khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nacl và kno3 lên việc tích lũy lipid ở tảo botryococcus sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NC & PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NaCl
VÀ KNO3 LÊN VIỆC TÍCH LŨY LIPID
Ở TẢO Botryococcus sp.

Cán bộ hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

PGS. TS NGUYỄN HỮU HIỆP

Họ tên: CHUNG KIỀU TRANG
MSSV: 3113761
LỚP: Vi sinh vật K37

Tháng 12/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NC & PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NaCl
VÀ KNO3 LÊN VIỆC TÍCH LŨY LIPID
Ở TẢO Botryococcus sp.

Cán bộ hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

PGS. TS NGUYỄN HỮU HIỆP

Họ tên: CHUNG KIỀU TRANG
MSSV: 3113761
LỚP: Vi sinh vật K37


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(ký tên)

PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp

SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)

Chung Kiều Trang

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn này, em đã nhận được sự hỗ trợ
và động viên nhiệt tình của cha mẹ, quý thầy cô, các anh chị và các bạn để em
hoàn thành tốt luận văn này.
Em xin gởi lời cám ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp đã tận
tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ việc định
hướng luận văn đến việc theo dõi tiến trình thí nghiệm.
Em xin chân thành cám ơn quý thầy cô Viện NC&PT Công nghệ Sinh
học đã tận tình giảng dạy, chỉ dẫn và tạo điều kiện cho em hoàn thành nghiên
cứu.
Em xin gởi lời cám ơn chân thành đến các anh chị học viên cao học và
các bạn sinh viên cùng làm việc trong phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật đã tận tình
giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian qua.

Sinh viên
Chung Kiều Trang


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

TÓM TẮT
Nguồn nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt trong vài thập niên tới, vì
vậy, năng lượng sinh học đang dần được chú ý và trở thành tâm điểm được
nhiều nước trên thế giới chú trọng vì có khả năng thay thế cho nguồn năng
lượng hóa thạch, đồng thời không gây ô nhiễm môi trường. Nhiều loài vi tảo
đang được nghiên cứu để sản xuất năng lượng sinh học. Trong thí nghiệm này,
Botryococcus sp. được nuôi trong năm nồng độ NaCl và năm nồng độ KNO3
khác nhau nhằm đánh giá hàm lượng lipid có trong chủng tảo này. Trong thí
nghiệm bổ sung NaCl, lượng sinh khối đạt cao nhất là 0,456g/l ở nghiệm thức
bổ sung 15mM NaCl, hàm lượng lipid cao nhất là 16,88% ở nghiệm thức bổ
sung 25mM NaCl và năng suất lipid cao nhất là 0,073 g/l thu được ở nghiệm
thức bổ sung 25mM NaCl. Trong thí nghiệm với KNO3, 5,51mM KNO3 đạt sinh
khối cao nhất là 0,444 g/l, hàm lượng lipid cao nhất là 10,74 ở nghiệm thức có
nồng độ KNO3 là 1,84mM và năng suất lipid thu được bị ảnh hưởng không
đáng kể bởi KNO3.
Từ khóa: Botryococcus sp., KNO3, NaCl, năng suất lipid, vi tảo.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ .................................................................................................... iv
TÓM TẮT ........................................................................................................... i
MỤC LỤC .......................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................ iv
DANH SÁCH HÌNH.......................................................................................... v
TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................. vi
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .............................................................................. 1
1.1

Đặt vấn đề: ............................................................................................. 1

1.2

Mục tiêu: ................................................................................................ 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1

Đại cương về tảo .................................................................................... 3

2.2

Đại cương về tảo Botryococcus sp......................................................... 4

2.3

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng sinh khối. ............................. 5

2.3.1

Môi trường nuôi cấy........................................................................ 6

2.3.2

pH .................................................................................................... 6

2.3.3

Ánh sáng.......................................................................................... 6

2.3.4

Độ mặn ............................................................................................ 7

2.3.5

Độ sục khí ....................................................................................... 7

2.3.6

Nhiệt độ ........................................................................................... 7

2.4

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tích lũy lipid ở tảo........................ 7

2.4.1

Thiếu nitơ, phospho ........................................................................ 8

2.4.2

Chế độ sục khí CO2 ......................................................................... 8

2.4.3

Ánh sáng lục và tia cực tím A (UV-A) ........................................... 9

2.4.4

Nhiệt độ ........................................................................................... 9

2.4.5

Acid citric ........................................................................................ 9

2.4.6

Độ mặn: ......................................................................................... 10

2.5

Phương pháp ly trích lipid ................................................................... 10

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 11
Chuyên ngành Vi sinh vật học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

3.1

Trường ĐHCT

Phương tiện nghiên cứu ....................................................................... 11

3.1.1

Thời gian và địa điểm ................................................................... 11

3.1.2

Dụng cụ, thiết bị ............................................................................ 11

3.1.3

Hóa chất ........................................................................................ 12

3.2

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 12

3.2.1

Cấy chuyển giống .......................................................................... 12

3.2.2

Tăng sinh khối tảo ......................................................................... 13

3.2.3

Nuôi tảo Botryococcus sp. trong 2 điều kiện kém thuận lợi ......... 15

3.2.4

Thu sinh khối................................................................................. 16

3.2.5

Trích ly lipid của tảo ..................................................................... 17

3.2.6

Phương pháp xử lý số liệu............................................................. 19

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 20
4.1

Nuôi tăng sinh khối tảo Botryococcus sp. ........................................... 20

4.2

Thí nghiệm ảnh hưởng của NaCl ......................................................... 21

4.2.1 Sự tăng trưởng của tảo Botryococcus sp. trong các nghiệm thức bổ

sung NaCl. .................................................................................................. 21
4.2.2 Ảnh hưởng của NaCl đến sinh khối, hàm lượng lipid và sản lượng
lipid của tảo Botryococcus sp. .................................................................... 22
4.3

Thí nghiệm ảnh hưởng của KNO3 ....................................................... 27

4.3.1

Sự tăng trưởng của tảo Botryococcus sp. ...................................... 27

4.3.2 Ảnh hưởng của KNO3 đến sinh khối, hàm lượng lipid và sản lượng
lipid của tảo Botryococcus sp. .................................................................... 28
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ ........................................................... 33
5.1 Kết luận ....................................................................................................... 33
5.2 Đề nghị ........................................................................................................ 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 34
PHỤ LỤC .............................................................................................................

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Môi trường Chu13 cải tiến ....................................................................... 14
Bảng 2: Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 1 .............................................................. 17
Bảng 3: Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 2 .............................................................. 18
Bảng 4: Ảnh hưởng của NaCl lên năng suất lipid của tảo Botryococcus sp. ........ 28
Bảng 5: Ảnh hưởng của KNO3 lên sản lượng sinh khối tảo Botryococcus sp. ..... 31

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Tế bào tảo Botryococcus sp. ....................................................................... 6
Hình 2: Đặc điểm các hydrocarbon chính được sản xuất bởi Botryococcus sp. ..... 7
Hình 3: Hoạt động của hệ thống soxhlet ............................................................... 20
Hình 4: Ly trích tảo vào ngày 0 và ngày cuối ....................................................... 21
Hình 5: Tăng sinh khối tảo Botryococcus sp. ........................................................ 22
Hình 6: Sự tăng trưởng của tảo Botryococcus sp. trong quá trình
tăng sinh khối ......................................................................................................... 23
Hình 7: Ảnh hưởng của NaCl lên sự tăng trưởng của tảo Botryococcus sp. ......... 23
Hình 8: Tảo Botryococcus sp. trong môi trường chứa NaCl ở ngày nuôi thứ 10 . 24
Hình 9: Ảnh hưởng của NaCl trong môi trường đến sinh khối của tảo
Botryococcus sp. ..................................................................................................... 25

Hình 10: Ảnh hưởng của NaCl trong môi trường đến hàm lượng lipid của tảo
Botryococcus sp. ..................................................................................................... 26
Hình 11: Ảnh hưởng của KNO3 đến tăng trưởng của tảo Botryococcus sp. ......... 29
Hình 12: Tảo Botryococcus sp. trong môi trường có nồng độ KNO3 khác nhau
ở ngày nuôi thứ 10 .................................................................................................. 30
Hình 13: Ảnh hưởng của KNO3 đến lên khả năng tích lũy lipid
của tảo Botryococcus sp. ........................................................................................ 32
Hình 14: Ảnh hưởng của nồng độ KNO3 đến năng suất lipid
của tảo Botryococcus sp. ........................................................................................ 34

Chuyên ngành Vi sinh vật học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

TỪ VIẾT TẮT

ATP: Adenosine triphosphate
CoA: Coenzyme A
NT: nghiệm thức
TCA: axit tricarboxylic

Chuyên ngành Vi sinh vật học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề:

1.1

Hiện nay, nhu cầu sử dụng các nguồn năng lượng đang gia tăng
nhanh chóng do sự bùng nổ dân số và công nghiệp hóa toàn cầu. Hơn 80%
năng lượng sử dụng hiện nay trên thế giới là từ nhiên liệu hóa thạch (dầu mỏ,
than đá, khí thiên nhiên). Đây là những nguồn năng lượng không tái sinh được
và có giới hạn. Theo dự báo của các nhà khoa học, đến khoảng năm 2050 2060, nếu không tìm được những nguồn năng lượng mới thay thế, thế giới có
thể lâm vào khủng hoảng năng lượng nghiêm trọng. Ngoài ra, việc sử dụng
nguồn năng lượng dầu mỏ cũng góp phần làm tổn hại môi trường sinh thái,
gây ra hiện tượng nóng lên toàn cầu, hiệu ứng nhà kính và ảnh hưởng đến
sức khỏe con người do tạo ra lượng lớn CO2. Trước tình hình năng lượng và
môi trường như hiện nay, việc nghiên cứu một nguồn năng lượng mới, sạch và
tái tạo được để thay thế dần nguồn xăng dầu đang ngày càng cạn kiệt là điều
vô cùng cấp thiết, nên trong vài thập niên gần đây, nhiên liệu sinh học
đang trở thành đề tài nghiên cứu thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học
trong và ngoài nước. Việc sử dụng nhiên liệu sinh học không những giảm sự
phụ thuộc vào các nguồn dầu mỏ, than đá mà còn khép kín quy trình tuần hoàn
carbon.

Vi tảo được xem như là một nguồn cung cấp thay thế cho cây lương
thực trong việc sản xuất năng lượng sinh học. Vi tảo có các lợi thế đặc thù so
với các loại cây trồng truyền thống, như đòi hỏi diện tích sản xuất ít hơn cũng
như sự thích ứng của tảo với môi trường tốt hơn rất nhiều. Hơn nữa vi tảo có
tốc độ tăng trưởng nhanh và năng suất cao. Nhiên liệu sinh học từ vi tảo được
xem là một nguồn năng lượng thay thế nhiên liệu hóa thạch và việc sử dụng
nguồn năng lượng này có khả năng làm giảm lượng CO2 trong không khí so với
việc sử dụng nhiên liệu hydrocarbon hóa thạch. Mang đặc tính của một nước
nhiệt đới với hệ thống sông ngòi và ao hồ chằng chịt, Việt Nam thừa hưởng
một hệ vi tảo khá phong phú và đa dạng.

_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Tảo Botryococcus đã được nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tích
lũy lipid trong tế bào nhằm tìm ra nguồn nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu
sinh học như: Rashmi Tyagi et al. (2013), Trần Thị Lê Trang (2013).
Tuy nhiên, hiện nay thì giá thành cho việc sản xuất dầu từ vi tảo vẫn còn
tương đối cao. Theo Chisti (2008), giá thành petrodiesel là 0,5 USD/lít, dầu cọ
là 0,66 USD/lít và vi tảo là 1,4 USD/lít (với các loại tảo chứa 30% dầu). Vì vậy
muốn giá nhiên liệu sinh học sản xuất từ vi tảo giảm xuống thì hàm lượng lipid

tổng (dầu) trong tảo cần phải cao hơn (Trương Vĩnh, 2010). Trước tình hình
đó, cần tìm cách nâng cao sản lượng lipid tổng có trong tảo và một trong các
cách đang được nghiên cứu là tạo điều kiện môi trường nuôi cấy kém thuận lợi
để việc tích lũy lipid đạt kết quả cao. Trên thực tế, hầu hết các loài vi tảo tăng
khả năng tích lũy lipid khi được nuôi trong điều kiện kém thuận lợi như thiếu
chất dinh dưỡng (Nitơ, phospho...), nồng độ muối cao, hay nồng độ acid cao…
Vì lý do đó, đề tài được tiến hành với mục đích tìm ra được điều kiện nuôi cấy
thích hợp kích thích tảo tổng hợp lượng lipid cao.
1.2

Mục tiêu:

Xác được định nồng độ thích hợp của NaCl và KNO3 tác động đến khả
năng tích lũy lipid ở tảo Botryococcus sp..

_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1

Đại cương về tảo
Theo Nguyễn Lân Dũng (2006), tảo gồm 14 ngành:
 Cyanobacteria (tảo lam)
 Prochlorophyta - Ngành Tảo tiền lục
 Rhodophyta (tảo đỏ)


Heterokontophyta- Ngành Tảo lông roi lệch

 Chrysophyta (tảo vàng ánh)
 Xantophyceae- Tảo vàng lục
 Bacillariophyta (tảo silic)
 Phaecophyta (tảo nâu)
 Haptophyta- Ngành Tảo lông roi bám
 Eustigmatophyta- Ngành Tảo hạt
 Cryptophyta- Ngành Tảo hai lông roi
 Dinophyta (tảo hai rãnh)
 Euglenophyta- Tảo mắt
 Chlorophyta (tảo lục)
Tảo có kích thước tương đương với nấm, rong, có thể là đơn bào sống
riêng lẻ hoặc sống thành tộc đoàn, hay đa bào hình sợi… Thanh tảo (cyanophyta)
là vi sinh vật sơ hạch, số tảo còn lại là vi sinh vật chân hạch. Tảo có sắc tố và đây
là đặc điểm dùng để phân loại. Tảo thuộc nhóm vi sinh vật quang tự dưỡng,
thường sinh sản bằng cách phân đốt. Tảo thường là nguồn thức ăn đầu tiên cho
những sinh vật cấp cao hơn như phiêu sinh động vật (zooplankton) (Nguyễn Hữu
Hiệp, 2011). Vi tảo (Microalgae) bao gồm các tảo có kích thước nhỏ, không thể
nhìn được bằng mắt thường. Vi tảo chiếm 2/3 trong tổng số 50.000 loài tảo trên
thế giới (Nguyễn Lân Dũng, 2006).

_

Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Đại cương về tảo Botryococcus sp.:

2.2

Giới:

Plantae

Nghành:

Chlorophyta

Lớp:

Trebouxiophyceae

Bộ:

Trebouxiales

Họ:

Botryococcaceae

Chi:

Botryococcus
Hình 1: Tế bào tảo Botryococcus braunii.

(Nguồn:
/>omy/?id=6893 1/11/2014)

Nguồn:
/>_sp. 24/6/2014

Botryococcus sp. sống chủ yếu trong nước ngọt, hồ nước lợ, hồ chứa, ao
(Metzger và Largeau, 2005). Botryococcus sp. là một sinh vật phù du có cấu
trúc đơn bào, hình bầu dục, các tế bào sống kết hợp lại tạo thành dạng chuỗi.
Mỗi tế bào được bao quanh bởi một màng sinh học, góp phần vào quá trình sản
xuất hydrocarbon, bảo vệ tế bào và giúp các tế bào liên kết lại với nhau (Weiss
et al., 2012). Là một sinh vật quang hợp, Botryococcus sp. làm giảm lượng khí
thải CO2 tương đương 1,5 × 105 tấn/năm/8,4x103 ha (Sawayama et al., 1999).
Chúng phân bố rộng rãi khắp các châu lục và có thể sinh trưởng trong các điều
kiện khác nhau (Tyson, 1995). Botryococcus được đặc trưng bởi khả năng tổng
hợp và tích lũy mức độ rất cao của chất béo (C. Dayananda, et al., 2010). Hầu
hết các chủng Botryococcus chứa 5-42% lipid và 0,1-61% hydrocarbon trên
trọng lượng khô (Metzger và Largeau, 1999, 2005; Dayananda et al., 2007a;
Ranga Rao et al., 2007; Hai-Linh et al., 2009; Ela và Anastasios, 2010;
Chiara et al., 2010).

Khả năng sản xuất dầu của loại tảo này đã được nghiên cứu ở các giai
đoạn tăng trưởng khác nhau ở điều kiện nuôi cấy khác nhau (Casadevall et al.,
1985, Inoue et al., 1994). Casadevall et al., (1985) và Villarreal-Rosales et al.,
(1992) đã chứng minh rằng năng suất hydrocarbon trong Botryococcus sp. thay
đổi theo chu kỳ tăng trưởng, tối đa trong giai đoạn log và giai đoạn ổn định.
_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Nghiên cứu tiếp theo của Sawayama et al., (1992) và Kojima et al.,
(1999) cũng cho thấy việc sản xuất hydrocarbon của loại tảo này là tỷ lệ thuận
với quá trình tăng trưởng của tế bào. Do đó, sinh khối tảo trong giai đoạn ổn
định là một tiền đề quan trọng của sản xuất hydrocarbon.

Hình 2: Đặc điểm các hydrocarbon chính được sản xuất bởi Botryococcus sp.
2.3

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tăng sinh khối.
Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự sinh trưởng cũng như

phát triển của tảo là: môi trường nuôi cấy, ánh sáng, pH, khuấy tảo và nhiệt độ.

_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

2.3.1

Trường ĐHCT

Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy dành cho tảo thường gồm các thành phần như:
nguyên tố đa lượng, nguyên tố vi lượng, vitamin và hệ đệm. Tùy theo từng loại
tảo phân lập mà môi trường có thành phần khác nhau nhưng bao giờ cũng có
hai thành phần chính là nguyên tố đa lượng và vi lượng. Nguyên tố đa lượng và
một số nguyên tố thường không thể thay đổi.
Nguyên tố đa lượng bao gồm các chất được sử dụng nhiều và rất cần
thiết cho sự phát triển của tảo. Trong đó, nguồn N là nguồn dinh dưỡng có vai
trò quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và năng suất sinh khối thu được của
tảo. Nguồn N có thể được cung cấp dưới dạng muối Nitrate (NaNO3,
KNO3,…), muối amonium (NH4NO3, NH4Cl,…) hay urea.
Nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết cho sự phát triển của tảo, nhưng
nhu cầu của tảo với những chất này rất ít. Các nguyên tố vi lượng bao gồm Fe,
Mn, Zn, Cu, Mo, Bo,…. (Trương Vĩnh, 2010).
2.3.2

pH

Một thông số quan trọng của môi trường là pH vì pH xác định độ hòa
tan của CO2 và muối khoáng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất ở tảo
(Trương Vĩnh, 2010). Đa số các loài tảo thích hợp với pH từ 7 đến 9, với
khoảng pH tối thích là 8,2 - 8,7. Tuy nhiên, cũng có một loài tảo sống trong
môi trường có acid hoặc kiềm hơn. Trong quá trình nuôi, tảo hấp thu các chất
hòa tan trong môi trường, đặc biệt là CO2 hay HCO3-,làm cho pH tăng lên, có
khi đạt tới 9. Sự thổi khí (không khí hoặc khí CO2) có thể điều hòa lại pH môi
trường (Barsanti và Gualtieri, 2006).
2.3.3

Ánh sáng

Ánh sáng tự nhiên đủ để nuôi tảo trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên,
không nên đặt các bình nuôi dưới ánh sáng trực tiếp vì cường độ ánh sáng
mạnh có thể phá hủy các sắc tố quang hợp, đồng thời khó có thể điều chỉnh và
thực hiện cho chiếu sáng 24/24. Nếu muốn sử dụng ánh sáng tự nhiên, các
nghiệm thức tảo nên được đặt ở cạnh các cửa sổ quay về hướng bắc.
_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Ánh sáng nhân tạo có thể được tạo ra bởi đèn huỳnh quang. Cường độ
ánh sáng thích hợp là từ 3,32-830 μE/s/m2, nhưng cường độ 80-160 μE/s/m2
thường được sử dụng để nuôi cấy tảo. Đối với tảo Botryococcus sp., cường độ
chiếu sáng thích hợp nhất để tảo phát triển tốt là ở 60 W/m2 (Jian Qin, 2005).
2.3.4

Độ mặn

Tảo biển có khả năng chịu đựng tốt sự thay đổi độ mặn của môi trường.
Hầu hết các loài tảo phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy có độ mặn nhỏ
hơn nơi thu mẫu một ít. Độ mặn khoảng 20-24 g/L là tối ưu cho tảo. Tảo
Botryococcus sp. là một loại tảo nước ngọt tuy nhiên chúng có khả năng phát
triển trong môi trường có độ mặn từ 17mM – 85mM (Ranga Rao et al , 2007).
2.3.5

Độ sục khí

Nhằm làm cho các tế bào tảo luôn ở dạng lơ lửng giúp chúng sinh
trưởng tốt, ngăn ngừa sự kết dính và lắng tụ, tăng khả năng hòa tan khí. Các
phương pháp khuấy đảo bao gồm: sục khí (có thể làm hư hại các tế bào tảo),
bánh xe quạt nước (khoảng 1 rpm) hay khuấy bằng tay. Hầu hết các bình nuôi
cấy tảo trong phòng thí nghiệm đều không cần khuấy đảo, nhất là khi mật số
tảo thấp, nhưng tốt nhất vẫn nên khuấy bằng tay 1lần/ngày (Barsanti và
Gualtieri, 2006).
2.3.6

Nhiệt độ

Nhiệt độ ủ tảo nên được duy trì càng gần với nhiệt độ nơi thu mẫu càng
tốt: tảo vùng cực (<10oC), vùng ôn đới (10-25oC) và vùng nhiệt đới (>20oC).
Nhiệt độ ủ thích hợp không những phụ thuộc vào từng loài, từng dòng tảo mà
còn phụ thuộc vào môi trường (Barsanti và Gualtieri, 2006). Thông thường,
nhiệt độ tối ưu cho các dòng tảo lục là 18-25oC. Nếu nhiệt độ xuống dưới 16oC
tảo sẽ ngừng sinh trưởng. Đối với tảo Botryococcus braunii, nhiệt độ nuôi
thích hợp là 23oC (Jian Qin, 2005).
2.4

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tích lũy lipid ở tảo

Quá trình tích lũy lipid thường được diễn ra vào đầu pha ổn định, khi đó
tảo có xu hướng dừng quá trình sinh trưởng và chuyển sang tích lũy lipid, đặc
biệt là triacylglyceride (Cheng et al., 2011). Quá trình này diễn ra bên trong tế
_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

bào và phụ thuộc vào từng dòng vi tảo cũng như môi trường nuôi. Ngoài ra,
việc tích lũy lipid còn có thể xảy ra nhanh và hàm lượng lipid có thể tăng ở một
số dòng tảo khi chúng được nuôi trong điều kiện môi trường stress (Holcomb et
al., 2011). Một số yếu tố thường ảnh hưởng đến quá trình tích lũy lipid của tảo

là: thiếu nitơ, phospho, độ sục khí CO2, ánh sáng lục và tia cực tím A, Alginate
oligosaccharides, nhiệt độ, acid citric, độ muối...
2.4.1

Thiếu nitơ, phospho

Nitơ, phospho là hai chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự phát triển của tảo.
Trong tế bào, nitơ tham gia vào quá trình tổng hợp acid amin, acid nucleic, chất
diệp lục và các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ. Khi lượng nitơ và phospho trong
môi trường đầy đủ thì quá trình tăng trưởng và phát triển của tế bào diễn ra
mạnh, kích thước và số lượng tế bào tăng nhanh nhưng hàm lượng lipid tích
lũy thì chỉ ở mức giới hạn tùy theo từng dòng tảo. Trong một nghiên cứu của
Rodolfi (2009) đã cho thấy, trong số 30 chủng vi tảo đã được sàng lọc thì có
một dòng tảo Nannochloropsis chứa 60% lipid sau khi được nuôi trong điều
kiện thiếu nitơ, tăng 30% so với khi nuôi ở môi trường đầy đủ nitơ. Còn theo
nghiên cứu của Susans (1997) thì tảo Ankistrodesmus sp. có hàm lượng lipid và
carbohydrate cao khi môi trường thiếu phospho. Điều này cho thấy, trong điều
kiện thiếu nitơ hoặc phospho, tảo có xu hướng phát triển chậm lại và dùng các
chất dinh dưỡng cho quá trình tích lũy lipid hoặc các hợp chất khác
(carbohydrate, chlorophyll…). Ngoài ra, tỉ lệ giữa nồng độ nitơ và phospho
trong môi trường cũng ảnh hưởng ít nhiều đến việc tích lũy lipid của một số
loại tảo (Susans et al., 1997). Ví dụ, khi tỉ lệ N:P là 1:1 thì lượng lipid trong tảo
Ankistrodesmus sp. gần như không tăng nhưng với tỉ lệ N:P là 200:1 thì lượng
lipid trong tảo tăng lên đáng kể.
2.4.2

Chế độ sục khí CO2

Tảo đóng một vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn carbon của trái đất
vì góp phần giảm nồng độ CO2 trong khí quyển, bảo vệ sự sống cho các sinh

vật khác trên trái đất. Nồng độ CO2 đưa vào môi trường cũng tác động không ít
lên sự tăng trưởng và hàm lượng lipid của tảo.
_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Trong quá trình nuôi tảo, việc sục khí giúp phân bố đều nhiệt độ trong cả
bình, tránh tình trạng lắng xuống bể, đồng thời giúp cải thiện việc tiếp xúc với
ánh sáng của tảo. Hơn nữa, việc cung cấp đủ CO2 sẽ góp phần vào quá trình
quang hợp và ổ định độ pH do cân bằng CO2 và H2CO3.
2.4.3

Ánh sáng lục và tia cực tím A (UV-A)

Lượng ánh sáng cần thiết luôn là vấn đề tồn tại đối với các loại tảo bởi vì
việc ngập nước có thể làm giảm cường độ ánh sáng và làm giảm quang hợp.
Ánh sáng màu đỏ được hấp thụ ở vài mét gần với bề mặt của môi trường nước
và môi trường ánh sáng bên dưới vài mét - nơi đa số các tế bào sống - chủ yếu
là màu lục và vì thế nhiều loại tảo có cơ chế đặc biệt để hấp thụ ánh sáng màu
lục tốt hơn.
Trong một nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đến tảo Chlorella
minutissima, thí nghiệm được tiến hành với 3 nguồn ánh sáng LEDs đỏ, LEDs

trắng, và đèn neon trong 24h. Ánh sáng đèn neon cho tốc độ phát triển tảo
nhanh nhất. Tuy nhiên không có sự thay đổi có ý nghĩa về thành phần của các
Fatty acid methy ester (FAME) (Haiying et al., 2011)
2.4.4

Nhiệt độ

Nhiệt độ có tác động đáng kể đến tốc độ tăng trưởng, kích thước tế bào và
thành phần sinh hóa của tảo. Trong một nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ
đến tốc độ tăng trưởng của tảo cho thấy Nanochloropsis sp. không bị ảnh
hưởng bởi nhiệt độ trong khoảng 15-30oC. Tuy nhiên, tảo Isochrysis galbana
lại cho thấy tốc độ tăng trưởng tăng lên khi nhiệt độ tăng từ 15oC đến 30oC.
2.4.5

Acid citric

Acid citric đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa trung gian
của tế bào. Nó đóng nhiều vai trò trong con đường dị dưỡng và biến dưỡng của
sinh vật (Srere, 1972). Ngoài ra, nó còn là cơ chất quan trọng cho chu trình
TCA và trong sự tổng hợp lipid ngoài tế bào chất của sinh vật... Acid citric khi
vào cơ thể sẽ được chuyển đến ty thể để tổng hợp thành dạng citrate và đồng
thời hình thành nên hệ vận chuyển citrate shuttle. Hệ vận chuyển này sẽ chuyên
chở acetyl-CoA dưới dạng citrate sau khi đã kết hợp với oxaloacetate ra ngoài
_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

tế bào chất. Tại đây, enzyme ATP: citrate lyase sẽ phân cắt citrate trung gian về
dạng acetyl-CoA và quá trình tích lũy lipid bắt đầu diễn ra. Ngoài ra, acid citric
và isocitric cũng có tác dụng hoạt hóa acetyl-CoA-carboxylase dẫn đến làm
thay đổi tốc độ tổng hợp acid béo và làm tăng hàm lượng lipid trong tảo.
2.4.6

Độ mặn:

Mức độ nhiễm mặn ảnh hưởng đáng kể cả tốc độ tăng trưởng và thành
phần lipid của tảo. Sự gia tăng vừa phải trong độ mặn (<0,25 M của NaCl) có
thể kích thích tăng trưởng tảo và hàm lượng lipid (Jian Qin, 2005). VázquezDuhalt đã chỉ ra rằng thành phần lipid, đặc biệt là các chất béo, có thể được
thay đổi bằng độ mặn (Vázquez-Duhalt et al., 1991). Vì vậy, các tác động đến
độ mặn có thể mang lại sinh khối tảo có chứa thành phần lipid mong muốn
(Vázquez-Duhalt et al., 1991).
2.5

Phương pháp ly trích lipid

Phương pháp ly trích hiện nay đã được áp dụng rộng rãi (98,2% lượng
lipid hay dầu tính trên trọng lượng khô) vì nó mang lại hiệu quả kinh tế cao
hơn phương pháp ép (94%). Phương pháp ly trích có thể lấy được triệt để hàm
lượng lipid có trong nguyên liệu, đặc biệt đối với các nguyên liệu có hàm lượng
dầu thấp (Vĩnh et al, 2010).
Nguyên tắc của việc trích ly được dựa trên tính hòa tan của lipid trong
dung môi hữu cơ không phân cực (n-hexan, methanol, chloroform,...). Bản chất

của quá trình trích ly lipid là quá trình ngâm chiết hòa tan, làm chuyển lipid
dầu từ trong nguyên liệu vào dung môi, trong đó độ hòa tan phụ thuộc vào
hằng số điện môi của dung môi và dung dịch hòa tan, hai chất lỏng có hằng số
điện môi càng gần nhau thì khả năng hào tan vào nhau càng lớn. Sự hòa tan
được tào thành từ khuếch tán phân tử và khuếch tán đối lưu và thấm qua màng
tế bào đi vào dung dịch.

_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1

Phương tiện nghiên cứu

3.1.1
Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ tháng 08/2014 – 11/2014
Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật,
Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Cần Thơ.
3.1.2

Dụng cụ, thiết bị
Mẫu tảo: Tảo Botryococcus sp. nhận từ nguồn tảo lưu trữ của
Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học
Cần Thơ.
Thiết bị thí nghiệm:
Tủ cấy vô trùng, tủ ủ tảo
Tủ ủ nhiệt độ cao, tủ sấy
Nồi khử trùng nhiệt ướt
Hệ thống thiết bị trích ly Soxhlet 500ml
Máy ly tâm
Cân điện tử
Kính hiển vi
Dụng cụ thí nghiệm:
Micropippet, ống nghiệm, bình tam giác (500-2000ml)
Cối và chày sứ
Ống đong, đĩa petri
Đèn cồn, kẹp
Keo nhựa 10L
Buồng đếm hồng cầu

_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

3.1.3
Hóa chất
Hóa chất thí nghiệm: KNO3, NaCl.
Dung môi ly trích lipid: n-hexan
Bảng 1: Môi trường Chu13 cải tiến (Jin-Young An, 2003).
Khối lượng

Hóa chất

(trong 1L dung dịch)

Đa lượng


KNO3

371mg



K2HPO4

80mg



MgSO4.7H2O

200mg



CaCl2.6H2O

107mg



Ferric Citrate

20mg



Acid citric

100mg

Vi lượng

3.2

Dung dịch Stock



H3,67mMO3

2,86g/L



MnCl2.4H2O

1,81g/L



ZnSO4.7H2O

0,22g/L



Na2MoO.2H2O

0,39g/L



CuSO4.5H2O

0,08g/L



Co(NO3)2.6H2O

0,05g/ L

Thể tích

1ml

Phương pháp nghiên cứu
3.2.1

Cấy chuyển giống

Mục tiêu: Nhân dòng tảo Botryococcus sp. và trữ giống tảo thuần.

_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Tiến hành
Chọn mẫu tảo: chọn ống nghiệm có mật độ tảo tương đối cao và kiểm tra
mẫu tảo dưới kính hiển vi, tránh trường hợp mẫu bị nhiễm dòng tảo khác, vi
khuẩn hay nấm.
Chuẩn bị 25 ống nghiệm (mỗi ống chứa 5ml môi trường Chu13) đã khử

o

trùng nhiệt ướt ở nhiệt độ 121 C trong 20 phút.
Chuyển 1ml mẫu tảo từ ống tảo gốc vào mỗi ống nghiệm mới có chứa
môi trường.
Đặt 25 ống nghiệm mới đã được chủng mẫu vào tủ nuôi tảo ở nhiệt độ
phòng, chiếu sáng 24/24.
Tiến hành đếm mật số của dòng vi tảo bằng buồng đếm hồng cầu ở vật
kính 40X
3.2.2

Tăng sinh khối tảo

 Mục tiêu
Tăng sinh khối tảo để chuẩn bị cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
 Nhân sinh khối vi tảo ở bình tam giác 300ml
Chuẩn bị 7 bình tam giác loại 300ml, mỗi bình có chứa 100ml môi trường
Chu13 đã khử trùng nhiệt ướt và được đậy bằng nút gòn đã khử trùng.
Tiến hành chủng vào mỗi bình tam giác 3 ống tảo trữ (tổng cộng 15ml) đã
được nhân giống từ trước (thể tích tảo dùng làm mẫu chủng bằng 15-20% thể
tích môi trường trong bình chứa mới). Còn 20ml trữ cho thí nghiệm sau.
Đặt 7 bình tam giác trong tủ nuôi tảo ở nhiệt độ phòng, chiếu sáng liên
tục 24/24, sục khí liên tục bằng máy sục khí. Tiến hành đếm mật số của dòng vi
tảo bằng buồng đếm hồng cầu ở vật kính 40X.
Để xác định lượng tế bào tảo có trong 1ml dung dịch dùng phương pháp
đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.

_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

Mật số tế bào:
N=

a x 4000 x n x 103

(đơn vị: tế bào/ml)

5 x 16

Trong đó:


N: số lượng tế bào trong trong 1ml



a: tổng số tế bào đếm được trong 5x16 ô vuông nhỏ.



4000 = 400x10 (1/400mm2: diện tích 1 ô vuông nhỏ, 1/10mm:

chiều cao từ mặt buồng đếm đến tấm lamen)


n: độ pha loãng
 Nhân sinh khối vi tảo ở bình tam giác 1 lít

Chuẩn bị 5 bình loại 1 lít. Sau 5 ngày, tiến hành chuyển 140ml tảo từ bình
tam giác 300ml vào bình 1L chứa 760ml môi trường Chu13 đã khử trùng. Còn
lại 105 ml, chuyển vào 2 bình tam giác 100ml để trữ cho thí nghiệm tiếp theo.
Tiếp tục cho sục khí các bình trong 1 tuần.
Tiến hành đếm mật số của dòng vi tảo bằng buồng đếm hồng cầu ở vật
kính 40X
 Nhân sinh khối vi tảo ở bình 5 lít
Chuẩn bị 5 bình loại 5 lít. Tiếp tục chuyển 700ml từ bình tam giác 1L
sang bình nhựa 10L đã chứa 4L môi trường Chu13. Phần còn lại là 1000ml
chuyển vào bình tam giác 1L khác để trữ cho thí nghiệm khác. Sục khí bình
nhựa 5L và bình 1L nuôi trong 1 tuần.
Tất cả các bình nuôi tảo đều được nuôi ở nhiệt độ phòng, được sục khí và
chiếu sáng liên tục. Tiến hành đếm mật số của dòng vi tảo bằng buồng đếm
hồng cầu ở vật kính 40X.

_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 – 2014

Trường ĐHCT

3.2.3

Nuôi tảo Botryococcus sp. trong 2 điều kiện kém thuận lợi



Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên hàm lượng
lipid của tảo Botryococcus sp.

Mục đích
So sánh hàm lượng lipid tích lũy khi nuôi tảo Botryococcus sp. trong môi
trường Chu13 cải tiến và môi trường có bổ sung nồng độ NaCl.
Tiến hành
Sử dụng nguồn tảo được tăng sinh khối trước đó. Thí nghiệm được tiến
hành trong bình nhựa 5L với môi trường Chu13. Bố trí thí nghiệm gồm 5
nghiệm thức (NT) với 3 lần lặp lại. Ở mỗi nghiệm thức, 700mL tảo giống được
chủng vào 4L môi trường Chu13 có sẵn trong bình nhựa 5L và bổ sung thêm
NaCl vào các bình theo các số liệu bên dưới.
Bảng 2: Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 1
Loại môi trường

Bổ sung NaCl

Nghiệm thức

Nồng độ mol (mM/l)

NT1

0

NT2

0,15

NT3

0,25

NT4

0,35

NT5

0,5

Tảo ở các nghiệm thức được bố trí nuôi dưới ánh sáng đèn neon chiếu
sáng 24/24 và sục khí liên tục. Mật số tảo được đếm hằng ngày bằng buồng
đếm hồng cầu.

_
Chuyên ngành Vi sinh vật hoc

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học