nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm vi rút npv spl (nucleo polyhedrosis virus spodoptera litura) trên tế bào sâu khoang (spodoptera litura )
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (29.1 MB, 104 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------
-------
NGUYỄN THỊ NGA
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG LÂY NHIỄM VI RÚT
NPV- Spl (Nucleo polyhedrosis virus - Spodoptera litura)
TRÊN TẾ BÀO SÂU KHOANG (Spodoptera litura )
LUẬN VĂN THẠC SĨ
HÀ NỘI – 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------
-------
NGUYỄN THỊ NGA
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG LÂY NHIỄM VI RÚT
NPV- Spl (Nucleo polyhedrosis virus - Spodoptera litura)
TRÊN TẾ BÀO SÂU KHOANG (Spodoptera litura )
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. LÊ VĂN TRỊNH
TS. NGUYỄN HỮU ĐỨC
HÀ NỘI – 2014
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố
trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã
được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Nga
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này
tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Lê Văn Trịnh –
Giám đốc Trung tâm Đấu tranh sinh học và Ban Giám đốc Viện Bảo vệ
thực vật đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, luôn tận tình hướng dẫn và
truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu
và viết luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Hữu Đức – Phó
Trưởng Khoa Công nghệ Sinh học, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học
Động vật – Học Viện nông nghiệp Việt Nam đã luôn tận tình giúp đỡ tôi
trong quá trình hoàn thành luận văn.
Để thực hiện được nghiên cứu này, tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ, tạo
điều kiện của các bạn đồng nghiệp, các cán bộ và lãnh đạo Trung tâm Đấu
tranh sinh học và Viện Bảo vệ thực vật.
Với tình cảm sâu sắc, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ và giúp đỡ của các
Thầy, Cô giáo thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công
nghệ sinh học – Học Viện nông nghiệp Việt Nam trong quá trình thực hiện
luận văn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các Thầy, Cô giáo, các chuyên viên Ban quản
lý đào tạo – Học Viện nông nghiệp Việt Nam đã ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ
tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết để bảo vệ thành công luận văn này.
Hà Nội, năm 2014
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Nga
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ ii
MỤC LỤC............................................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ viii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................... ix
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.
Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu
1
2.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
3
3.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3
CHƯƠNG I CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................... 5
1.1.
Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
5
1.2.
Những nghiên cứu ở nước ngoài
6
1.2.1. Vài nét về sâu khoang (Spodoptera litura)
6
1.2.2. Vi rút diệt côn trùng và vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus)
7
1.2.3. Kỹ thuật phân lập và làm thuần vi rút NPV trong phòng trừ sâu hại
16
1.2.4. Kỹ thuật bảo quản vi rút NPV
17
1.2.5. Kỹ thuật lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào sâu khoang
18
1.3.
20
Những nghiên cứu trong nước
1.3.1. Nghiên cứu về thu thập và phân lập vi rút NPV
21
1.3.2. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học từ vi rút NPV
22
CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................ 26
2.1.
Đối tượng, phạm vi và dụng cụ, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
26
26
Page iii
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
26
2.1.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
26
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
27
2.2.
Nội dung nghiên cứu của đề tài
27
2.2.1. Nghiên cứu phân lập, làm thuần và chọn lọc tạo thực liệu vi rút
NPV có hoạt lực cao đối với sâu khoang
27
2.2.2. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu non sâu khoang của các nguồn
NPV đã được lựa chọn
27
2.2.3. Lây nhiễm nhân tạo vi rút NPV trên tế bào sâu khoang
28
2.3.
28
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu phân lập, làm thuần và chọn lọc tạo thực liệu vi rút
NPV có hoạt lực cao đối với sâu khoang
28
2.3.2. Nghiên cứu lây nhiễm vi rút NPV sâu khoang trên tế bào sâu
2.4.
khoang đã nhân nuôi
32
Phương pháp xử lý số liệu
35
CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................... 37
3.1.
Nghiên cứu phân lập, làm thuần và chọn lọc tạo thực liệu vi rút
NPV có hoạt lực cao đối với sâu khoang
37
3.1.1. Thu thập sâu khoang nhiễm vi rút NPV ngoài đồng
37
3.1.2. Phân lập và chọn lọc nguồn thực liệu vi rút NPV có hoạt lực cao
38
3.1.3. Kiểm định nguồn vi rút NPV qua phân tích PCR và hiển vi điện tử
56
3.1.4. Hiệu lực gây chết sâu non sâu khoang của các nguồn NPV sâu
3.3.
khoang đã được lựa chọn
58
Lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào sâu khoang đã nhân nuôi
62
3.3.1. Xác định nồng độ tế bào thích hợp cho lây nhiễm
62
3.3.2. Xác định nồng độ vi rút thích hợp cho lây nhiễm
63
3.3.3. Xác định thời gian ủ lây nhiễm vi rút thích hợp
64
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv
3.3.4. Xác định môi trường thích hợp cho lây nhiễm
65
3.3.5. Xác định nhiệt độ thích hợp cho lây nhiễm
67
3.3.6. Xác định pH môi trường thích hợp cho lây nhiễm
68
3.3.7. Kiểm định vi rút NPV được nhân trên tế bào
69
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 74
1.
Kết luận
74
2.
Đề nghị
74
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 75
PHỤ LỤC
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v
DANH MỤC BẢNG
STT
3.1
Tên bảng
Trang
Số cá thể sâu khoang có biểu hiện nhiễm vi rút NPV đã thu thập
ngoài đồng ruộng (Hà Nội, 2013)
37
3.2
Số lượng mẫu sâu khoang nhiễm vi rút NPV sau khi phân lập
39
3.3
Hiệu lực gây chết sâu khoang của các nguồn vi rút NPV
41
3.4
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
NPV1 sau phân lập lần 1
3.5
42
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
vi rút từ NPV2 sau phân lập lần 1
3.6
43
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi của các nguồn vi rút từ
NPV3 sau phân lập lần 1
3.7
44
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
vi rút có tiềm năng từ NPV1 sau phân lập lần 2
3.8
45
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của nguồnvi
rút có tiểm năng từ NPV2 sau phân lập lần 2
3.9
46
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
vi rút có tiềm năng từ NPV3 sau phân lập lần 2
3.10
47
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
vi rút từ NPV1 sau phân lập lần 3
3.11
48
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
vi rút từ NPV2 sau phân lập lần 3
3.12
49
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
vi rút từ NPV3 sau phân lập lần 3
3.13
50
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
vi rút từ NPV1 sau phân lập lần 4
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
52
Page vi
3.14
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
vi rút từ NPV2 sau phân lập lần 4
3.15
53
Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn
vi rút NPV3 sau phân lập lần 4
3.16: Các nguồn vi rút NPV sâu khoang tiềm năng
54
đã được chọn lọc
sau 4 lần phân lập
55
3.17
Ký hiệu tên nguồn vi rút NPV sâu khoang đã được lựa chọn
55
3.18
Hiệu lực gây chết sâu khoang và mật độ thể vùi hình thành của
các nguồn vi rút NPV
60
3.19
Hoạt lực trừ sâu khoang của NPV từ tế bào và NPV trên sâu hại
61
3.20
Hàm lượng thể vùi khi nhiễm vi rút TL1 với các nồng độ tế bào
khác nhau
3.21
63
Hàm lượng thể vùi khi nhiễm vi rút TL1 với các nồng độ vi rút
khác nhau
64
3.22
Hàm lượng thể vùi ở các thời gian ủ lây nhiễm khác nhau
65
3.23
Hàm lượng vi rút ở các môi trường nuôi cấy tế bào khác nhau khi
lây nhiễm
66
3.24
Hàm lượng vi rút ở các nhiệt độ ủ lây nhiễm vi rút khác nhau
67
3.25
Hàm lượng vi rút ở các mức pH môi trường lây nhiễm vi rút
khác nhau
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
68
Page vii
DANH MỤC HÌNH
STT
1.1
Tên hình
Trang
Sâu khoang khoẻ mạnh (A) và sâu khoang chết do nhiễm vi rút
NPV (B)
9
1.2
Chu trình tồn tại và phát triển của vi rút NPV trong tự nhiên
11
1.3
Các dạng Baculovirus (A) và thể vùi của vi rút (B,C,D)
14
1.4
Quá trình nhiễm của vi rút NPV trên tế bào côn trùng
20
3.1
Sâu khoang chết do nhiễm vi rút NPV
38
3.2
Thể vùi của các nguồn vi rút NPV sau 10 ngày xử lý
38
3.3
Thể vùi của các nguồn vi rút NPV ở độ phóng đại 400X
39
3.4
Lây nhiễm vi rút NPV trên sâu khoang trong phòng thí nghiệm
40
3.5
Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu vi rút NPV sâu khoang
57
3.6
Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining
57
3.7
Hình ảnh thể vùi của nguồn vi rút NPV dưới kính hiển vi TEM
58
3.8
Sâu khoang chết sau khi lây nhiễm vi rút NPV (hình A và hình B)
59
3.9
Thể vùi của vi rút NPV sau khi xử lý
59
3.10
Tế bào sâu khoang nhiễm vi rút NPV chụp dưới kính lúp soi nổi
600X
3.11
70
Hình ảnh thể vùi của vi rút NPV tế bào sâu khoang dưới kính
hiển vi điện tử TEM
70
3.12
Kết quả điện di PCR vi rút TL1 nhân trên tế bào sâu khoang
72
3.13
Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp của Neighbor-joining
73
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
Tên viết đầy đủ
BVTV
Bảo vệ thực vật
CS
Cộng sự
DMSO
Dimethyl Sulfoxide
Da
Dalton
FBS
Fetal Bovine Serum
CPV
cytoplasmic polyhedroses
GV
Vi rút hạt (Granular virus)
NPV
Vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus)
NPV-Spl
Nucleo Polyhedrosis Virus – Spodoptera litura
NSN
Ngày sau nhiễm
MNPV
Multiple nucleocapsids virion
OB
Thể vùi (Oclusion Body)
SNPV
Single Nucleocapsids virion
PBS
Phosphate Buffered Saline
PIB
Thể vùi (Polyhedra Inclusion Body)
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate
MOI
Multiplicity of infection
WP
Bột thấm nước (Wetable powder)
2WP
Bột thấm nước hàm lượng 2 tỷ thể vùi/gam
ml
Mililit
ADN
Acid Deoxyribo Nucleic
ToC
Nhiệt độ
H (%)
Ẩm độ tương đối của không khí
TB
Trung bình
%
Phần trăm
VSDT
Vệ sinh dịch tễ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ix
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu
Nông nghiệp Việt Nam được hình thành và phát triển trong điều kiện
khí hậu khác nhau làm cho sự đa dạng nông nghiệp trở lên phong phú, giàu
các vi sinh vật. Cùng với sự đa dạng của cây trồng thì sự đa dạng của sâu hại
ở Việt Nam cũng rất lớn. Hàng năm thiệt hại do sâu hại gây ra khoảng 2530% thậm chí có khi lên tới 40- 50%. Thành phần sâu hại khoảng 753 loài
thuộc 99 họ và 10 bộ (Dương Hoa Xô, 2007).
Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là đối tượng sâu hại phổ biến,
phân bố rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới. Đây là một
loài sâu ăn tạp, có thể sống và gây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật
khác nhau. Ở Việt Nam, sâu khoang thường phát sinh phá hại nặng trên nhiều
loại cây trồng, điển hình như các loại cây: bắp cải, rau muống, khoai sọ, thuốc
lá, đậu tương, lạc, bông, đay, v.v. (Ward và cs., 2003)
Trên đồng ruộng, sâu khoang cũng như các loài côn trùng bộ Cánh
phấn khác thường bị chết do nhiễm vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus).
Theo kết quả theo dõi của Viện Bảo vệ thực vật (2001), khi sâu khoang phát
sinh ở mật độ cao, tỷ lệ sâu bị chết do nhiễm NPV từ 0,2- 1,5% trên rau bắp
cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu tương và từ 0,3- 1,9% trên lạc (Viện Bảo vệ thực
vật, 2001).
Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-Spl để cung ứng cho
nông dân phục vụ phòng trừ sâu khoang hại trên các cây trồng nông nghiệp,
sẽ góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất
nông sản an toàn, chất lượng cao cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo tồn các loài
sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng. Đồng thời, thông qua việc
sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu khoang sẽ góp phần bổ sung nguồn vi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1
sinh vật có ích NPV-Spl vào đồng ruộng.
Các nhà khoa học đã xác định vi rút lây nhiễm trên sâu khoang là loài
vi rút nhân đa diện NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) thuộc họ Baculoviridae
và thuộc nhóm vi rút sinh thể vùi, mỗi thể vùi có chứa tới 200 thể vi rút
(virion) hình que có vỏ ngoài là protein bao bọc phân tử ADN (nhân) dạng
vòng xoắn kép. Thể vùi của NPV côn trùng có hình khối đa diện với kích
thước từ 0,15- 15µm. NPV-Spl rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao
đối với sâu khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ của
nó (Engelhard và cs., 1994; Reinisch, 1989).
Tuy nhiên, các loại vi rút chỉ có thể tồn tại, phát triển được trong các tế
bào sống và trong điều kiện môi trường thích hợp (Federici, 1997). Vì vậy,
việc sản xuất chế phẩm vi rút đòi hỏi phải được thực hiện trên cơ thể sâu hoặc
trên các mô, tế bào sâu còn sống. Vì vậy, nhiều nước phát triển đã áp dụng
công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV với
qui mô công nghiệp (Boguslaw và cs., 2011).
Còn ở Việt Nam, việc sản xuất NPV lâu nay vẫn tiến hành theo phương
pháp thủ công với qui mô nhỏ hẹp. Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau
đó nhiễm vi rút NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử
dụng (Trương Thanh Giản và cs., 1996; Hoàng Thị Việt và cs., 2002). Theo
cách này thì sản xuất chế phẩm NPV để trừ sâu hại khó có thể thực hiện với
qui mô công nghiệp, vì để nuôi được số lượng lớn một loài sâu hại phục vụ
sản xuất chế phẩm là một vấn đề hết sức khó khăn và phải có đủ nhà xưởng,
trang thiết bị. Việc nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV trên cơ sở ứng dụng
kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng là vấn đề mới.
Để góp phần tư liệu hướng tới xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm
sinh học NPV trên cơ sở nuôi nhân tế bào để phục vụ phòng trừ sâu hại ở
nước ta, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2
đến khả năng lây nhiễm vi rút NPV – Spl (Nucleo Polyhedrosis Virus Spodoptera litura) trên tế bào sâu khoang (Spodoptera litura)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Phân lập được các nguồn vi rút NPV sâu khoang.
- Lây nhiễm nhân tạo thành công nguồn vi rút NPV trên tế bào sâu
khoang (Spodoptera litura).
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
+ Ý nghĩa khoa học
Kết quả thực hiện đề tài đóng góp những tư liệu khoa học làm sáng tỏ
tiềm năng to lớn của các nguồn vi rút NPV trên sâu hại nói chung và sâu
khoang nói riêng, nhằm hướng tới khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật hữu
ích trong tự nhiên để phát triển chế phẩm sinh học, phục vụ phòng trừ sâu hại
cây trồng ở nước ta.
Bước đầu cung cấp các dẫn liệu khoa học về khả năng lây nhiễm của vi
rút NPV sâu hại trên tế bào nuôi nhân, làm cơ sở khoa học cho xây dựng qui
trình sản xuất chế phẩm NPV theo công nghệ tế bào.
+ Ý nghĩa thực tiễn
Việc thu thập và tuyển chọn thành công 9 nguồn vi rut NPV có tiềm
năng và hoạt lực cao trong phòng trừ sâu khoang hại cây trồng, đóng góp
những thực liệu vi rút làm tiền đề cho việc nghiên cứu phát triển chế phẩm
sinh học vi rút NPV phục vụ sản xuất nông sản an toàn, chất lượng cao.
Các kết quả nghiên cứu còn chỉ rõ các yếu tổ ảnh hưởng và xác định
thông số kỹ thuật (nồng độ tế bào, nồng độ vi rút, nhiệt độ, pH, v.v) phục vụ
lây nhiễm để sản xuất chế phẩm sinh học vi rút NPV có hiệu quả cao. Góp
phần hướng tới việc sản xuất chế phẩm vi rút NPV bằng công nghệ nuôi nhân
tế bào côn trùng. Kết quả của đề tài góp phần mở ra khả năng sản xuất qui mô
công nghiệp các chế phẩm sinh học vi rút NPV và sử dụng phòng trừ sâu hại
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3
cây trồng nông nghiệp an toàn và hiệu quả.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4
CHƯƠNG I
CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
Tác nhân vi rút NPV đều rất chuyên tính và có hiệu quả cao trong
phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp. Trên đồng ruộng, vi rút NPV
thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao, kết quả theo dõi liên tục
từ năm 1988 đến 1995 trên đay tại Đan Phượng (Hà Tây cũ) đã xác định tỷ lệ
sâu đo xanh chết cao nhất do NPV của các năm biến động từ 31,1% (năm
1995) đến 66,6% (năm 1992). Còn trên sâu khoang hại đậu tương và lạc
thường có tỷ lệ chết do NPV từ 1,2- 12,5% (Nguyễn Văn Cảm và cs.,1996).
Trên đồng ruộng, vi rút NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ
khá cao và luôn tồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm
và chỉ bị tiêu diệt thể vùi khi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0 hoặc
dính bám trên thân cây, lá cây hay tàn dư cây trồng ở vị trí bị phơi dưới ánh
sáng cực tím (Grzywacz và cs., 1996).
Sau khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùi NPV, gặp
pH cao của ruột giữa thì màng protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các
virion và các virion này sẽ xâm nhiễm vào nhu mô ruột. Sau đó, sang các mô
bào của cơ thể. Sau 2-3 ngày sâu ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết
(Nguyễn Văn Cảm và cs.,1996).
Trước khi chết, phần cuối thân dính bám vào lá hoặc thân cây và treo
ngược cơ thể, khi sâu non chết cơ thể căng mọng nước rất dễ bị vỡ khi có va
chạm nhẹ. Sau khi vỡ, thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và
tồn tại trong đất, tàn dư cây trồng. Một sâu non chết bệnh NPV có chứa tới
24.553 thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và tồn tại để tiếp
tục chờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại. Trong quá trình canh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5
tác hoặc do mưa gió, làm đất các thể vùi này dính bám lên lá cây và tiếp tục
chờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại (Pourmirza, 2000).
Như vậy, việc phun chế phẩm vi rút NPV vừa có ý nghĩa như một loại
thuốc sinh học để phòng trừ sâu hại một cách trực tiếp, vừa bổ sung nguồn vi
rút hữu ích vào đồng ruộng, góp phần bảo vệ cân bằng sinh thái, duy trì quần
thể các sinh vật có ích, đảm bảo an toàn sức khoẻ người lao động, môi trường
và chất lượng sản phẩm khi thu hoạch.
Vi rút NPV sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng sẽ phá hủy các mô
và làm cho vật chủ chết. Những cá thể còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng
trong giai đoạn nhộng, làm nhộng bị thối, ngài vũ hóa bị biến dạng, hoặc khả
năng đẻ trứng giảm và ảnh hưởng tới các thế hệ sau (Pourmirza, 2000).
Hơn nữa, các loài vi rút gây chết trên côn trùng sâu hại thường có đặc
điểm chuyên tính cao với ký chủ của chúng và rất an toàn đối với người và
các động vật máu nóng (Barreto, 2005). Do vậy, vi rút gây bệnh côn trùng
ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có
triển vọng trong phòng chống sâu hại cây trồng.
1.2. Những nghiên cứu ở nước ngoài
1.2.1. Vài nét về sâu khoang (Spodoptera litura)
Sâu khoang có tên khoa học là Spodoptera litura, thuộc Họ Ngài sáng
(Noctuidae), Bộ Cánh vảy (Lepioptera). Sâu khoang còn được gọi là sâu ăn tạp là
đối tượng gây hại nặng trên các loại cây trồng nông nghiêp. Trên thế giới sâu phân
bố rất rộng vì phổ ký chủ rộng, sâu khoang có thể gây hại khoảng 290 loài thực
vật, trong đó có 200 loại cây trồng ().
Sâu khoang có vòng đời từ 25 - 48 ngày, trải qua 4 giai đoạn trứng, sâu
non, nhộng và trưởng, sâu non vừa nở ăn gặm vỏ trứng và sống tập trung, nếu
bị khua động nhẹ chúng có thể bò phân tán ra chung quanh hoặc nhả tơ
buông mình xuống đất, ở giai đoạn này sâu chỉ gặm mặt dưới lá, chừa biểu bì
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6
trên và gân. Sang tuổi 2 sâu bắt đầu phân tán và ăn gặm lá nhiều hơn. Từ tuổi 4
sâu có phản ứng rõ rệt đối với ánh sang nên ban ngày sâu ẩn những nơi tối
hoặc chui xuống kẻ đất nứt, ban đêm sâu bò lên cây, trong những ngày trời râm
mát hoặc mưa nhẹ thì ban ngày sâu có thể bò hoạt động trên cây. Ở tuổi lớn sâu
có tập quán ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả
thân, cành và trái non. Khi sắp làm nhộng sâu chui xuống đất làm thành một
khoang và nằm yên trong đó hóa nhộng ().
Các biện pháp phòng trừ sâu khoang bao gồm biện pháp canh tác, biện
pháp cơ giới vật lý, biện pháp hóa học và biện pháp sinh học trong đó biện
pháp hóa học được sử dụng nhiều nhất ở các vùng chuyên canh rau màu, sự
lạm dụng thuốc hóa học trong phòng trừ sâu hại làm ảnh hưởng đến các sinh
vật có ích, gây ô nhiễm môi trường và đặc biệt ảnh hưởng tới sức khỏe con
người. Hiện nay, trên thế giới (Trung Quốc, Nga, Brazil, Úc,…) đã ứng
dụng chế phẩm sinh học để phòng trừ sâu khoang hại cây trồng, đặc biệt là
các chế phẩm sản xuất từ vi rút NPV (Boguslaw và cs., 2011).
1.2.2. Vi rút diệt côn trùng và vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus)
1.2.2.1. Lịch sử phát hiện vi rút diệt côn trùng
Lịch sử cổ đại ghi nhận những phát hiện về bệnh tằm dâu và ong khi
con người bắt đầu nhân nuôi, thuần dưỡng hai loài côn trùng có ích này. Năm
384-322 Trước công nguyên Aristotle đã miêu tả bệnh của ong, nhưng người
Trung quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2700 năm trước công
nguyên (Simmonds và cs., 1976).
Năm 1856, Cornalia và Maestri đã mô tả bệnh tằm nghệ - bệnh vi rút.
Các tác giả này đã phát hiện thấy các thể đa diện trong cơ thể tằm. Bolle
(1898) mô tả sự hoà tan thể đa diện trong ruột tằm và giải phóng các hạt
(Stair, 1968).
Năm 1919, Akkva, Komarek và Breidl (1923) đã phát hiện dịch qua lọc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7
có bản chất vi rút và dịch lọc này có khả năng gây bệnh, tạo nên những thể đa
diện ở côn trùng (Mclntosh và cs., 2003).
Người đầu tiên nhìn thấy vi rút gây bệnh côn trùng là Bergold trong
những công trình công bố 1943-1947 sau khi có kính hiển vi điện tử
(Bergold, 1953).
1.2.2.2. Cơ chế gây bệnh của vi rút diệt côn trùng
Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các vi rút nhân lên ngay trong nhân
hoặc trong chất nguyên sinh của tế bào, phá huỷ các mô và làm cho vật chủ
chết. Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn
nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hoá bị biến dạng), trong giai đoạn ngài (khả
năng đẻ trứng giảm) và ảnh hưởng tới các thế hệ sau. Nguồn vi rút tồn tại
trong tự nhiên lại gây lây nhiễm cho các thế hệ mới. Trên cơ sở khoa học này,
vi rút gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là
một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp đấu tranh sinh học
phòng chống sâu hại cây trồng trong tương lai (Simmonds và cs., 1976).
Năm 1986, Evan đã miêu tả hơn 20 họ vi rút gây bệnh cho côn trùng.
Trong đó 2 họ được nghiên cứu nhiều là Baculoviridae và Reoviridae. Đại
diện của họ Baculoviridae là vi rút đa diện nhân (NPV) và đại diện của họ
Reoviridae là vi rút đa diện tế bào chất (CPV) (Evan, 1986).
CPV ký sinh trong 4 bộ côn trùng hay gặp nhất là bộ cánh vảy
(Lepidoptera) có 250 vật chủ, bộ hai cánh (Diptera) có 39 vật chủ. Tuy nhiên
chỉ có CPV của sâu thông Dendrolimus spectabilis là được sản xuất và đăng
ký là thuốc trừ sâu sinh học vi rút (George, 1986). Mặc dù thuốc CPV có
hiệu quả diệt sâu, nhưng người ta vẫn ít quan tâm để phát triển hơn so với
Baculovirus, vì lí do chủ yếu là CPV chỉ tấn công tế bào biểu mô ruột của sâu
và có xu hướng gây ra nhiễm trùng mãn tính. Hơn nữa trong điều kiện tự
nhiên, chúng gây bệnh dịch với tỷ lệ thấp và ít ảnh hưởng tới quần thể vật chủ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8
như Baculovirus. Tuy nhiên chúng có thể nhân nuôi theo qui mô lớn trong
công nghiệp (Evan, 1986).
Theo các tác giả Granados và Federici (1986); có hơn 600 loài sâu
thuộc bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Coleoptera, Diptera, v.v. là vật chủ của
Baculovirus. Do đó có rất nhiều nghiên cứu và sản xuất thuốc trừ sâu vi rút
tập trung vào nhóm vi rút này. Hầu hết Baculovirus thuộc tính chuyên hoá
cao, chỉ ký sinh trong một loài sâu, thậm chí ký sinh một số mô nhất định nào
đó của sâu (Granados và Federici, 1986), Baculovirus của Autographa
californica (AcMNPV) và Baculovirus của Autographa falcifera có vật chủ
của hơn 30 loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera). Những tác động có
hại của Baculovirus đối với thiên địch và các ong kí sinh trưởng thành chưa
được phát hiện trong tự nhiên (Carter, 1984).
Sau khi NPV vào cơ thể ký chủ côn trùng bằng đường tiêu hoá, sâu non
ngừng ăn. Cơ thể sâu biến đổi về màu sắc. Sau 1-2 ngày cơ thể sâu căng
phồng, mọng nước. Cơ thể có màu vàng hoặc trắng. Hạ bì dễ bị nứt, chuyển
động chậm, chết nhanh. Ngoài đồng ruộng sâu chết do vi rút thường quan sát
thấy đầu chúc xuống dưới, dịch trắng chảy ra ngoài (Lê Quang Quyến, 2005).
B
A
Hình 1.1. Sâu khoang khoẻ mạnh (A) và sâu khoang chết
do nhiễm vi rút NPV (B)
“Nguồn: ottosii.tenkomori.tv và o/Virus_insecticides.htm”
Nguyên nhân gây chết sâu là do khi các hạt vi rút bám vào các tế bào
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9
dễ mẫn cảm và xâm nhập vào các tế bào đó. Dưới tác dụng của dịch tiêu hoá
pH > 9 các thể vùi đa diện nhanh chóng hoà tan trong môi trường kiềm, các
virion được giải phóng. Các virion hấp phụ vào màng vi mao. Chức năng của
màng này là cho phép thâm nhập vào để sinh sản, phá vỡ thành tế bào, thoát
ra ngoài và thâm nhập các tế bào khác của vật chủ và gây bệnh cho vật chủ.
Cơ chế này giống như cơ chế nhân lên của thực khuẩn thể trong tế bào (Dow,
1992; Pearson và cs., 2001).
Quá trình nhiễm bệnh của sâu thường trải qua ba giai đoạn (Federici,
1997; Ohkawa và cs., 2010):
- Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài khoảng 12 giờ. Đây là giai đoạn xâm nhập
của vi rút vào bên trong tế bào. Các vi rút cài vào các thụ thể của màng của
nhân tế bào
- Giai đoạn tăng trưởng: kéo dài 16 - 48 giờ. Vi rút tăng trưởng nhanh
trong giai đoạn này. Trong nhân tế bào vật chủ, xuất hiện các cấu trúc mạng
lưới. Sau 32 giờ trong nhân tế bào vật chủ chứa đầy các virion không vỏ.
- Giai đoạn cuối: ở giai đoạn này xảy ra sự tạo thành thể vùi, nghĩa là
các virion được bao bọc trong thể protein. Thời kỳ ủ bệnh của các côn trùng
bị bệnh thường kéo dài từ 3-12 ngày phụ thuộc vào tuổi của vật chủ, nhiệt độ,
độ ẩm và các điều kiện khác của môi trường.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10
Hình 1.2. Chu trình tồn tại và phát triển của vi rút NPV trong tự nhiên
“Nguồn: Ward và cs., 2003”
Trong tự nhiên, việc lây truyền nguồn bệnh vi rút ở côn trùng xảy ra
theo hai hướng (Federici, 1997):
- Lây truyền ngang: Nguồn bệnh lây lan giữa các cá thể trong cùng một
thế hệ trong điều kiện phát thành dịch, nguồn vi rút có thể bám vào vỏ trứng
của vật chủ. Khi nở ấu trùng gặm vỏ trứng chui ra và bị nhiễm bệnh.
- Lây truyền dọc: là sự lây truyền bệnh qua trứng và phôi.
Trong in vitro sự thâm nhập của NPV vào tế bào mẫn cảm bằng cách
các vỏ vi rút hấp thụ trên bề mặt tế bào và các hạt vi rút này đi vào tế bào chất
bằng thực bào. Các capsit nhân lên trong tế bào chất và tương tác với các lỗ rò
của màng nhân để đi vào chất nhân (Ohkawa và cs., 2010).
Trong quần thể sâu hại tự nhiên côn trùng không chỉ bị một bệnh do
một loại vi rút gây ra mà còn bị nhiễm bệnh hỗn hợp của 2 loại vi rút. Thông
thường đó là hỗn hợp giữa NPV và CPV. Có loài côn trùng cùng một lúc có
tới 9 vi rút gây bệnh. Đến nay sự nhiễm bệnh hỗn hợp của nhiều loại vi rút đã
được biết ở 198 loại côn trùng (Granados và Federici, 1986).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11
Tác động qua lại giữa các vi rút trong quá trình nhiễm bệnh biểu hiện
theo ba kiểu: đồng tác động, tác động không phụ thuộc vào nhau và tác động
gây nhiễu cho nhau. Khi có hiện tượng đồng tác động các vi rút trong cùng một
cơ thể vật chủ sẽ làm tăng tỷ lệ chết của sâu và rút ngắn thời gian gây chết
xuống 50%. Điều này rất có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất, ngược lại hiện
tượng tác động nhiễu làm giảm hiệu lực gây bệnh của vi rút và làm giảm hiệu
quả của chế phẩm, vì vậy khi sản xuất chế phẩm cần loại trừ các vi rút có tác
động nhiễu. Chế phẩm NPV không được dùng trong quần thể sâu hại có bệnh
CPV vì giữa hai nhóm này thường có tác động nhiễu lên nhau (Xeros, 1952).
1.2.2.3. Các phương pháp phát hiện vi rút
- Phương pháp căn cứ vào triệu chứng bệnh
Căn cứ vào triệu chứng bên ngoài để xác định sự có mặt của vi rút côn
trùng. Thông thường người ta so sánh giữa côn trùng khoẻ và côn trùng bị
bệnh dựa vào các triệu chứng bên ngoài của sâu có thể phân biệt được các
nhóm vi rút gây bệnh cho côn trùng. Trên cơ sở những quan sát bằng thực
nghiệm, với số mẫu vật quan sát lớn, có thể xây dựng được một khoá phân
loại đơn giản để xác định các nhóm vi rút côn trùng (Lê Quang Quyến, 2005).
- Phương pháp kính hiển vi điện tử
Nhuộm mẫu soi trên kính hiển vi quang học có thể phát hiện được các
thể vùi nhưng không phân biệt được vi rút có thể vùi và không có thể vùi (GV)
vì vậy cần phải dùng kính hiển vi điện tử quét (Scaning Electron Microscopy SEM) hoặc kính hiển vi truyền qua (Transmission Electron Microscopy -TEM)
để xác định. Kính hiển vi điện tử là công cụ hữu hiệu để phân biệt được những
nét đặc trưng của từng nhóm vi rút. Có thể dùng mẫu để soi thẳng bằng SEM
hoặc cắt lát mỏng để quan sát (Ramoska và Hink, 1974).
1.2.2.4. Đặc điểm của vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus)
Vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus) thuộc họ Baculoviridae,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12
thuộc lớp Virus bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis
Virus - NPV) và vi rút hạt (Granulosis Virus – GV) (Erayya và cs., 2013).
Theo Farrar và cs. (1999) thì NPV là nhóm vi rut lớn và có hiệu quả
gây chết cao đối với các loài côn trùng, mỗi loài vi rút thường rất chuyên tính.
Đặc biệt, các loài NPV hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động vật có
xương sống. Vì thế, chúng là những tác nhân sinh học rất hữu ích trong phòng
trừ sâu hại cây trồng (Harrap, 1972).
NPV có dạng hình gậy, chứa ADN, nucleocapsis, có kích thước 40- 70
x 200 - 400 nm. NPV tồn tại dưới dạng các hạt tinh thể sáng gọi là thể vùi
(OB) hoặc thể đa diện (PIB) (Pearson và cs., 2001). Khi quan sát dưới kính
hiển vi phản pha có kích thước 1-7µm. Tinh thể này có nhiều cạnh và tạo
thành 1 protein có khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa. Các hạt vi rút có
một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsit và vi rút NPV có một đặc tính là
hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào côn trùng với kích thước
0,5 - 15 nm (Harrap, 1972).
Vi rút NPV có cấu tạo gồm 3 phần: vỏ ngoài, vỏ capsid và lõi axit
nucleic (Harrap, 1972).
- Vỏ ngoài: là một lớp màng nhầy ngoài cùng có tính chất là protein và
gọi là protein ngoài. Protein ngoài mang trính kháng nguyên và có tác dụng
kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ.
- Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được
ngăn cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp keo dính. Protein cấu tạo nên vỏ
capsid được gọi là protein trong. Protein trong mang tính kháng nguyên làm
tăng khả năng gây bệnh của vi rút.
- Genom: Genom của vi rút NPV là một phân tử ADN gồm 2 mạch
xoắn kép. Khi nhiễm vào tế bào vật chủ vi rút đưa lõi ADN vào tế bào vật
chủ, ADN của vi rút sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13
vật chủ để tổng hợp nên protein và quá trình nhân lên của ADN. Mặt khác khi
tế bào bị nhiễm vi rút, ADN của vi rút sinh ra men azenaza ức chế ADN của
tế bào chủ và phân giải tạo thành các nucleotit tự do. Sau khi tổng hợp đủ các
thành phần như vỏ, ADN, vi rút tiến hành lắp ráp để tạo thành vi rút mới [45].
Quá trình nhân lên của vi rút NPV và sự hình thành thể đa diện được
tiến hành trong nhân tế bào, vỏ của thể đa diện được tổng hợp ở ngoài nhân
sau đó vận chuyển vào trong nhân để hình thành các thể đa diện. Số lượng vi
rút và thể đa diện ngày một tăng, kêt quả phá vỡ tế bào chủ, giải phóng vi rút
tự do và thể đa diện. Vi rút tự do lại tiếp tục xâm nhập vào tế bào lân cận, bắt
đầu chu trình phá vỡ tế bào tiêp theo. Các tế bào chủ bị phá vỡ, quá trình phát
bệnh biểu hiện ra bên ngoài (Reinisch, 1989).
Hình 1.3. Các dạng Baculovirus (A) và thể vùi của vi rút (B,C,D)
“Nguồn: Van Oers và Vlak, 2007”
Vi rút NPV tồn tại ở 2 dạng:
+ Dạng tự do (NPV hình thành thể vùi đa diện PIB): chứa một nhân
capsit trong một vỏ bọc vi rút, vi rút NPV loại này được gọi là SNPVs, dễ bị
bất hoạt hơn khi ngâm trong cồn 70 %, vi rút tự do bất hoạt trong vòng 5 phút
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14
