phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ ca cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ CA CAO

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

ThS. HUỲNH XUÂN PHONG

HUỲNH THỊ HOÀNG ANH
MSSV: 3113697
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37

Cần Thơ, Tháng 12/2014


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

ThS. HUỲNH XUÂN PHONG

HUỲNH THỊ HOÀNG ANH

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày

tháng 12 năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học này, ngoài sự cố gắng của chính bản
thân tôi, còn có sự đóng góp rất quan trọng của nhiều người.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến:
Cô Ngô Thị Phương Dung và thầy Huỳnh Xuân Phong đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Phạm Hồng Quang – là cố vấn học tập,
người đã chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học đại học.
Tôi xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh và anh Bùi Hoàng Đăng

Long - cán bộ phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm, quý Thầy Cô và anh chị cán bộ
các phòng thí nghiệm của Viện NC&PT CNSH đã hỗ trợ, đóng góp ý kiến và tạo điều
kiện thuận lợi để tôi thực hiện tốt đề tài luận văn.
Xin được gửi lời cám ơn chân thành đến tất cả các quý Thầy Cô đã tận tình
truyền dạy cho tôi kiến thức hữu ích để phục vụ đề tài.
Xin chân thành cảm ơn các anh chị học viên cao học, các bạn sinh viên của
phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
đề tài.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động
viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời
gian qua để tôi vững tin thực hiện đề tài.
Tôi xin kính chúc đến quý Thầy Cô cùng các bạn sinh viên luôn dồi dào sức
khỏe, công tác tốt.

Huỳnh Thị Hoàng Anh

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

TÓM TẮT
Acid acetic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, acid acetic
là acid hữu cơ được sử dụng phổ biến trong điều vị và chế biến thực phẩm. Vi khuẩn

acid acetic có ý nghĩa quan trọng trong quá trình lên men, trong đó lên men giấm là
được sử dụng rộng rãi nhất. Đề tài đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn acid acetic
(AAB) từ 14 mẫu là các thành phần khác nhau của ca cao được thu thập ở Cần Thơ và
Bến Tre. Phân loại thông qua khả năng oxy hóa acetate cho thấy có 17 chủng thuộc
giống Acetobacter và 13 chủng thuộc giống Gluconobacter. Thử nghiệm khả năng
sinh acid trên môi trường có 0,01% bromocresol green sơ tuyển được 17 chủng AAB
(CL1, CL2, CF1, CF2, CV1, C3-1, C3-3, C4-2, C6-1, C6-2, CK2, B2-2, B2-3, B3-2,
B4-1, BK1 và BK3) có đường kính vòng sáng từ 20 mm trở lên trong 48 giờ ủ ở 30 oC.
Kết quả thử khả năng phát triển ở các nồng độ acid khác nhau cho thấy hai chủng B23 và B3-2 phát triển ở 3% acid aceric; B2-2 phát triển ở 1,5% acid acetic; các chủng
CL1, CF2, C4-2, C6-1 và BK1 có thể phát triển ở 1% acid acetic; các chủng còn lại
chỉ phát triển ở 0,5% acid acetic. Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt trên môi
trường YPGD chứa 4% ethanol cho thấy đa số (10 chủng) các chủng phát triển được
ở 45oC; một số chủng (CL2, CF2 và CK2) phát triển ở 43oC; các chủng B2-3, B3-2 và
B4-1 phát triển ở 41oC; chủng B2-2 chỉ phát triển được ở 39oC. Tuyển chọn được 2
chủng AAB chịu nhiệt có khả năng lên men acid acetic là B2-3 và B3-2 với nồng độ
acid acetic đạt được ở ngày lên men thứ 5 lần lượt là 4,44% và 5,08% ở 39oC trong
khi các chủng còn lại chỉ lên men ở 30oC.
Từ khóa: acid acetic, chịu acid, chịu nhiệt, lên men acid acetic, vi khuẩn acetic.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................................
LỜI CẢM TẠ.................................................................................................................. i
TÓM TẮT ......................................................................................................................ii
MỤC LỤC .....................................................................................................................iii
DANH SÁCH BẢNG..................................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ..........................................................................vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu đề tài ......................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1 Sơ lược về ca cao ..................................................................................................... 3
2.1.1. Cây ca cao...................................................................................................... 3
2.1.2. Các giống ca cao trên thế giới ....................................................................... 4
2.1.3. Công dụng của ca cao ................................................................................... 5
2.1.4. Sơ lược về quy trình lên men ca cao .............................................................. 6
2.1.5. Một số vi sinh vật có trong hạt ca cao lên men ............................................. 8
2.2 Giới thiệu về acid acetic ....................................................................................... 11
2.2.1 Giới thiệu chung .......................................................................................... 11
2.2.2. Phương pháp sản xuất ................................................................................. 11
2.2.3. Ứng dụng...................................................................................................... 12
2.3 Tổng quan về quá trình lên men của vi sinh vật ................................................ 14
2.3.1 Bản chất của quá trình lên men ................................................................... 14
2.3.2. Quá trình lên men acid acetic ...................................................................... 15
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men .............................................. 15
2.4 Vi khuẩn acid acetic .............................................................................................. 16
2.4.1. Giới thiệu vi khuẩn acid acetic .................................................................... 16
2.4.2. Phân loại ...................................................................................................... 17
2.4.3. Vai trò quan trọng của vi khuẩn acid acetic ................................................ 19

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................. 21
3.1 Phương tiện nghiên cứu ....................................................................................... 21
Chuyên ngành Vi Sinh vật học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

3.1.1. Thời gian và địa điểm .................................................................................. 21
3.1.2. Nguyên liệu .................................................................................................. 21
3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất ..................................................................... 21
3.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 22
3.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic .................................................... 22
3.2.2. Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng vi khuẩn acid acetic ......... 22
3.2.3. Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic ......................... 23
3.2.4. Khảo sát khả năng phát triển ở các nồng độ acid acetic khác nhau ........... 23
3.2.5. Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic .............................. 23
3.2.6. Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid
mạnh.......................................................................................................................24
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 25
4.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic .............................................. 25
4.2 Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng vi khuẩn acid acetic .............. 26
4.3 Thử nghiệm khả năng sinh acid acetic ............................................................... 30
4.4 Khảo sát khả năng phát triển ở các nồng độ acid acetic khác nhau ................ 33
4.5 Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic .................................... 35

4.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid
mạnh ............................................................................................................................. 37
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 44
5.1 Kết luận .................................................................................................................. 44
5.2 Đề nghị ................................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 45
PHỤ LỤC .................................................................................................................. PL1

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Sản lượng hạt ca cao trên thế giới (nghìn tấn) ...................................................4
Bảng 2. Những đặc tính khác nhau giữa giống Criollo, Forastero và Trinitario ............5
Bảng 3. Sự thay đổi các thành phần hạt Forastero sau quá trình ủ và phơi ....................8
Bảng 4. Nguồn nguyên liệu và địa điểm thu mẫu .........................................................21
Bảng 5. Số lượng các chủng vi khuẩn acid acetic phân lập từ ca cao ...........................26
Bảng 6. Kết quả định danh sơ bộ các chủng AAB ........................................................29
Bảng 7. Đường kính vòng sáng của các chủng AAB ....................................................31
Bảng 8. Đặc điểm của 17 chủng AAB được tuyển chọn ..............................................32
Bảng 9. Kết quả thử nghiệm khả năng phát triển ở các nồng độ acid acetic khác nhau
của 17 chủng AAB ........................................................................................................34

Bảng 10. Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của 17 chủng AAB .......................36
Bảng PL1. Kết quả thống kê hàm lượng acid acetic (% w/v) khi lên men ở 30oC .... PL5
Bảng PL2. Kết quả thống kê hàm lượng acid acetic (% w/v) khi lên men ở 37oC .... PL9
Bảng PL3. Kết quả thống kê hàm lượng acid acetic (% w/v) khi lên men ở 38oC .. PL14
Bảng PL4. Kết quả thống kê hàm lượng acid acetic (% w/v) khi lên men ở 39oC .. PL18
Bảng PL5. Mô tả khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn của các chủng AAB ................ PL22
Bảng PL6. Bảng thống kê số liệu về hàm lượng acid của 8 chủng AAB trong 7 ngày ở
30oC, 37oC, 38oC, 39oC ............................................................................................ PL23
Bảng PL7. Bảng thống kê số liệu về sự phát triển (OD 550nm)của 8 chủng AAB trong
7 ngày ở 30oC, 37oC, 38oC, 39oC ............................................................................. PL24

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Cây và quả ca cao ...............................................................................................3
Hình 2. Cấu trúc hóa học của acid acetic ......................................................................11
Hình 3. Vi khuẩn Acetobacter pasteurianus .................................................................18
Hình 4. Vi khuẩn Acetobacter aceti ..............................................................................18
Hình 5. Vi khuẩn Acetobacter xylinum .........................................................................19
Hình 6. Khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường (a), môi trường đối chứng có CaCO3
(b) và không có CaCO3 (c) ............................................................................................25

Hình 7. Một số chủng AAB tạo vòng sáng halo trên môi trường. ................................25
Hình 8. Hình dạng vi khuẩn và hình nhuộm Gram trên kính hiển vi ............................27
ở độ phóng đại 100X của một số chủng AAB ..............................................................27
Hình 9: Sự biến đổi màu môi trường chỉ thị sau 48 giờ. Màu vàng (a) là
Gluconobacter, màu xanh lục (b) là Acetobacter, màu xanh lam (c) là môi trường đối
chứng .............................................................................................................................27
Hình 10. Sự biến đổi màu chỉ thị của một số vòng AAB ở 24 giờ (a) ..........................30
và môi tường đối chứng (b) ...........................................................................................30
Hình 11. Thử khả năng phát triển của 6 chủng AAB ở các nồng độ acid acetic khác
nhau: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5% và 3,0% .............................................................33
Hình 12. Thử khả năng chịu nhiệt của 6 chủng AAB ở 30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC
và 45oC ..........................................................................................................................35
Hình 13. Hàm lượng acid của 8 chủng AAB ở 30oC ....................................................37
Hình 14. Sự phát triển của 8 chủng AAB ở 30oC .........................................................37
Hình 15. Hàm lượng acid của 8 chủng AAB ở 37oC ....................................................38
Hình 16. Sự phát triển của 8 chủng AAB ở 37oC .........................................................39
Hình 17. Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 38oC ....................................................40
Hình 18. Sự phát triển của 4 chủng AAB ở 38oC .........................................................41
Hình 19. Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 39oC ....................................................41
Hình 20. Sự phát triển của 4 chủng AAB ở 39oC .........................................................42

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
AAB

Vi khuẩn acid acetic

v/v

Thể tích/Thể tích

w/v

Khối lượng/Thể tích

EEA

Etylen glycol monoetyl eter acetate

EBA

Etylen glycol mono-butyl eter acetate

PMA

Propylen glycol mono-metyl eter acetate

TPA

Acid terephthalic

PET

Polyetylen terephthalate

ADH

Alcohol dehydrogenase

ALDH

Aldehyde-dehydrogenase

NADP

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

YPGD

môi trường gồm Yeast extract, Pepton, Glycerol, D-glucose

PL

Phụ lục

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

vii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, acid hữu cơ không chỉ ứng dụng trong công nghệ thực phẩm mà còn
ứng dụng nhiều trong công nghiệp như: công nghiệp tổng hợp hữu cơ, công nghiệp
thực phẩm, công nghiệp chế biến mủ cao su,… nên nhu cầu sử dụng ngày càng tăng,
đặc biệt là acid acetic. Acid acetic được dùng nhiều trong sản xuất các sản phẩm như:
giấm, L-sorbose, dihydroxyacetone, D-gluconate, keto-D-gluconate (Matsushita,
2009),… Ở nước ta việc sản xuất acid acetic chủ yếu chỉ bằng phương pháp truyền
thống với quy mô nhỏ phục vụ cho công nghiệp thực phẩm. Với quy mô này thì không
thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng acid acetic ngày càng tăng ở nước ta trong các
ngành công nghiệp, nhất là công nghiệp chế biến mủ cao su.
Lên men giấm (vinegar) hay lên men acid acetic đã được biết đến từ nhiều thế kỷ
trước bằng quá trình lên men tự nhiên từ dung dịch có chứa ethanol. Các vi khuẩn lên
men giấm đầu tiên được phát hiện là Acetobacter aceti (Beijerinck năm 1898) và
Gluconobacter suboxydans (Kluyver và de Leeuw năm 1924) (Saeki et al., 1997).
Acid acetic có thể dùng trực tiếp trong các bữa ăn gọi là giấm ăn. Do thành phần
chủ yếu của giấm là acid acetic nên có khả năng diệt khuẩn cao, ngoài ra còn chứa một
số acid hữu cơ khác như acid lactic, acid malic, acid citric,… nên có thể phòng trị hiệu
quả một số bệnh như viêm gan, xơ gan, các bệnh về đường hô hấp, đường ruột, giúp
tiêu hóa tốt,… Giấm không chỉ giúp làm món ăn thêm ngon mà còn giữ thành phần
dinh dưỡng trong thực phẩm được giữ nguyên vẹn, ngoài ra, giấm còn có tác dụng
tăng tính đàn hồi, làm chậm quá trình lão hóa, Mới đây, các nhà khoa học Venezuela
đã phát hiện thấy acid acetic có khả năng chống lại vi trùng lao và các vi khẩn kháng
thuốc khác (baomoi.com, 02/03/2014). Giấm còn được dùng để sản xuất chất màu,

chất thơm, dung môi hữu cơ, tổng hợp chất dẻo,… (Lương Đức Phẩm, 1998). Có
nhiều loại giấm được sản xuất trên thế giới tùy thuộc vào loại nguyên liệu, công nghệ
và mục đích sử dụng.
Acid acetic được sản xuất theo cả hai phương pháp: phương pháp sinh học
(chiếm khoảng 10% sản lượng thế giới) và phương pháp tổng hợp (chiếm khoảng
75%). Ngày nay, việc sản xuất acid acetic bằng phương pháp sinh học thì đang được
chú trọng. Chủ yếu là bằng phương pháp lên men. Các sản phẩm lên men acid acetic

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

này nhờ vào một nhóm vi khuẩn gọi chung là vi khuẩn acid acetic (Acetic Acid
Bacteria, AAB).
Trong những năm gần đây, việc gia tăng nhiệt độ toàn cầu làm xã hội có một số
thách thức nghiêm trọng trong việc lên men với quy mô công nghiệp vì những hệ
thống làm lạnh lớn tiêu tốn nhiều năng lượng để giữ ở nhiệt độ tối ưu. Vì vậy, việc
phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu nhiệt lên men acid acetic thu hút nhiều sự
quan tâm vì nó mang lại lợi nhuận rất lớn cho xã hội. Qua đó có thể tiến tới quy trình
sản xuất giấm và các sản phẩm lên men từ AAB ở quy mô công nghiệp mang lại hiệu
quả kinh tế cao cho nhà sản xuất, an toàn cho sức khỏe đồng thời giảm giá thành cho
người tiêu dùng. Bên cạnh đó, việc phân lập và định danh các chủng AAB cũng góp
phần làm phong phú thêm nguồn đa dạng sinh học, đặc biệt là nguồn vi sinh vật. Từ

đó có thể định danh sơ bộ các chủng AAB có đặt tính tốt và tiến tới việc sản xuất
giống thuần chủng cung cấp cho các cơ sở sản xuất.
Ở Việt Nam, do điều kiện khí hậu phù hợp cho việc trồng ca cao xen canh với
các loại cây khác, nên diện tích ca cao ngày mở rộng. Quá trình lên men ca cao có
nhiệt độ lên men lên đến 45-50oC, là nguồn nguyên liệu có thể phân lập các chủng
AAB có khả năng chịu nhiệt cao. Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid
acetic chịu nhiệt từ ca cao” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài
Đề tài nhằm phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ ca
cao có khả năng lên men acetic.
Nội dung thực hiện:
- Phân lập vi khuẩn acid acetic từ ca cao.
- Xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn acid acetic.
- Thử khả năng chịu nhiệt và chịu acid của các chủng vi khuẩn acid acetic.
- Thử hoạt tính lên men của acid acetic ở nhiệt độ cao.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về ca cao
2.1.1. Cây ca cao

Hình 1. Cây và quả ca cao
(*Nguồn: Hermann A. Juren Pohlan và Valentin Díaz Pérez,2011)

Cây ca cao (Theobroma cacao) có nguồn gốc từ rừng rậm ở vùng Amazon (Nam
Mỹ), chúng thường phát triển ở nơi có bóng râm và độ ẩm cao nhưng các giống ca cao
hoang dại cũng thấy xuất hiện từ Mexico đến Peru. Ca cao được trồng trong một thời
gian dài bởi người Mayas và người Aztec, sau đó chúng được đưa đến Châu Âu
(Wood et al., 2001). Năm 1753, ca cao được phân loại và đặt tên bởi nhà thực vật học
người Thụy Điển là Carolus Linnaeus với tên khoa học là Theobroma cacao, thuộc họ
Sterculiaceae. Theo tiếng La tinh, từ “Theobroma” có nghĩa là “ thực phẩm của thần
linh”.
Ca cao chỉ phát triển giới hạn ở một số vùng địa lý giới hạn, ở khoảng vĩ độ 20
về cực Bắc và Nam tính từ đường xích đạo. Đặc biệt là Tây Phi (chiếm khoảng 72%
tổng sản lượng ca cao trên thế giới), trong đó chủ yếu là ở các nước: Cote d’Ivoire,
Ghana và Nigeria. Tiếp theo là khu vực Châu Á Thái Bình Dương (chiếm khoảng
15%). Cuối cùng là khu vực Trung và Nam Mỹ (chiếm khoảng 13%) (Phạm Hồng
Đức Phước, 2006). Tổng sản lượng ca cao hàng năm đạt gần 3,5 triệu tấn (ICCO,
2007).
Cây ca cao có ưu thế vượt trội là có thể trồng xen với nhiều loại cây như dừa, hồ
điều, cà phê, chuối, đồng thời có khả năng chịu hạn và chống xói mòn cao nên rất
thích hợp với điều kiện tự nhiên và thổ nhưỡng ở các tỉnh phía Nam và Tây Nguyên
của Việt Nam. Do đó, từ những năm 1974, người Pháp đã cử chuyên gia sang trồng
Chuyên ngành Vi Sinh vật học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

thử nghiệm. Hiện nay, do việc trồng xen canh cây ca cao với các loại cây khác đem lại
hiệu quả kinh tế cao nên diện tích trồng ca cao phát triển rất nhanh. Theo báo cáo của
Ban Điều phối Phát triển ca cao Việt Nam (VCC), tính đến tháng 6/2011 tổng diện
tích ca cao cả nước đạt khoảng 20.589 ha, tăng 4.404 ha so với năm 2010. Hiện tại, Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam đã đề ra mục tiêu đến năm 2015 diện
tích ca cao cả nước sẽ đạt 60.000 ha ca cao và đến năm 2020 sẽ đạt 80.000 ha. Sản
lượng ca cao dự đoán sẽ đạt được khoảng 52.000 tấn vào năm 2015 và 108.000 tấn
vào năm 2020.
Bảng 1. Sản lượng hạt ca cao trên thế giới (nghìn tấn)
2011/12

2012/13
(ước lượng)

2013/14
(dự đoán)

Châu Phi

2919

2820

2942

Cameroon

207

225

210

Côte d'Ivoire

1486

1449

1550

Ghana

879

835

870

Nigeria

235

225

220

Các nước Châu Phi khác

113

86

92

Châu Mỹ

655

626

666

Brazil

220

185

200

Ecuador

198

192

210

Các nước Châu Mỹ khác

237

249

256

Châu Á và Châu Đại Dương

511

496

496

Indonesia

440

420

410

Papua New Guinea

39

36

110

Nước khác

33

40

46

4.085

3.942

4.104

Quốc gia

Tổng sản lượng thế giới

(*Nguồn: ICCO Quarterly Bulletin of Cocoa Statistics, Vol. XL, No. 1, Cocoa year 2013/14)

2.1.2. Các giống ca cao trên thế giới
Hiện nay, ca cao được chia ra làm 3 nhóm lớn: Criollo, Forastero và Trinitario.
Các đặc điểm chính của 3 nhóm được chia ở Bảng 2.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

Bảng 2. Những đặc tính khác nhau giữa giống Criollo, Forastero và
Trinitario
Các đặc điểm chính
Dạng quả
Vỏ quả
Cấu trúc
Màu sắc
Hoa

Hạt
Số hạt/quả
Tiết diện hạt
Màu diệp tử

Criollo

Forastero

Trinitario

Quả dài

Quả tròn,
Hình bầu dục

Quả dài

Mềm
Đỏ
(cũng có quả màu xanh)

Cứng
Xanh
(chín thì vàng)

Nhụy hồng nhạt

Nhụy màu tím

20-30
Gần tròn
Trắng ngà
hoặc tím rất nhạt

>30
Dẹp
Tím,
tím đậm

>30

Dẹp
Thay đổi,
đôi khi có
hạt màu trắng

Kém
Kém

Mạnh
Tốt

Trung bình
Trung bình

Thấp

Cao

Trung bình

1,5

93,5

5,0

Đặc điểm nông học
Khả năng sinh trưởng
Khả năng kháng sâu
bệnh

Chất béo
% tổng sản lượng

Hầu hết cứng
Thay đổi

(*Nguồn: Nguyễn Văn Uyển và Nguyễn Tài Sum, 1996; Hà Thanh Toàn et al., 2008)

2.1.3. Công dụng của ca cao
a. Hạt ca cao
Bộ phận chính được sử dụng của cây ca cao là hạt (bean). Hạt ca cao sau khi
rang được xay thành bột nhão ca cao. Khi ép bột nhão ta tách được bơ và bánh dầu ca
cao. Xay nhuyễn bánh dầu ca cao cho ra bột ca cao (Phạm Hồng Đức Phước, 2006).
Bột nhão, bơ và bột ca cao là nguyên liệu chính cho công nghiệp bánh kẹo thực
phẩm. Chocolate là sự pha trộn giữa bột nhão, bơ, đường và các nguyên liệu khác tùy
theo công thức riêng của mỗi nhà sản xuất (Phạm Hồng Đức Phước, 2006).
b. Các bộ phận khác của ca cao

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

Vỏ quả ca cao chứa 3-4% kali trên trọng lượng chất khô, là nguồn phân bón giàu

kali. Ngoài ra, vỏ quả ca cao còn được phơi khô, xay thành bột trộn vào thức ăn hoặc
vo viên.
Lớp cơm nhầy bao quanh hạt ca cao (cocoa pulp) có thể dùng làm nước sinh tố
(cocoa juice), mứt đông (cocoa jam), giấm (vinegar), hoặc cô đặc làm nước cốt trái
cây (liquor of cocoa juice) (Schwan et al., 2004).
Lá ca cao còn là nguồn thức ăn tốt cho dê, bò và thỏ.
Các hạt ca cao có cơ quan gọi là thai tòa (lõi quả). Khi tách hạt ca cao để lên
men, thai tòa được loại bỏ là nguồn thức cho cá và heo.
Dịch thu từ quá trình lên men được dùng để chế biến rượu ca cao. Ngoài ra dịch
cũng có thể sử dụng như nguyên liệu thay thế thạch dừa trong kỹ thuật sản xuất thạch
dừa (Phạm Hồng Đức Phước, 2006).
2.1.4. Sơ lược về quy trình lên men ca cao
a. Thu hoạch
Cây ca cao trồng qua năm thứ 3 thì bắt đầu cho quả. Thời gian đậu quả cho đến
khi quả chín mất khoảng 2-3 tháng.
Khi chín thì vỏ ca cao đổi màu. Các quả có màu xanh lục khi chín đổi sang màu
vàng tươi. Các quả có màu ửng đỏ khi chín có màu cam sậm. Các quả có màu tím lợt
khi chín có màu tím đậm.
Lúc thu hoạch chỉ nên hái những quả có dấu hiệu chín, không nên hái những quả
chưa chín vì các loại này có hàm lượng trong cơm thấp, khi ủ khó lên men nên phẩm
chất kém và năng suất hạt thấp. Tuy nhiên, không nên để quả quá lâu trên cây vì hạt sẽ
nảy mầm ngay trong quả, làm phẩm chất hạt giảm sút.
Có thể hái quả bằng cách dùng dao bén cắt phần cuống. Sau đó bóc vỏ ca cao để
lấy hạt. Người ta lấy dao bổ quả ca cao theo chiều dọc và dùng tay để lấy hạt. Không
nên dùng dao để lấy hạt vì rất dễ làm dập hạt, làm giảm giá trị của sản phẩm.
b. Lên men (ủ) ca cao
Quá trình lên men (ủ) có ảnh hưởng lớn đến chất lượng hạt ca cao cũng như
những sản phẩm làm từ ca cao. Đây là khâu quan trọng nhất trong quá trình sơ chế ca
cao. Quá trình lên men có thể tiến hành bằng nhiều phương pháp như ủ thúng (cần xé),
ủ đống và đậy bằng lá chuối và ủ thùng (CARD 013/VIE05, 2008).

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

Quá trình ủ phải được thực hiện ngay trong 24 giờ. Trước khi đem ủ phải phân
loại hạt theo kích thước để hạt dễ lên men hơn. Quá trình ủ nhằm mục đích loại bỏ hết
phần cơm (pulp) bao bọc xung quanh hạt ca cao và làm chết mầm hạt (radicle)
(Schwan et al., 2004) hay diệt chất phôi nha để hạt không còn nảy mầm được nữa
(Nguyễn Minh Thủy, 2000).
Quá trình lên men cũng góp phần làm giảm vị đắng (bitterness), chát
(astringency) và tạo các tiền chất của hương ca cao (flavour precursor) do khởi đầu
cho những thay đổi sinh hóa học trong nội mô phôi nhủ (Sandra et al., 2007).
Sự lên men của hạt thường xảy ra theo hai quá trình:
- Quá trình thứ nhất bao gồm sự phân giải yếm khí các chất nhầy chứa đường,
bột của cùi bao bọc xung quanh hạt.
- Quá trình thứ hai là sự lên men bên trong bao gồm các loại phản ứng phức tạp,
các tử diệp co rút lại từ áo hạt và biến đổi màu sắc.
Trong quá trình ủ cần lưu ý, đối với giống Forastero và Trinitario thường lên
men trong khoảng 3-7 ngày, còn đối với giống Criollo chỉ cần ủ 2-3 ngày.
c. Phơi nắng hoặc sấy khô
 Phơi nắng, phơi tự nhiên
Sau quá trình lên men, phơi sấy cũng là bước quan trọng trong chế biến ca cao.
Quá trình này, cùng với quá trình ủ nhằm mục đích khử nước, làm gia tăng các phản

ứng giữa các thành phần trong hạt và sự thủy phân enzyme (Nguyễn Minh Thủy,
2000).
Phương pháp đơn giản nhất là trải hạt ca cao ra thành những lớp mỏng, phơi trực
tiếp trên sàn bê tông hoặc gỗ. Thời gian phơi dưới nắng mặt trời khoảng 2-3 ngày, 30
phút đảo đều một lần.
Các thành phần của hạt ca cao có sự thay đổi đáng kể sau quá trình ủ và phơi,
được thể hiện ở Bảng 3.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

Bảng 3. Sự thay đổi các thành phần hạt Forastero sau quá trình ủ và phơi
Thành phần

Hạt trước khi ủ (%)

Hạt sau khi ủ (%)

Nước

32-36

5- 7

Đạm toàn phần

5-7

11-13

Lipid

31-33

46- 48

Đường khử

0,3-0,5

0,1- 0,2

Sucrose

1,8-2,1

0.0

Tinh bột

9-10

7- 9

Sợi thô

10-12

19- 21

Acid acetic

0,0

0,8- 1,0

(*Nguồn: Nguyễn Văn Uyển và Tài Sum, 1996)

 Sấy khô
Thực hiện quá trình sấy khi điều kiện phơi không thích hợp như ít nắng, mưa kéo
dài hay không có sân phơi.
Thời gian sấy khoảng 8 giờ ở nhiệt độ 50oC. Cứ một giờ đảo đều một lần. Hạt đạt
yêu cầu khô là khi hạt có độ ẩm từ 8% trở xuống.
2.1.5. Một số vi sinh vật có trong hạt ca cao lên men
Chất nhầy bao quanh hạt ca cao là môi trường giàu dinh dưỡng cho vi sinh vật.
Chất nhầy chiếm khoảng 82-87% nước, 10-15% đường, 2-3% pentose, 1-3% acid
citric và 1-1,5% pectin. Ngoài ra còn có protein, amino acid, vitamin (nhiều nhất là
vitamin C) và chất khoáng. Ở các vùng khác nhau như Ivory Coast, Nigeria, Malaysia
có sự khác biệt về hàm lượng nước, citrite, hemicellulose, lignin, peptin trong thịt quả
ca cao (Schwan, 2004).
Trong quá trình lên men, các loài vi sinh vật sẽ làm tăng nhiệt độ khối lên men,
làm giảm pH của phôi nhũ từ 6,5 xuống còn 4,5; lượng acid acetic có thể đạt 2% và

lượng acid lactic tăng từ 0,01 đến 0,22%.
Một số vi sinh vật trong lên men hạt ca cao: nấm men, vi khuẩn acid lactic, vi
khuẩn acid acetic, nấm mốc và một số vi sinh vật khác.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014



Trường Đại Học Cần Thơ

Nấm men

Nấm men là vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men rượu. Trong nấm men có
hệ enzyme amylase và enzyme nội bào. Nấm men phát triển tốt nhất ở 15-25oC, trong
môi trường acid (pH 3,5-4,5). Ở giai đoạn đầu của quá trình lên men cần phải thông
khí vào môi trường để kích thích nấm men sinh trưởng, tăng sinh khối. Đến giai đoạn
lên men chính, cần tạo điều kiện kỵ khí cho sự hình thành rượu.
Vai trò chính của nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao: phân hủy đường,
acid citric; sản xuất ethanol, acid hữu cơ, các chất bay hơi, các mùi, enzyme và tạo
năng lượng.
Đã có 12 loại nấm men được xác định trong quá trình lên men hạt ca cao:
Saccheromyces
Rhodotorula,

cerevisiae,
Candida,

Kluyveromces,
Pichia,

Shizo

Hansenula,

Kloeckera,

saccharomyces,

Tinillopsis,

Saccharomycopsis,

Debaryomyces, Hansenniospora. Trong đó chủ yếu là Saccheromyces cerevisia và
Kluyveromces.


Vi khuẩn acid lactic

Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu (hoặc hình oval) và hình que. Đường kính của
các loại cầu khuẩn từ 0,5-1,5 µm. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 µm. Phân
loại theo hình dáng tế bào thì cầu khuẩn xếp vào các giống Streptococcus và
Leuconostoc, trực khuẩn thuộc giống Lactobacillus.
Có hai dạng lên men lactic: đồng hình (điển hình) và dị hình (không điển hình).

Vi khuẩn lactic lên men đồng hình nhiệt độ tối ưu trong khoảng 49-51oC. Vi
khuẩn lactic lên men dị hình nhiệt độ tối ưu trong khoảng 37-38oC.
Vi khuẩn lactic hiện diện ngay khi bắt đầu lên men mặc dù nấm men chiếm ưu
thế. Hoạt động của nấm men bị ức chế bởi nồng độ cồn cao, pH gia tăng và hiếu khí
mạnh. Khi điều kiện phù hợp, vi khuẩn lactic chiếm ưu thế nhưng chỉ trong thời gian
ngắn. Chúng biến đổi đường và một số acid hữu cơ (citric và malic) thành acid lactic
và tùy thuộc vào loài Lactobacillus sẽ tạo thành acid acetic, ethanol và CO2.
Vai trò của vi khuẩn acid lactic là: sản xuất acid lactic, acid citric cũng như các
hợp chất khác và tạo năng lượng,….
Nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau được tìm thấy trong hạt ca cao lên men
như: Lactobacillus, Betabacterium, Streptobacterium, Streptococcus,….
Chuyên ngành Vi Sinh vật học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014



Trường Đại Học Cần Thơ

Vi khuẩn acid acetic
Vi khuẩn acid acetic là các trực khuẩn, không sinh bào tử, gram dương và rất

hiếu khí, có thể chuyển động hoặc không. Chúng có tính chịu acid cao, một số vẫn
phát triển ở pH 3,2. Nhiệt độ tối thích đối với sự sinh trưởng của các vi khuẩn acid
acetic nằm trong khoảng 20-35oC.

Các loại vi khuẩn lên men acid acetic xuất hiện rất sớm và bền bỉ đến khi kết
thúc quá trình lên men, phát triển sau nấm men và có vai trò trong quá trình oxy hóa
ethanol thành acid acetic và quá trình oxy hóa acid acetic thành CO2 và nước, gia tăng
nhiệt độ khối hạt lên men.
Các loài vi khuẩn acid acetic thường thấy trong ca cao lên men:
Acetobacterraner, A. ascendens, A. suboxydans, A. xylinodes, A. orleanense,
Gluconobacter oxydans,….


Nấm mốc
Nấm mốc ca cao có rất nhiều loại, thường gặp là Aspergillus, cụ thể như:

Aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus penicilium,
Aspergillus fumagatus, Aspergillus tamari,…


Vi sinh vật khác hiện diện trong quá trình lên men

Độ acid của khối hạt ca cao nguyên liệu, nhiệt độ lên men và quá trình thủy phân
của protein trong phôi nhũ thể hiện cho quá trình chuyển hóa của các vi sinh vật trong
quá trình lên men. Để kết thúc sự lên men, số lượng của các bào tử vi khuẩn gia tăng,
đặc biệt là Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Streptococcus
thermophilus,….
Các chủng vi khuẩn Bacillus được xem là các ảnh hưởng lớn đến sự hình thành
các chất hữu cơ bao gồm 2,3-butanediol, pyrazine, acid acetic và acid lactic trong quá
trình lên men. Chính điều này gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng của hạt ca cao sau
lên men.
Trong hạt ca cao lên men, người ta còn phát hiện nhiều loài nấm sợi như:
Aspergillus, Mucor, Penicillium, Rhizopus,…

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

2.2 Giới thiệu về acid acetic
2.2.1 Giới thiệu chung
Acid acetic (còn gọi là acid ethanoic) là một acid hữu cơ (acid carboxylic), công
thức hóa học là CH3COOH, khối lượng phân tử 60 g/mol. Acid acetic là một acid yếu,
thuộc nhóm acid monoprotic, có tính acid mạnh hơn acid carbonic.
Acid acetic tan tốt trong nước, ethanol, eter, benzene, acetone và chloroform;
không tan trong CS2. Acid acetic rất bền với các chất oxy hóa như acid chromic và
permanganate. Có khả năng hòa tan cellulose, các hợp chất tương tự cellulose, phân
hủy da, gây bỏng da, ăn mòn nhiều kim loại. Nó có thể hòa tan không chỉ trong các
hợp chất phân cực như các muối vô cơ và các loại đường mà còn có khả năng hòa tan
trong các hợp chất không phân cực, các nguyên tố như lưu huỳnh và iod. Acid acetic
có thể ăn mòn các kim loại như sắt, mangan và kẽm sinh ra khí hydro và các muối kim
loại tương ứng gọi là các muối acetate.

Hình 2. Cấu trúc hóa học của acid acetic
(*Nguồn: Ben Mills,2009)

2.2.2. Phương pháp sản xuất
Thế kỷ thứ 8, Jabir Ibn Hayyan (Geber) là người đầu tiên cô đặc acid acetic từ

giấm bằng cách chưng cất. Thế kỷ thứ 16, nhà giả kim thuật Đức, Andreá Libavius đã
mô tả cách chưng cất acid acetic dạng tinh thể được bằng cách chưng cất khô các
acetate kim loại nhất định(loại phổ biến nhất là đồng (II) acetate (Cu(CH3COO)2) và
ông đã so sánh acid acetic tạo ra bằng phương pháp này với từ giấm. Sự có mặt của
nước trong giấm đã làm ảnh hưởng đến tính chất của acid acetic mà các nhà hóa học
trong vài thế kỷ đã cho rằng acid acetic dạng tinh thể và acid acetic trong giấm là hai
chất khác nhau. Năm 1917 nhà hóa học người Pháp Pierre Adet đã chứng minh rằng
chúng là một.

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

Năm 1847, nhà hóa học người Đức, Hermann Kolbe lần đầu tiên tổng hợp acid
acetic từ các vật liệu vô cơ. Chuỗi phản ứng này gồm quá trình clo hóa carbon disulfua
(CS2) thành carbon tetraclorua (CCl4), sau đó là quá trình nhiệt phân thành
tetracloruethylen và clo hóa trong nước tạo thành acid tricloracetic (C2HCl3O2) và cuối
cùng là phản ứng oxy hóa khử vô cơ bằng cách điện phân tạo thành acid acetic.
Năm 1910, phần lớn các acid acetic được sản xuất từ sản phẩm trung gian là
rượu chưng cất từ gỗ. Loại rượu này cho tác dụng với canxi hydroxide tạo ra canxi
acetate, sau đó cho canxi acetate tác dụng với acid sulfuric thu được acid acetic.
Acid acetic chủ yếu được sản xuất theo 2 phương pháp sinh học và tổng hợp,
acid sản xuất theo phương pháp sinh học chỉ chiếm khoảng 10% sản lượng thế giới,

khoảng 75% sản xuất ở quy mô công nghiệp theo phương pháp carbonyl hóa
methanol, 15% còn lại sản xuất theo phương pháp khác.
Tổng sản lượng acid acetic ước tính khoảng 5 triệu tấn/năm, khoảng nửa trong số
đó được sản xuất ở Hoa Kỳ. Sản lượng ở châu Âu khoảng 1 triệu tấn/năm và đang
giảm, trong khi đó Nhật bản sản xuất khoảng 0,7 triệu tấn/năm. Khoảng 1,5 triệu tấn
được tái chiết hàng năm, nâng tổng sản lượng trên thị trường thế giới lên 6,5 triệu
tấn/năm.
2.2.3. Ứng dụng
Acid acetic là một chất phản ứng được dùng để sản xuất các hợp chất hóa học.
Lượng sử dụng riêng lẻ lớn nhất là để sản xuất monomer vinyl acetaye, tiếp theo là sản
xuất acetic anhydrite và ester. Lượng acid acetic dùng để sản xuất giấm là rất nhỏ so
với lượng sử dụng trên.
 Ứng dụng trong sản xuất monomer vinyl acetate
Ứng dụng chủ yếu của acid acetic là sản xuất monome vinyl acetate. Ứng dụng
này tiêu thụ khoảng 40% đến 45% sản lượng acid acetic trên thế giới. Phản ứng có sự
tham gia của etylen với oxy và chất xúc tác là palladi.
2 H3C-COOH + 2 C2H4 + O2 → 2 H3C-CO-O-CH=CH2 + 2 H2O
Vinyl acetate có thể được polyme hóa tạo thành polyvinyl acetate hoặc thành
các polyme khác ứng dụng trong sơn và chất kết dính.
 Ứng dụng trong sản xuất ester

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

Các ester chính sản xuất từ acid acetic được sử dụng chủ yếu làm dung môi
cho mực, sơn và chất phủ. Các ester như ethyl acetate, n-butyl acetate và propyl
acetate, chúng được sản xuất một cách đặc biệt bằng phản ứng có xúc tác từ acid
acetic và rượu tương ứng:
H3C-COOH + HO-R → H3C-CO-O-R + H2O, (R = nhóm ankyl tổng quát)
Tuy nhiên, hầu hết ester acetate được sản xuất từ acetaldehyde bằng phản ứng
Tishchenko. Thêm vào đó, các eter acetate được sử dụng làm các dung môi để loại
bỏ nitrocellulose, sơn acrylic, véc-ni, và chất tẩy gỗ. Đầu tiên, glycol monoete được
tạo ra từ etylene oxit hoặc propylen oxit với rượu, sau đó chúng được ester hóa với
acid acetic. Ba sản phẩm chính là etylen glycol monoetyl eter acetate (EEA), etylen
glycol mono-butyl eter acetate (EBA), và propylen glycol mono-metyl eter acetate
(PMA). Ứng dụng này tiêu thụ khoảng 15-20% sản lượng acid acetic thế giới. Các eter
acetate, ví dụ như EEA, được cho là có hại đối với sức khỏe sinh sản con người.
 Ứng dụng trong sản xuất acetic anhydryde
Sản phẩm tách phân tử nước từ hai phân tử acid acetic tạo thành một phân tử gọi
là acetic anhydryde. Sản xuất acetic anhydryde trên thế giới là một ứng dụng chính
chiếm khoảng 25% đến 30% sản lượng acid acetic toàn cầu. Acetic anhydryde có thể
được sản xuất trực tiếp bằng carbonyl hóa methanol từ acid, và các nhà máy sản xuất
theo công nghệ Cativa có thể được điều chỉnh để sản xuất anhydryde.
Acetic anhydride là một chất acetyl hóa mạnh. Vì vậy, ứng dụng chính của nó là
tạo cellulose acetate, một chất dệt tổng hợp cũng được dùng trong phim chụp ảnh.
Acetic anhydride cũng là một chất phản ứng dùng để sản xuất aspirin, heroin và các
hợp chất khác.
 Giấm
Ở dạng giấm, các dung dịch acid acetic (nồng độ khối lượng của acid 4% đến
18%) được dùng trực tiếp làm gia vị, và cũng làm chất trộn rau và trong các thực
phẩm khác. Giấm ăn (table vinegar) thì loãng hơn (4% đến 8%), trong khi loại giấm
trộn thương mại thì nồng độ cao hơn. Lượng acid acetic dùng làm giấm không chiếm

tỉ lệ lớn trên thế giới, nhưng là một ứng dụng nổi tiếng và được dùng từ rất lâu.
 Làm dung môi

Chuyên ngành Vi Sinh vật học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

Acid acetic là một dung môi protic phân cực tốt như đề cập ở trên. Nó thường
được dùng làm dung môi tái kết tinh cho các hợp chất hữu cơ tinh khiết. Acid acetic
tinh khiết được dùng làm dung môi trong việc sản xuất acid terephthalic (TPA), một
nguyên liệu thô để sản xuất polyetylen terephthalate (PET). Năm 2006, khoảng 20%
acid acetic được dùng để sản xuất TPA.
Acid acetic thường được dùng làm dung môi cho các phản ứng liên quan
đến cacbocation, như Friedel-Crafts alkylation. Ví dụ, một giai đoạn trong sản
xuất long não tổng hợp thương mại liên quan đến sự tái sắp xếp WagnerMeerwein của tạo amfen isobornyl acetate; ở đây acid acetic đóng vai trò vừa là dung
môi, vừa là chất ái nhân để giữ carbocation tái sắp xếp. Acid acetic là dung môi tự
chọn khi giảm một nhóm nitơ aryl tạo anilin bằng cách sử dụng cacbon mang palladi.
Acid acetic được sử dụng trong hóa phân tích để ước tính các chất có tính bazơ
yếu như các amide hữu cơ. Acid acetic có tính bazơ yếu hơn nước, vì vậy amide thể
hiện như một bazơ mạnh trong dung dịch acid trung bình này. Sau đó nó có thể được
chuẩn độ bằng cách sử dụng một dung dịch acid acetic bằng của một acid mạnh
như acid percloric.
 Ứng dụng trong chế biến mủ cao su

Để chống đông mủ cao su, thường dùng NH3 3%. Sau khi pha loãng và khuấy
trộn mủ với NH3, thường cho thêm vào dung dịch acid acetic 2,5% với lượng là 3,5-10
kg/tấn dung dịch mủ cao su.
2.3 Tổng quan về quá trình lên men của vi sinh vật
2.3.1 Bản chất của quá trình lên men
Công nghệ lên men từ vi sinh vật là công nghệ vi sinh và cũng chính là một trong
các ngành quan trọng của công nghệ sinh học. Công nghệ lên men vi sinh là một quá
trình được ứng dụng nhiều trong sản xuất tạo ra các sản phẩm bằng kỹ thuật lên men
với sự tham gia của các chủng vi sinh vật khác nhau.
Quá trình lên men là một quá trình sinh học diễn ra liên tục, bắt đầu từ khâu tạo
giống nhân giống sinh khối, lên men và thu nhận sản phẩm cuối cùng và các giai đoạn
này có liên quan mật thiết với nhau, ảnh hưởng qua lại lẫn nhau và hàng loạt các sản
phản ứng sinh hóa diễn ra với sự tham gia xúc tác của các hệ enzyme vốn được sinh ra
từ các chủng vi sinh vật tham gia trong quá trình.
Chuyên ngành Vi Sinh vật học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

Bản chất của công nghệ lên men là những phản ứng oxy hóa khử sinh học, oxy
hóa các hợp chất hữu cơ ở cơ thể sinh vật do các hệ enzyme oxy hóa khử cung cấp.
Các quá trình này diễn ra trong điều kiện yếm khí hoặc hiếu khí.
Tùy theo hệ enzyme tham gia vào quá trình lên men và tùy thuộc vào chủng vi sinh mà
người ta chia quá trình lên men thành ba nhóm chính.

-

Lên men nhờ vi khuẩn như lên men acetic, lactic, butylic,…

-

Lên men nhờ nấm mốc như lên men acid citric, gluconic,…

-

Lên men nhờ nấm men như lên men bia, rượu, men bánh mì,…
2.3.2. Quá trình lên men acid acetic
Acid acetic (CH3COOH) có thể thu được bằng phương pháp tổng hợp hóa học và

lên men sinh học. Acid này dùng trong sản xuất chất màu, chất thơm, dung môi hữu
cơ, ướp chua rau củ, chế biến thực phẩm,… Acid acetic dùng trong trực tiếp trong các
bữa ăn gọi là giấm ăn. Đó là sản phẩm lên men acid acetic. Quá trình lên men nhờ một
nhóm vi khuẩn gọi chung là vi khuẩn acid acetic, chúng oxy hóa ethanol thành acid
acetic.
O2

CH3CH2OH + O2

CH3COOH + H2O

Thực chất của quá trình này là sự lên men oxy hóa (oxidative fermentation) gồm
hai phản ứng của 2 enzyme nằm trên màng tế bào của AAB xúc tác là Alcoholdehydrogenase (ADH) và Aldehyde-dehydrogenase (ALDH).
Hydrogen được nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) nhận và
qua các cytochrome của chuỗi hô hấp được chuyển cho O2 (chấp nhận). Từ trước đến
nay, quá trình lên men acid acetic thuộc lên men hiếu khí nhưng thực chất đây là một

quá trình chuyển hóa: vi sinh vật sử dụng cơ chất ethanol và chuyển thành acid acetic.
Methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH2) xuất hiện trong quá trình này có lẽ
được chuyển hóa qua chuỗi hô hấp để thu năng lượng. Quá trình này cũng được coi là
oxy hóa không hoàn toàn. Cơ chất được phân giải không hoàn toàn, trong khi oxy là
chất nhận hydro (Lương Đức Phẩm, 1998).
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Từ dịch đường bằng phương pháp lên men ta có thể thu được nhiều sản phẩm
khác nhau. Mỗi loại vi sinh vật có thể cho một hoặc nhiều sản phẩm khác nhau tùy
Chuyên ngành Vi Sinh vật học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014

Trường Đại Học Cần Thơ

theo điều kiện môi trường hoặc một loại sản phẩm có thể thu được từ nhiều loại vi
sinh vật khác nhau.
Nhìn chung các quá trình lên men dù khác nhau về cơ chế, về điều kiện lên men
nhưng đều có thể bị ảnh hưởng nhất định bởi môi trường.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với chủng
ưu nhiệt trung bình, thì nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối và lên men là 3032oC. Ở những nhiệt độ không thích hợp, hoạt tính enzyme giảm hẳn và đôi khi xảy ra
hiện tượng lên men phức tạp.
 Ảnh hưởng của pH
Nồng độ ion H+ trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi sinh
vật. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc

giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên
men. Đối với vi khuẩn lactic, khi pH nhỏ hơn 4 thì vi khuẩn ngừng hoạt động trong
khi nấm men vẫn hoạt động bình thường và phát triển mạnh.
 Ảnh hưởng nồng độ dịch lên men
Nồng độ dịch lên men là cơ chất của quá trình lên men. Nếu nồng độ đường quá
cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của
vi sinh vật. Bình thường dịch lên men có nồng độ chất tan từ 16-18% tương đương với
khoảng 15% đường đối với quá trình lên men rượu và khoảng 10% đường đối với quá
trình lên men lactic.
Ngoài các yếu tố trên, lượng oxy cũng ảnh hưởng rất lớn đến các quá trình lên
men, nó quyết định chiều hướng lên men diễn ra theo kiểu kỵ khí hay hiếu khí và do
đó dẫn đến sự tạo thành sản phẩm là khác nhau.
2.4 Vi khuẩn acid acetic
2.4.1. Giới thiệu vi khuẩn acid acetic
Hiện nay người ta đã biết tới hơn 20 loài AAB, những vi khuẩn này dễ tìm thấy
trong không khí, đất và nước. Vì vậy, các dịch nước quả, bia, rượu thấp, dịch
đường,… để hở tiếp xúc với không khí dễ bị vẫn đục nhẹ, trên mặt tạo thành 1 lớp
màng mỏng, mịn, màu trắng xám hoặc vàng xám. Đó là do các vi khuẩn acid acetic
phát triển. Trước đây, Pasteur cho rằng quá trình lên men giấm là do một loại vi sinh
Chuyên ngành Vi Sinh vật học

16

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học