tạo từ các
glucose.
2.4 Cơ chế tác động của enzyme
Bản chất của cơ chế tác dụng bởi enzyme trong các phản ứng hóa học là khả
năng hoạt hóa cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn.
Khi có enzyme tham gia xúc tác, thì năng lượng cần cho phản ứng nhỏ hơn khi
không có enzyme. Quá trình xúc tác xảy ra qua ba giai đoạn:
E + S  ES  P + E
Trong đó: E: enzyme; S: cơ chất; P: sản phẩm.
 Ở giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu. Kết
quả là tạo thành một phức hợp ES, phức hợp này không bền. Phản ứng này xảy ra
rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng.
 Ở giai đoạn thứ hai: cơ chất bị biến đổi, dẫn đến làm căng và phá vỡ các liên
kết đồng hóa trị.
 Ở giao đoạn thứ ba: sản phẩm được tạo thành, enzyme được giải phóng và trở
lại trạng thái tự do. Liên kết giữa E và S để tạo thành phức hợp ES và liên kết
hidro, tương tác tĩnh điện, tương tác van der waals. (Nguyễn Đức Lượng, 2001).

10

Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme
2.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng.
(Nguồn: />
Cơ chế tác động của enzyme vào cơ chất qua ba giai đoạn:
 Giai đoạn đầu: Enzyme sẽ tương tác với cơ chất để tạo thành phức hợp ES.
 Giai đoạn 2: Phức hợp ES sẽ được tách ra.
 Giai đoạn 3: E sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng trên được
xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Ở trường hợp này sẽ
xảy ra ba giai đoạn khác biệt.
 Ở giai đoạn đầu nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng (V) phụ thuộc
tuyến tính với nồng độ cơ chất.
 Ở giai đoạn kế tiếp tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc
vào nồng độ cơ chất.
 Ở giai đoạn tiếp theo, nếu nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại của tốc
độ phản ứng không có khả năng tăng theo. Ở giai đoạn này, các enzyme đã bão
hòa cơ chất do đó nó không có tốc độ phản ứng cao hơn được.
(Nguyễn Đức Lượng, 2001).
2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bản chất của enzym là protein. Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu
trúc của chúng. Trong các phản ứng hóa học, nhiệt độ càng tăng tốc độ phản ứng
xúc tác càng tăng. Trong các phản ứng sinh học, nhiệt độ tăng khả năng xúc tác

enzyme sẽ tăng. Nhưng khả năng tăng của tốc độ phản ứng có giới hạn nhất định.
Quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh.
Trường hợp ta tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm
tăng khả năng tạo cấu trúc không gian của enzyme cho phù hợp với cấu trúc
không gian của cơ chất. Khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang 11


của trung tâm hoạt động trong enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không
gian của cơ chất nữa. Khi đó hoạt tính của enzyme sẽ mất dần và đi đến triệt tiêu.
Vì vậy, trong kỹ thuật người ta thường dùng nhiệt như biện pháp làm tăng khả
năng hoạt động của enzyme. Biện pháp này rất có ý nghĩa cả trong bảo quản và
trong chế biến thực phẩm. (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
2.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Hình 7: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng
/>
Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản
ứng. Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc rất nhiều vào
khả năng điều hòa gen. Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với
lượng enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
Tốc độ phản ứng V = K . [E]
Trong đó: V: tốc độ phản ứng.
[E]: Nồng độ enzyme
2.5.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme

pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến

độ bền của protein. Do đó tốc độ của phản ứng enzyme sẽ tăng dần đến giá trị
cực đại và sau đó sẽ giảm dần. Đa số enzyme bền ở pH 5÷ 9. Độ bền của enzyme
sẽ tăng nếu có mặt của cơ chất và coenzyme hoặc Ca2+v.v…
(Nguyễn Đức Lượng, 2001).
2.5.5 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Các chất kìm hãm thường là các ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ và cả protein.
Các chất kìm hãm thường tham gia vào quá trình kiểm tra, điều hòa quá trình trao
đổi chất trong cơ thể sống. Các chất kìm hãm được chia làm hai nhóm: nhóm các
chất kìm hãm cạnh tranh và nhóm các chất kìm hãm không cạnh tranh.

12


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

 Nhóm các chất kìm hãm cạnh tranh
Các chất kìm hãm cạnh tranh thường có cấu trúc không gian tương tự như cấu
trúc không gian của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm
hoạt động của enzyme. Kết quả là một số chỗ kết hợp cần thiết ở enzyme bị chất
kìm hãm chiếm mất. Do đó cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho
tốc độ phản ứng không tăng. Phản ứng cạnh tranh có thể biểu thị như sau:
E + I → EI
E + S → ES → E + P
 Nhóm các chất kìm hãm không cạnh tranh
Các chất kìm hãm không cạnh tranh tham gia kết hợp với enzyme không phải
ở tung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí không phải trung tâm hoạt
động của enzyme. Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử

enzyme. Như vậy phức hợp EI này sẽ làm thay đổi theo hướng không có lợi cho
hoạt động xúc tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành
phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành phức hợp
EI như phản ứng sau.
E + S = ES → E + P
(Nguyễn Đức Lượng, 2001)
2.5.6 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Các chất hoạt hóa (activator) là những chất làm tăng khả năng xúc tác của
enzyme. Các chất hoạt hóa có thể là các anion, các ion kim loại ở ô thứ 11 đến ô
thứ 55 trong bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp
làm nhiệm vụ chuyển hydro, các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong
phân tử tiền enzyme, các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm
hoạt động của enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
2.6 Vi sinh vật trong bánh men thuốc bắc
2.6.1 Vi khuẩn

Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loài vi khuẩn phát triển. Trong đó thường
thấy có mặt của vi khuẩn lactic, vi khuẩn axetic. Các loài vi khuẩn thường làm
chua môi trường của thời gian đầu quá trình lên men, quá trình này xảy ra có lợi
vì tạo pH môi trường thích hợp cho nấm men và nấm sợi phát triển. Tuy nhiên,
nếu để pH xuống quá thấp sẽ ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men. Mặt khác
nếu trong dịch lên men có mặt oxy và vi khuẩn axetic sẽ oxy hóa rượu thành axit
axetic, quá trình này làm tổn hao lượng cồn tạo thành.
(Nguyễn Đức Lượng, 2002).

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang 13

2.6.2 Nấm men

Là nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, thường sinh sản bằng cách nẩy chồi và phân
cắt. Nấm men thuộc về hai lớp nấm: nấm túi (Ascomycetes) và nấm bất hoàn toàn
(Deutero-mecetes or Fungiimperfer)
Trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men.
Chúng gồm hai chi khác nhau: Endomycopsis (chủ yếu là Endo. Fibuligenes),
Saccharomyces (chủ yếu là S.cerevisiae).
Endo Fibuligenes: là loài nấm men rất giàu enzyne amilase, glucoamilaza, do đó
chúng vừa có khả năng đường hoá vừa có khả năng rượu hoá.

Hình 8: Nấm men Sacchoromyces cerevisiae
(Nguồn: />
Saccharomyces cerevisiae: có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau
như: glucoza, sacroza, maltoza, fructoza, rafinoza, galactoza. Chúng có khả năng
lên men ở nhiệt độ cao (36 ÷ 40oC), chúng có khả năng chịu được độ axit. Đặc
biệt chúng có khả năng chịu được thuốc sát trùng. Đặc biệt chúng có khả năng
chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,02 ÷ 0,025%. Đặc điểm này rất
thuận lợi cho lên men khi cần sử dụng thuốc sát trùng. Đặc điểm quan trọng hơn
hết đó là có khả năng lên nhiều loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai,
sắn, với lượng đường trong dung dịch từ 12 ÷ 14% có khi 16 ÷ 18%. Nồng độ
rượu trong dung dịch lên men 10 ÷ 12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 ÷
32oC.
Ngoài hai chi nấm men trên, trong bánh men thuốc bắc còn thấy nhiều loại nấm
men dại khác, chúng vừa khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển
hóa đường thành rượu, tuy sự chuyển hóa này thấp. Điều đặc biệt là các loài nấm
men dại này chịu nhiệt rất cao, có khi tới 60 ÷ 65oC và chịu được chất sát trùng
nồng độ 0,05 ÷ 1%. ( Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.6.3 Nấm mốc

Nấm mốc là loại thực vật không có diệp lục, nên chúng chỉ sống được nhờ có sợi
hệ bám vào các chất hữu cơ. Hệ sợi nấm mốc có một số ăn sâu vào cơ chất gọi là
khuẩn ti cơ chất hay khuẩn ti dinh dưỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi

14


Luận văn tốt nghiệp khoá 36LT – 2012

Trường Đại học Cần Thơ

là khuẩn ti khí sinh. Những khuẩn ti khí sinh là những lông tơ màu trắng, mọc
thành một lớp sợi mềm và dần dần sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh
sản đặc biệt mang bào tử. Màu sắc của bào tử sẽ đặc trưng cho nấm mốc khi già.
( Lương Đức Phẩm, 2005).

Hình 9: Nấm mốc Aspergillus
(Nguồn: http: www.tintuccaonien.com/docs/docs/)

Trong bánh men thuốc bắc thấy nhiều loài nấm mốc phát triển thuộc họ
Aspergillus, Mucor, Penicillium, Rhizopus và amylomyces rouxii phát triển nhiều
hơn cả.
Loài Mucor đặc biệt là Mucor rouxii có nhiều đặc tính rất quý như khả năng chịu
được nhiệt độ cao 32 ÷ 35oC, chúng vừa có khả năng đường hóa vùa có khả năng
rượu hóa. ( Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.7 Quá trình lên men rượu
Lên men rượu là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme
tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì
sự sống của nấm men). Tuỳ theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men người ta

chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên có 2 hình thức lên men chính:
lên men yếm khí và lên men hiếu khí.
 Lên men yếm khí: là sự phân huỷ đường không có sự hiện diện của O2 như
quá trình lên men lactic, lên men rượu, butylic…
 Lên men hiếu khí: là sự phân huỷ đường có sự hiện diện của O2 như quá trình
lên men acid acetic, citric…
 Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men. Nấm
men chuyển hoá đường lên men thành rượu etylic và CO2. Người ta còn gọi là
quá trình rượu hoá, cồn hoá.
 Trong quá trình lên men rượu người ta chia làm hai thời kỳ chính:

Ngành Công nghệ thực phẩm – khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Trang 15