Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính cây Ngón hoa trắng (Nhài bắc) và cây Trúc đào ở Việt Nam phục vụ cho giám định hóa pháp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

1

BỘ QUỐC PHÕNG

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUÂN SỰ
---------------------------------------

LÊ ANH HÀO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
ĐỘC TÍNH CÂY NGÓN HOA TRẮNG (NHÀI BẮC)
VÀ CÂY TRÚC ĐÀO Ở VIỆT NAM
PHỤC VỤ CHO GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

2

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUÂN SỰ
---------------------------------------

LÊ ANH HÀO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
ĐỘC TÍNH CÂY NGÓN HOA TRẮNG (NHÀI BẮC)
VÀ CÂY TRÚC ĐÀO Ở VIỆT NAM
PHỤC VỤ CHO GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ
Mã số: 62 44 01 14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS. NGUYỄN TIẾN VỮNG
2. TS. ĐÀO CÔNG MINH

Hà Nội, 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.
Ngƣời cam đoan

Lê Anh Hào


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới:

PGS.TS. Nguyễn Tiến Vững
TS. Đào Công Minh
những ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Thủ trƣởng, phòng Đào tạo, Viện Hóa học - Vật liệu
- Viện Khoa học và Công nghệ quân sự - Bộ Quốc phòng, đã tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của GS.TS. Nguyễn Việt Bắc,
Viện Hóa học - Vật liệu, đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu và hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo, các đồng nghiệp Khoa Hóa pháp Viện Pháp y Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên để tôi hoàn thành bản
luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ƣơng, Viện Hóa sinh biển, Viện Hóa học - Vật liệu, Viện Hóa
học các hợp chất thiên nhiên, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Bảo tàng thiên
nhiên Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Một lần nữa, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tất cả sự giúp đỡ quí
báu trên.
Hà Nội, 9/2015

LÊ ANH HÀO


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU

1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN

3

1.1. SƠ LƢỢC VỀ GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP

3

1.1.1. Tình hình giám định hóa pháp trên thế giới

4

1.1.2. Tình hình giám định hóa pháp tại Việt Nam

4

1.2. VỀ VIỆC LỰA CHỌN ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

5

1.3. CÂY NGÓN HOA TRẮNG (NHÀI BẮC)

6

1.3.1. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học chi Jasminum

6

1.3.2. Đặc điểm thực vật cây ngón hoa trắng (Nhài bắc)

9

1.3.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học cây ngón hoa trắng (Nhài bắc)

10

1.4. CÂY TRÖC ĐÀO

10

1.4.1. Đặc điểm thực vật

10

1.4.2. Công dụng của cây trúc đào

11

1.4.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học

11

1.4.4. Độc tính của cây trúc đào

24

1.4.5. Các thuốc thử, định tính và định lƣợng glycosid

25

Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, THỰC NGHIỆM
2.1. NGUYÊN LIỆU

30

2.2. HÓA CHẤT, THUỐC THỬ

30

2.2.1. Hệ dung môi chạy bản mỏng, thuốc thử và pha động chạy sắc ký lỏng
hiệu năng cao
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, THỰC NGHIỆM
2.3.1. Nghiên cứu về thực vật

30
30
31
31


2.3.2. Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc

36

2.3.3. Định lƣợng glycosid tim trong lá trúc đào bằng phƣơng pháp cân

42

2.3.4. Thử độc tính cấp

43

2.3.5. Ứng dụng trong giám định hóa pháp

45

Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT

47

3.1.1. Định danh mẫu vật

47

3.1.2. Cây ngón hoa trắng (Nhài bắc)

47

3.1.3. Đặc điểm thực vật cây trúc đào

56

3.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐÃ SỬ DỤNG

58

3.2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế

58

3.2.2. Các phƣơng phƣơng pháp nhận dạng

60

3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY NGÓN
HOA TRẮNG (NHÀI BẮC)
3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY TRÖC ĐÀO

60
67

3.5. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ HOA CÂY
TRÖC ĐÀO

113

3.6. NHẬN XÉT VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

123

3.7. ĐỊNH LƢỢNG GLYCOSID TIM TRONG LÁ TRÖC ĐÀO

129

3.8. THỬ ĐỘC TÍNH CẤP

130

3.8.1. Thử độc tính cấp mẫu lá trúc đào

130

3.8.2. Thử độc tính cấp mẫu ngón hoa trắng (Nhài bắc)

133

3.9. ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP
3.9.1. Ứng dụng giám định hóa pháp bằng phƣơng pháp Sắc ký lớp mỏng

136
136

3.9.2. Ứng dụng giám định hóa pháp bằng phƣơng pháp Sắc ký lỏng hiệu năng
cao

138

KẾT LUẬN

145

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ

147

TÀI LIỆU THAM KHẢO


i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A

Liều gây chết

a

% động vật thí nghiệm chết sát dƣới 50%

b

% động vật thí nghiệm chết sát trên 50%

br s

Singlet tù

13

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon C13, (MHz,

C NMR(125 MHz,

CHCl3)δC

dung môi đo)

CC

Sắc kí cột (Columm chromatography)

CHCl3

Chloroform

δ (ppm)

Độ dịch chuyển hóa học tính bằng ppm

d

doublet

D

Khoảng cách giữa các liều

dd

doublet của doublet

dq

doublet của quartet

dt

doublet của triplet

DMSO

Dimethylsulfoxit

đ.n.c

Điểm nóng chảy

ĐVTN

Động vật thí nghiệm

EI-MS (70eV)

Phổ khối va chạm electron ở 70eV, (Electron ImpactMass Spectroscopy)

ESI - MS

Phổ khối bụi electron, (Electron Spray Ionisation Mass Spectroscopy)

EtOAc

Ethyl Acetat

h.c

Hợp chất

1

Phổ tƣơng tác proton, (1H -

H 1H COSY

1

H - Correlation

Spectroscopy)
1

H NMR(500 MHz,

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton,(MHz, dung môi

CHCl3)δH

đo)

h.l

Hàm lƣợng


ii

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

J(Hz)

Hằng số tƣơng tác tính bằng Hz

k

Hệ số Behrens

LD50

Liều gây chết 50% số con vật thử (Lethal Dose)

LOD

Limit of detection

m

multiplet

MeOH

Methanol

NOESY

Phổ tƣơng tác qua không gian (hiệu ứng Overhaus
hạt nhân), (Nuclear Overhaus Effect Spectroscopy)

pđ

Phân đoạn

q

quartet

s

Singlet

S

Phân phối chuẩn (standard distribution)

SELD50

Sai số chuẩn của LD50 (standard error of LD50)

SKC

Sắc ký cột

SKLMĐC

Sắc kí lớp mỏng điểu chế

SKLM

Sắc kí lớp mỏng

t

triplet

td

triplet của doublet

TMS

Tetramethylsilan

X

Hàm lƣợng phần trăm của glycosid

𝑥

Khối lƣợng cặn

𝑦

Khối lƣợng nguyên liệu (g)

z

Độ ẩm mẫu thử


iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1:

Các hợp chất đặc trƣng của chi Jasminum

Bảng 3.1:

Bảng so sánh sự giống và khác nhau giữa ngón hoa trắng (Nhài

7

bắc) với ngón hoa vàng

48

Bảng 3.2:

Danh sách 12 mẫu lấy trên GenBank đƣợc dùng để so sánh

55

Bảng 3.3:

Danh sách 6 mẫu lấy trên GenBank đƣợc dùng để so sánh

55

Bảng 3.4:

Dữ liệu phổ 1H NMR(500 MHz, CHCl3)δH và 13C NMR(125

64

MHz, CHCl3)δC của chất HC2
Bảng 3.5:

Dữ liệu phổ 1H NMR (500 MHz, CHCl3)δH và 13C NMR (125

66

MHz, CHCl3)δC của chất HC3
Bảng 3.6:

Số liệu phổ NMR của hợp chất NO13 và chất so sánh

70

Bảng 3.7:

Số liệu phổ NMR của hợp chất NO14 và chất so sánh

72

Bảng 3.8:

Số liệu phổ NMR của hợp chất NO15

78

Bảng 3.9:

Số liệu phổ NMR của chất NO16 và chất so sánh

81

Bảng 3.10:

Số liệu phổ NMR của hợp chất NO17 và chất so sánh

89

Bảng 3.11:

Số liệu phổ NMR của hợp chất NO18

93

Bảng 3.12:

Số liệu phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO1
và chất so sánh

Bảng 3.13:

95

Số liệu phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO2
và chất so sánh

98

Bảng 3.14:

Số liệu phổ NMR của hợp chất NO3 và chất so sánh

101

Bảng 3.15:

Số liệu phổ NMR của hợp chất NO8 và chất so sánh

107

Bảng 3.16:

Số liệu phổ NMR của hợp chất NO10 và chất so sánh

111

Bảng 3.17:

Các hợp chất phân lập đƣợc từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc)

123

Bảng 3.18:

Các hợp chất phân lập đƣợc từ lá, hoa cây trúc đào

125

Bảng 3.19:

Bảng kết quả định lƣợng glycosid tim trong lá trúc đào khô

129

Bảng 3.20:

Thể tích đƣa mẫu thử và mức liều thử nghiệm trên chuột

130

Bảng 3.21:

Kết quả thử nghiệm cao trúc đào

131

Bảng 3.22:

Thể tích đƣa mẫu thử và mức liều thử nghiệm trên chuột

134

Bảng 3.23

Kết quả thử nghiệm cao ngón hoa trắng (Nhài bắc)

134


iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1:

Ảnh cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) chụp tại Cao Bằng

9

Hình 1.2:

Ảnh cành mang hoa trúc đào chụp tại Hà Nội

11

Hình 2.1:

Sơ đồ qui trình chiết mẫu lá cây ngón hoa trắng

37

Hình 2.2:

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây ngón hoa trắng

38

Hình 2.3:

Sơ đồ qui trình chiết mẫu lá cây trúc đào

39

Hình 2.4:

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết bằng CHCl3 chiết lá
trúc đào

Hình 2.5:

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn dịch chiết EtOAc chiết lá
trúc đào

Hình 2.6:

40
41

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn dịch chiết EtOAc chiết hoa
trúc đào

42

Hình 3.1:

Hình ảnh vi phẫu gân lá ngón hoa trắng (Nhài bắc)

49

Hình 3.2:

Hình ảnh vi phẫu phiến lá ngón hoa trắng (Nhài bắc)

50

Hình 3.3:

Hình ảnh vi phẫu cành lá ngón hoa trắng (Nhài bắc)

51

Hình 3.4:

Hình ảnh vi phẫu gân lá ngón hoa vàng

52

Hình 3.5:

Hình ảnh vi phẫu phiến lá ngón hoa vàng

52

Hình 3.6:

Hình ảnh vi phẫu cành lá cây ngón hoa vàng

54

Hình 3.7:

Hình ảnh vi phẫu của lá trúc đào

59

Hình 3.8:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HC1

61

Hình 3.9:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HC1

61

Hình 3.10:

Cấu trúc của hợp chất HC1

62

Hình 3.11:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HC2

62

13

Hình 3.12:

Phổ C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HC2

63

Hình 3.13:

Phổ DEPT của hợp chất HC2

63

Hình 3.14:

Cấu trúc dóa học của hợp chất β-sitosterol (HC2)

65

Hình 3.15:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HC3

66

Hình 3.16:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HC3

67

Hình 3.17:

Cấu trúc của hợp chất tyrosol (HC3)

67


v

Hình 3.18:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO13

68

Hình 3.19:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO13

69

Hình 3.20:

Phổ DEPT của hợp chất NO13

69

Hình 3.21:

Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO13

70

Hình 3.22:

Cấu trúc hóa học của hợp chất neriasid (NO13)

71

Hình 3.23:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO14

74

Hình 3.24:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO14

74

Hình 3.25:

Phổ DEPT của hợp chất NO14

75

Hình 3.26:

Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO14

75

Hình 3.27:

Cấu trúc hóa học của hợp chất adynerigenin 3-O--Ddiginosid (NO14)

76

Hình 3.28:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO15

77

Hình 3.29:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO15

77

Hình 3.30:

Phổ DEPT của hợp chất NO15

78

Hình 3.31:

Cấu trúc hóa học của hợp chất NO15

79

Hình 3.32:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO16

81

Hình 3.33:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO16

83

Hình 3.34:

Phổ DEPT của hợp chất NO16

83

Hình 3.35:

Phổ NOESY của chất NO16

84

Hình 3.36:

Phổ HSQC của hợp chất NO16

84

Hình 3.37:

Phổ HMBC của hợp chất NO16

85

Hình 3.38:

Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO16

85

Hình 3.39:

Cấu trúc hóa học và một số tƣơng tác HMBC của hợp chất
oleandrin (NO16)

86

Hình 3.40:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO17

87

Hình 3.41:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO17

88

Hình 3.42:

Phổ DEPT của hợp chất NO17

88

Hình 3.43:

Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO17

89

Hình 3.44:

Cấu trúc hóa học của hợp chất gitoxigenin-3-O--Loleandrosid (NO17)

90


vi

Hình 3.45:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO18

91

Hình 3.46:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO18

92

Hình 3.47:

Phổ DEPT của hợp chất NO18

92

Hình 3.48:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 16- adynerigenin 3-O--Ddiginosid (NO18)

94

Hình 3.49:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO1

96

Hình 3.50:

Phổ 1C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO1

96

Hình 3.51:

Phổ DEPT của hợp chất NO1

97

Hình 3.52:

Cấu trúc hóa học của hợp chất acid oleanolic (NO1)

97

Hình 3.53:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO2

99

Hình 3.54:

Phổ 1C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO2

99

Hình 3.55:

Phổ DEPT của hợp chất NO2

100

Hình 3.56:

Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO2

100

Hình 3.57:

Cấu trúc hóa học của hợp chất acid betulinic (NO2)

100

Hình 3.58:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO3

102

Hình 3.59:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO3

102

Hình 3.60:

Phổ DEPT của hợp chất NO3

103

Hình 3.61:

Cấu trúc hóa học của hợp chất betulin (NO3)

103

Hình 3.62:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO8

104

Hình 3.63:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất NO8

104

Hình 3.64:

Phổ DEPT của hợp chất NO8

105

Hình 3.65:

Phổ HSQC của hợp chất NO8

105

Hình 3.66:

Phổ HMBC của hợp chất NO8

106

Hình 3.67:

Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO8

106

Hình 3.68:

Cấu trúc hóa học của hợp chất acid 27-hydroxy-3βhydroxyurs-12-en-28-oic (NO8)

Hình 3.69:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH giãn rộng của hợp chất
NO10

Hình 3.70:

108
109

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC giãn rộng của hợp chất
NO10

109


vii

Hình 3.71:

Phổ DEPT của hợp chất NO10

110

Hình 3.72:

Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất NO10

110

Hình 3.73:

Cấu trúc hóa học của hợp chất pinoresinol (NO10)

111

Hình 3.74:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất NO12

112

Hình 3.75:

Cấu trúc hóa học của hợp chất syringaresinol (NO12)

112

Hình 3.76:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HF 2A

114

Hình 3.77:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HF 2A

114

Hình 3.78:

Phổ DEPT của hợp chất HF 2A

115

Hình 3.79:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 16-dehydroadynerigenin

115

Hình 3.80:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HF 2.1

116

Hình 3.81:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HF 2.1

117

Hình 3.82:

Phổ DEPT của hợp chất HF 2.1

117

Hình 3.83:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 16-digitoxigenin

118

Hình 3.84:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HF 5A

119

Hình 3.85:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HF 5A

119

Hình 3.86:

Phổ khối hợp chất HF 5A

120

Hình 3.87:

Cấu trúc hóa học của hợp chất quercetin

120

Hình 3.88:

Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HF 5.2.1

121

Hình 3.89:

Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HF 5.2.1

122

Hình 3.90:

Cấu trúc hóa học của hợp chất kaempferol

122

Hình 3.91:

Đồ thị theo các số liệu trên bảng 3.19

132

Hình 3.92:

Đồ thị theo các số liệu trên bảng 3.21

134

Hình 3.93:

Sắc kí lớp mỏng của oleandrin và mẫu phân tích PT01, PT02
soi dƣới đèn tử ngoại

Hình 3.94:

137

Sắc kí lớp mỏng của oleandrin và mẫu phân tích PT01, PT02
phun thuốc thử Kedde

138

Hình 3.95:

Sắc kí đồ của oleandrin

139

Hình 3.96:

Sắc kí đồ của mẫu PT01

140

Hình 3.97:

Sắc kí đồ của mẫu PT01 đã thêm oleandrin

140

viii

Hình 3.98:

Sắc ký đồ của mẫu PT01, mẫu PT01 đã thêm oleandrin và
mẫu đối chiếu oleandrin

141

Hình 3.99:

Sắc kí đồ của mẫu PT02

141

Hình 3.100:

Sắc kí đồ của mẫu PT01 đã thêm oleandrin

142

Hình 3.101:

Sắc ký đồ của mẫu PT02, mẫu PT01 đã thêm oleandrin và
mẫu đối chiếu oleandrin

142

1

MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm ở khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có thảm thực vật rất
phong phú và đa dạng. Nƣớc ta ƣớc tính có đến 12.000 loài thực vật, trong đó có
khoảng gần 4.000 loài đƣợc dùng làm thuốc thuộc khoảng 300 họ, đại đa số là cây
mọc tự nhiên và một số đƣợc nhập về trồng, hầu hết chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ
về thành phần hóa học và tác dụng sinh học [1]. Từ thực vật, nguồn tài nguyên thiên
nhiên quan trọng, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều hợp chất thiên nhiên có cấu trúc
đa dạng và có hoạt tính sinh học phong phú, đóng vai trò quan trọng trong đời sống
con ngƣời. Chúng đƣợc dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật . .
. Ngày nay các loại thảo dƣợc vẫn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc sản
xuất dƣợc phẩm nhƣ là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp chất
dẫn đƣờng cho việc tìm kiếm các loại thuốc mới, có hoạt tính cao, chữa đƣợc nhiều
bệnh, kể cả các bệnh hiểm nghèo [4], trong đó nhiều cây độc hiện đã và đang đƣợc
ứng dụng vào làm thuốc (nhƣ Cà độc dƣợc, Mã tiền, Ô đầu, Trúc đào,...). Khi dùng
đúng cách, đúng liều lƣợng thì các cây độc có tác dụng chữa bệnh, nhƣng nếu
không dùng đúng thì chúng lại có thể gây ngộ độc.
Hàng năm qua khảo sát, nƣớc ta có nhiều vụ ngộ độc do sử dụng nhầm lẫn,
đầu độc, tự sát có nguồn gốc từ cây ngón [11], cây trúc đào. Theo thống kê của
trung tâm Y tế huyện Điện Biên Đông, một huyện có đa phần là ngƣời H’Mông
sinh sống, trong năm 2012, trên địa bàn xảy ra khoảng 80 vụ ngộ độc liên quan đến
cây ngón và khoảng gần 70 ngƣời chết trong đó đa số là ngƣời trẻ tuổi.
Mặt khác trong giám định hóa pháp, chất chuẩn và chất đối chiếu là vô cùng
quan trọng. Nó phục vụ quy trình giám định Hóa pháp, cấp cứu bệnh nhân ngộ độc
một cách chính xác và nhanh chóng. Đặc biệt từ năm 2013, khi luật giám định tƣ
pháp đi vào cuộc sống thì việc giám định cần phải có độ chính xác cao. Chính vì
vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính của các cây độc có ý nghĩa đặc
biệt quan trọng, nó giúp cho công tác giám định hoá pháp và phục vụ công tác cứu
chữa nạn nhân ngộ độc một cách kịp thời, nhanh chóng.

2

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài luận án “Nghiên cứu
thành phần hóa học, độc tính cây Ngón hoa trắng (Nhài bắc) và cây Trúc đào ở
Việt Nam phục vụ cho giám định hóa pháp”
 Mục tiêu nghiên cứu:
Bƣớc đầu hoàn thiện hồ sơ thực vật về cây ngón hoa trắng (Nhài bắc).
Đi sâu nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính cấp, hàm lƣợng glycosid
trong lá cây trúc đào.
Ứng dụng oleandrin trong phân tích, giám định hóa pháp.
 Đối tượng nghiên cứu của luận án:
Cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và cây trúc đào.
 Các nội dung chính luận án cần giải quyết:
Xác định tên khoa học, đặc điểm thực vật, phân bố, vi phẫu, giám định
DNA của cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và trúc đào.
Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất
từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và lá, hoa cây trúc đào.
Định lƣợng glycosid tim trong lá cây trúc đào.
Thử độc tính cấp cao chiết từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và cao chiết
lá cây trúc đào.
Ứng dụng oleandrin làm chất đối chiếu trong giám định Hóa pháp.
 Những đóng góp mới của luận án:
Xây dựng bộ hồ sơ thực vật về cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) gồm: tên
khoa học, phân bố, mô tả hình thái, vi phẫu, giám định DNA so sánh với cây ngón
hoa vàng (Gelseminum elegans).
Xác định độc tính cấp, thành phần hóa học cây ngón hoa trắng (Nhài bắc)
và cây trúc đào.
Ứng dụng chất đã phân lập đƣợc oleandrin làm chất đối chiếu trong giám

định Hóa pháp.


3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. SƠ LƢỢC VỀ GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP
Trong giám định pháp y, giám định hóa pháp là một khâu rất quan trọng góp
phần kết luận các vụ án kịp thời, khoa học và chính xác. Với sự phát triển mạnh mẽ
của khoa học, kỹ thuật. Các ngành hóa học, dƣợc học cũng phát triển không ngừng
và đã cho ra đời nhiều sản phẩm hóa, dƣợc học đƣợc sử dụng rộng rãi trong cuộc
sống, trong nông nghiệp cũng nhƣ trong y học. Hiện nay, tình trạng ngộ độc ngày
càng tăng, nguyên nhân gây ngộ độc rất đa dạng, có thể do nghề nghiệp, ô nhiễm
môi trƣờng, ngộ độc thực phẩm, lạm dụng sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật, thuốc
điều trị, đầu độc, tự tử. Kết quả giám định hóa pháp cung cấp bằng chứng để xác
định nguyên nhân gây ra cái chết, phục vụ cấp cứu các nạn nhân tại các bệnh viện
và những vấn đề liên quan đến pháp luật.
Giám định hóa pháp liên quan đến việc phát hiện, xác định, định tính và định
lƣợng các chất độc có liên quan đến con ngƣời, các mẫu vật. Để có đƣợc kết quả
chính xác thì phải đƣợc áp dụng đúng tiêu chuẩn về quy trình giám định.
Việc phân tích các thành phần hóa học hoặc các chất chuyển hóa của dƣợc
phẩm, thuốc gây nghiện, cây độc và các chất độc khác có liên quan (nhƣ: rƣợu, kim
loại nặng, thuốc trừ sâu, …), theo nghĩa rộng (chủ yếu là trong các mẫu sinh học,
[con ngƣời] dịch cơ thể, mô … ), bao gồm:
+ Phân tích các loại dƣợc phẩm hoặc thuốc gây nghiện có tác động tiêu cực tới
hành vi con ngƣời.
+ Lạm dụng các chất liên quan đến các hoạt động thể thao (doping).
+ Phân tích định tính hoặc định lƣợng các chất gây nghiện trong mẫu sinh học
hoặc mẫu tang vật khác.

+ Phân tích ngộ độc từ thực vật (các loại cây độc).
+ Các phƣơng pháp phân tích hóa pháp thực hiện cho mục đích chẩn đoán và
điều trị (ví dụ nhƣ trong độc chất lâm sàng, phẫu thuật cấy ghép, giám sát hoặc điều
trị, phục hồi chức năng, ngƣời nghiện ma tuý).


4

Mỗi phƣơng pháp phân tích đƣợc sử dụng trong giám định hoá pháp cần đƣợc
thực hiện theo một quy trình chuẩn để đảm bảo kết quả chính xác. Việc lựa chọn
phƣơng pháp để giám định phụ thuộc rất lớn vào loại chất độc cần giám định và
mẫu giám định. Phƣơng pháp sàng lọc bao gồm phản ứng màu, sắc ký lớp mỏng và
xét nghiệm miễn dịch. Để kết luận mẫu dƣơng tính thì phải áp dụng các phƣơng
pháp khẳng định nhƣ sắc ký lỏng khối phổ, sắc ký khí khối phổ... Khi áp dụng các
phƣơng pháp hiện đại vào giám định hóa pháp thì cần phải có chất chuẩn, chất đối
chiếu và đặc biệt các chất chuẩn, chất đối chiếu dùng trong giám định hóa pháp các
nạn nhân ngộ độc thực vật (nhƣ: ngộ độc cây lá ngón, trúc đào, cà độc dƣợc, mã
tiền...). Khi có chất chuẩn, chất đối chiếu thì việc giám định hóa pháp sẽ thuận lợi
và có độ chính xác cao hơn.
1.1.1. Tình hình giám định hóa pháp trên thế giới
Hiện nay hầu hết các nƣớc trên thế giới đều có cơ quan phân tích độc chất, hóa
pháp và đã xây dựng các qui trình giám định hoá pháp phù hợp với sự phát triển của
khoa học kỹ thuật, trình độ, trang thiết bị, hay qui định về luật pháp của từng nƣớc.
Ở các nƣớc việc giám định hóa pháp, độc chất hiện vẫn đang sử dụng các phƣơng
pháp hóa học (phản ứng màu), sắc ký lớp mỏng, để sàng lọc sau đó sử dụng các
phƣơng pháp hiện đại để khẳng định nhƣ sắc ký khí khối phổ, sắc ký lỏng khối
phổ... Theo yêu cầu của Hội các nhà độc chất tƣ pháp quốc tế (TIAFT: The
International Association of Forensic Toxicologists), một phòng tiêu chuẩn đủ điều
kiện giám định độc chất thì phải đảm bảo về con ngƣời, kỹ thuật, thiết bị (bao gồm
nhƣ: TLC - sắc ký lớp mỏng, GC - sắc ký khí, HPLC - sắc ký lỏng hiệu năng cao,

khối phổ - MS, quang phổ tử ngoại khả kiến - UV/VIS) và các loại chất chuẩn.
Ở các nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, Nhật, Hàn Quốc... các chất chuẩn đƣợc cung
cấp thƣờng xuyên và dễ dàng ngay cả các chất chuẩn về ma túy. Còn ở các nƣớc
đang phát triển thì việc mua đƣợc chất chuẩn cũng rất khó khăn. Mặt khác, các chất
chuẩn liên quan đến cây độc thƣờng khó đƣợc cung cấp đầy đủ kể cả ở các nƣớc
phát triển.


5

1.1.2. Tình hình giám định hóa pháp tại Việt Nam
Tại Việt Nam hiện có 3 đơn vị giám định hóa pháp, độc chất là Viện Pháp y
Quốc gia, Viện Pháp y Quân đội và Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. Nhƣng
giám định hóa pháp nạn nhân ngộ độc chủ yếu là Viện Pháp y Quốc gia và Viện
Pháp y Quân đội, còn Viện Khoa học hình sự giám định không nhiều.
Ngày nay khi luật pháp của nƣớc ta ngày càng hoàn thiện và nhà nƣớc cũng
quan tâm đầu tƣ các thiết bị hiện đại để phục vụ giám định hóa pháp, thì việc giám
định hóa pháp đòi hỏi ngày càng phải nâng cao chất lƣợng giám định.
Hiện tại các phƣơng pháp giám định hóa pháp của Việt Nam cũng giống nhƣ
các nƣớc trên thế giới là phân tích sàng lọc bằng các phƣơng pháp nhƣ sắc ký lớp
mỏng, hóa học sau đó ứng dụng các phƣơng pháp nhƣ sắc ký khí khối phổ, sắc ký
lỏng khối phổ…để khẳng định mẫu dƣơng tính hay âm tính.
Ở nƣớc ta việc mua chất chuẩn của các chất độc là rất khó khăn, đặc biệt là
chất chuẩn về ma túy và chuẩn liên quan đến cây độc. Hàng năm Viện Pháp y Quốc
gia vẫn đặt mua các chất chuẩn của các chất độc nhƣng rất khó mua đƣợc do rào
cản kỹ thuật của luật pháp Việt Nam.
Do vậy, để có chất đối chiếu trong giám định hóa pháp tại Viện Pháp y Quốc
gia thì việc khắc phục tạo ra các chất đối chiếu là hết sức quan trọng, đặc biệt là các
chất đối chiếu của các cây độc. Từ đó góp phần nâng cao chất lƣợng giám định hóa
pháp nói riêng và giám định tƣ pháp nói chung, mặt khác cũng góp phần cấp cứu

các nạn nhân ngộ độc một cách kịp thời.
1.2. VỀ VIỆC LỰA CHỌN ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Cây ngón hoa trắng hiện trên thế giới cũng nhƣ tại Việt Nam chƣa thấy tài
liệu nào công bố về thành phần hóa học cũng nhƣ độc tính cấp của cây này, có thể
nói đây là nghiên cứu đầu tiên về cây này. Do vậy qua nghiên cứu này bƣớc đầu
muốn làm sáng tỏ một số thành phần hóa học, độc tính cấp và từ đó có thể xác định
nạn nhân ngộ độc cây ngón hoa trắng hay ngón hoa vàng.
- Cây trúc đào đƣợc lựa chọn nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính do qua
tham khảo các tài liệu, thấy cây trúc đào ở trên thế giới cũng đã đƣợc nghiên cứu


6

nhiều, ở Việt Nam GS. Đỗ Tất Lợi đã nghiên cứu và có một số công bố về kết quả.
Mặt khác trúc đào là một cây rất độc và hàng năm tại nƣớc ta vẫn xảy ra nạn nhân
bị ngộ độc cây này. Việc giám định hóa pháp nạn nhân ngộ độc cây trúc đào cần
phải nhanh chóng và có độ chính xác cao. Nhƣng hiện tại trong giám định nạn nhân
ngộ độc trúc đào thì vẫn chƣa có chất đối chiếu. Vậy qua nghiên cứu thành phần
hóa học và độc tính cấp từ lá trúc đào tại Việt Nam sẽ tạo đƣợc chất đối chiếu để
ứng dụng trong giám định hóa pháp và cho biết đƣợc độc tính cấp của lá trúc đào.
- Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, việc lựa chọn đối tƣợng và nguyên liệu
nghiên cứu nhƣ trên, kết quả nghiên cứu đạt đƣợc sẽ có ý nghĩa khoa học, thực tiễn
và có tính mới trong nghiên cứu.
1.3. CÂY NGÓN HOA TRẮNG (NHÀI BẮC)
Cây ngón hoa trắng đƣợc xác định là thuộc chi Jasminum, để tìm hiểu sâu hơn
về cây ngón hoa trắng, trƣớc tiên cần tìm hiểu về chi Jasminum.
1.3.1. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học Chi Jasminum
Đặc điểm thực vật.
Chi Jasminum thuộc họ Oleaceae. Tên thông thƣờng là Chi Nhài hay Lài. Là
một chi của cây bụi và dây leo với khoảng 840 loài trên thế giới [106], có nguồn

gốc ở vùng nhiệt đới và khu ôn đới ấm. Ở Việt Nam có khoảng 30 loài [72].
Cây gốc ở Ấn Độ, ở Việt Nam cây đƣợc trồng làm cảnh khắp nơi. Hoa thƣờng
dùng để ƣớp trà hoặc để làm thơm thức ăn. Vào mùa thu đông, đào lấy rễ, rửa sạch,
thái nhỏ, phơi hay sấy khô. Lá thu hái quanh năm. Hoa thu hái vào hè thu, khi mới
nở (vì lúc đó hoa có nhiều hoạt chất), dùng tƣơi hay phơi khô.
Phần lớn các loài phát triển bằng cách leo, bám trên cây khác leo trên các hàng
rào. Cây cao khoảng 0.5 - 3m, có nhiều cành xòa mọc ra. Lá hình trái xoan bầu dục,
bóng cả hai mặt, có lông ở dƣới, ở kẽ những gân phụ. Lá xanh quanh năm và rụng
vào mùa thu. Cụm hoa ở ngọn, thƣa hoa. Lá bắc hình sợi. Hoa màu trắng,
thơm ngát. Quả hình cầu, màu đen bao bởi đài tồn tại, có 2 ngăn.
Thành phần hóa học
Hợp chất đặc trƣng của chi Jasminum là chất iridoid. Các hợp chất chủ yếu


7

trong chi Jasminum là oligomer glucosid, este, dimer iridoid hay trimer iridoid
[105].
Bảng 1.1: Các hợp chất đặc trƣng của chi Jasminum
STT

1

2

3

Nhóm

Este

Oligomer glucosid

Dimer hay trimer iridoid

Tên Chất

Công thức

Oleuropein

1

Ketologanin

2

Loganin

3

Jasminin

4

Fiederosid

5

Lilacosid

6

Ligstrosid

7

Jasminosid

8

Jaslanceosid B

9

Jaslanceosid A

10

Jaslanceosid C

11

Sambacosid A

12

Sambaco-lignosid

13

10-hydroxy-oloesid

14

Jasamplexosid A

15

Jasamplexosid B

16


8


9

1.3.2. Đặc điểm thực vật cây ngón hoa trắng (Nhài bắc)
Cây ngón hoa trắng tên khoa học là Jasminum coarctatum Roxb. Nhài bắc,
thuộc chi Nhài (Jasminum). Cây Nhài bắc hay còn gọi là ngón hoa trắng mọc tự
nhiên tại các vùng núi nƣớc ta và đƣợc ngƣời dân khu vực vùng núi phía bắc (nhƣ
Cao Bằng, Hà Giang, Hòa Bình, Điện Biên…) gọi là ngón hoa trắng vì cây này có
hình dáng từ thân, cành, lá giống với cây lá ngón hoa vàng (Gelsemium elegans
Benth.) nhƣ cành nhẵn có rãnh dọc, lá mọc đối hình trứng thuôn dài, đầu nhọn, mép
nguyên, bóng, nhẵn dài từ 5 - 10 cm, rộng từ 2 - 5 cm và chỉ khác là hoa màu trắng.

a

b

Hình 1.1: Hình ảnh cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) chụp tại Cao Bằng (a)
và cây ngón hoa vàng (b)


10

1.3.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học cây ngón hoa trắng (Nhài bắc)
Cho đến nay hiện chƣa thấy tài liệu nào trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam
công bố về nghiên cứu thành phần hóa học cũng nhƣ độc tính của cây ngón hoa
trắng (Nhài bắc), các tài liệu thu thập đƣợc cho thấy các nhà khoa học trong và
ngoài nƣớc chủ yếu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hoa nhài và cây chè
vằng [4], [8], [72].
Hàng năm Viện Pháp y Quốc gia vẫn tiếp nhận giám định các nạn nhân bị ngộ
độc cây ngón. Một số trƣờng hợp theo thông tin từ cơ quan cảnh sát điều tra cung
cấp nạn nhân ăn lá ngón tự tử, nhƣng khi giám định thì nạn nhân không phải ngộ
độc cây ngón hoa vàng (Gelsemium elegans Benth.). Do vậy trong luận án này,
bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính cấp của cây ngón hoa trắng
(Nhài bắc) và phân biệt sự giống và khác nhau với cây ngón hoa vàng, một cây đã
đƣợc nghiên cứu tƣơng đối sâu tại Việt Nam [11],[12], [13], [14], [15].
1.4. CÂY TRÖC ĐÀO
1.4.1. Đặc điểm thực vật
Theo các nhà phân loại thực vật, ở Việt nam trúc đào có hai loài có tên khoa
học là Nerium oleander L. và Nerium indicum Miller. Thuộc họ trúc đào
(Apocynacae). Nerium oleander L. là một chi nhỏ, gồm các loài có nguồn gốc từ
vùng Địa Trung Hải hoặc Trung Á đƣợc trồng làm cảnh ở khắp các vùng nhiệt đới,
trong đó có Việt Nam.
Cây trúc đào là cây nhỡ, mọc thành bụi, cao 3 - 4m, cành mảnh có 3 cạnh màu
xám tro. Lá mọc vòng 3, hình mác hẹp, dài 7 - 10cm , rộng 1 - 3cm, gốc thuôn có

phiến men theo cuống, đầu nhọn, mặt trên xanh bóng, mặt dƣới nhạt, gân bên rất
nhiều và xếp song song đối xứng sít nhau và rất đều, cuống lá ngắn. Cụm hoa mọc ở
ngọn thành xim, hoa màu hồng hay trắng, đài 5 răng có ống ngắn hình chuông,
tràng nhiều cánh rộng, nhị 5, bầu có 2 lá noãn riêng biệt chứa nhiều noãn. Toàn cây
có nhựa mủ trắng và độc, có thể gây tai nạn cho ngƣời và động vật. Ngoài ra còn có
loài Nerium odorum Sand. (hay còn gọi là Nerium indicum Miller) có hoa thơm và
màu hồng [6], [7].


11

Hình 1.2: Ảnh cành mang hoa trúc đào chụp tại Hà Nội
1.4.2. Công dụng của cây trúc đào
Lá trúc đào đƣợc dùng làm nguyên liệu chiết xuất oleandrin, là thuốc uống
điều trị suy tim, hở van tim, hở lỗ van hai lá, nhịp tim nhanh kịch phát, các bệnh tim
có phù và giảm niệu và dùng luân phiên với thuốc Digitalis [6].
Trong y học dân gian Ấn Độ, lá trúc đào dùng ngoài để chữa phát ban ở da.
Nƣớc sắc lá đƣợc dùng để diệt giòi ở vết thƣơng. Cao nƣớc lá, cành, rễ và hoa độc
đối với một số loài sâu bọ. Cây trúc đào còn đƣợc dùng làm bả chuột ở Châu Âu.
Mật từ nhụy hoa trúc đào cũng có thể có độc. Ngoài ra cao lá trúc đào còn đƣợc
ngƣời dân Thổ Nhĩ Kỳ dùng để điều trị bệnh và một số nƣớc khác dùng chữa bệnh
Eczema và chống nhiễm khuẩn [6].
Trúc đào có tính độc cao nên không đƣợc dùng làm thuốc uống trong y học cổ
truyền, chỉ dùng để chế thuốc trừ sâu và nấu nƣớc chữa ghẻ lở, đối với động vật liều
LD50 của oleandrin là khoảng 0,5 mg/kg [59].
1.4.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học
* Ở Việt Nam:
Hiện mới có GS. Đỗ Tất Lợi nghiên cứu sâu và phân lập đƣợc hợp chất
oleandrin từ 5 kg lá cây trúc đào khô [5].
* Trên thế giới: