kỹ thuật chẩn đoán và đặc trưng phân tử của kudzu mosaic virus (kumv) hại đậu tương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
----------------

------------------

TRẦN NGỌC TIỆP

KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VÀ ĐẶC TRƯNG PHÂN TỬ
CỦA KUDZU MOSAIC VIRUS (KuMV) HẠI ĐẬU TƯƠNG

CHUYÊN NGÀNH

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ

: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HÀ VIẾT CƯỜNG

HÀ NỘI – 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nghiên
cứu trong luận văn là kết quả lao động của chính tác giả. Các số liệu và kết quả

trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ
công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Trần Ngọc Tiệp

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hà Viết Cường – người
đã trực tiếp hướng dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quan trọng cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin được chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ Trung tâm Nghiên cứu
Bệnh cây nhiệt đới, các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những người đã
tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình
thực hiện đề tài tốt nghiệp này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày ..... tháng .... năm 2014
Tác giả luận văn

Trần Ngọc Tiệp

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN

i

LỜI CẢM ƠN

ii

MỤC LỤC

iii

DANH MỤC BẢNG

v

DANH MỤC HÌNH

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU

viii
1

1.1.

Đặt vấn đề

1

1.2.

Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

2

1.3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1.

Sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

4

1.2.

Họ Geminiviridae

4

1.3.

Chi Begomovirus

6

1.3.1.

Tầm quan trọng

6

1.3.2.

Tổ chức bộ gene

6

1.3.3.

Cơ chế gây bệnh của begomovirus

8

1.3.4.

Lan truyền của begomovirus

8

1.4.

Begomovirus trên cây họ đậu

8

1.5.

KuMV (Kudzu mosaic virus)

9

1.6.

Kỹ thuật RCA

10

1.7.

Kỹ thuật LAMP

12

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15

2.1.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

15

2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu

15

2.1.2.

Địa điểm nghiên cứu

15

2.1.3.

Thời gian nghiên cứu

15

2.1.4.

Vật liệu nghiên cứu

15

2.2.

Nội dung nghiên cứu

16

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


2.3.

Dụng cụ và thiết bị chính

17

2.4.

Phương pháp nghiên cứu

17

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

22

3.1.

Kết quả kiểm tra PCR các mẫu đậu tương bị bệnh virus với cặp mồi
đặc hiệu cho KuMV

3.2.

22

Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm và giải trình tự toàn bộ bộ gene của 4
mẫu virus VNP134, VNP335, VNP951 và VNP963

24

3.2.1.

Chuẩn bị vector pCAMBIA 2300

24

3.2.2.

Nhân toàn bộ bộ gene của 4 mẫu KuMV bằng RCA

26

3.2.3.

Dòng hóa cấu trúc xâm nhiễm của 4 virus trong vi khuẩn E.coli

27

3.2.4.

Giải trình tự toàn bộ bộ gene của 5 mẫu virus

34

3.3.

Đặc trưng phân tử của 5 mẫu virus

36

3.3.1.

Tổ chức bộ gene

36

3.3.2.

Phân tích các motif chức năng trên bộ gene của 5 mẫu virus

41

3.3.3.

So sánh trình tự và phân tích phả hệ của 5 mẫu virus

48

3.4.

Phát triển kỹ thuật chẩn đoán KuMV bằng LAMP

52

3.4.1.

Thiết kế mồi LAMP chẩn đoán KuMV

53

3.4.2.

Đánh giá tính đặc hiệu của mồi LAMP

56

3.4.3.

Đánh giá độ nhạy của phản ứng LAMP

57

3.4.4.

Đánh giá khả năng phát hiện KuMV của kỹ thuật LAMP đối với các
mẫu DNA chiết từ cây

59

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

61

TÀI LIỆU THAM KHẢO

62

PHỤ LỤC

66

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


DANH MỤC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

1.1

Phân loại các virus họ Geminiviridae theo ICTV năm 2013.

5

2.1

Trình tự các mồi sử dụng để giải trình tự toàn bộ bộ gene của KuMV.

16

2.2

Thành phần phản ứng LAMP (Wei et al., 2012).

21

3.1

Kết quả kểm tra PCR phát hiện KuMV trên 38 mẫu đậu tương.

23

3.2

Kết quả dòng hóa 4 mẫu KuMV (VNP134, VNP335, VNP951 và
VNP963) trên vector pCambia 2300.

32

3.3

Kết quả giải trình tự toàn bộ bộ gene của 5 mẫu KuMV.

35

3.3

Đặc trưng phân tử của DNA-A của 5 mẫu virus KuMV.

37

3.4

Đặc trưng phân tử của DNA-B của 4 mẫu virus KuMV.

40

3.5

So sánh DNA-A của 5 mẫu virus nghiên cứu với 2 mẫu KuMV trên
sắn dây.

49

3.6

Danh lục các begomovirus sẵn có trên GenBank trong phân tích phả hệ.

50

3.7

Trình tự của 2 bộ mồi LAMP Primer-CP và LAMP Primer-REP.

55

3.8

Kết quả đánh giá tính đặc hiệu của kỹ thuật LAMP chẩn đoán KuMV
với 2 bộ mồi LAMP Primer-CP và LAMP Primer-REP.

3.9

57

Kết quả đánh giá độ nhạy của kỹ thuật LAMP với mồi LAMP PrimerREP và so sánh với kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi KuAFor1/KuAR1.

3.10

58

Kết quả đánh giá khả năng phát hiện KuMV của kỹ thuật LAMP với
mồi LAMP Primer-REP với các mẫu DNA chiết từ cây.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

60

Page v


DANH MỤC HÌNH

STT

Tên hình

Trang

1.1

Hình thái phân tử của geminivirus.

5

1.2

Tổ chức bộ gene của các begomovirus có bộ gene kép

7

1.3

Cây đậu tương tại Hà Nội nhiễm KuMV

1.4

Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật RCA (Rolling

10

Circle Amplification) dùng hexamer và Φ29polymeraseDNA
1.5

Cơ chế nhân dòng DNA bằng kỹ thuật LAMP

11

(Loop-mediated

isothermal amplification) (Fujii et al., 2006).

14

2.1

Sơ đồ tạo cấu trúc xâm nhiễm của KuMV có ứng dụng kỹ thuật RCA.

20

3.1

Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện KuMV trên 38 mẫu đậu
tương với cặp mồi đặc hiệu.

22

3.2

Sơ đồ vector pCAMBIA 2300

25

3.3

Kết quả chuẩn bị vector pCAMBIA 2300 cho biến nạp.

26

3.4

Kết quả điện di sản phẩm RCA được cắt không hoàn toàn bằng
enzyme cắt giới hạn BamHI.

27

3.5

Kết quả nhân dòng sản phẩm monomer (~2,7kb) của mẫu VNP335.

29

3.6

Kết quả nhân dòng sản phẩm dimer (~5,4kb) của mẫu VNP134 và
VNP951.

30

3.7

Kết quả nhân dòng sản phẩm dimer (~5,4kb) của mẫu VNP963.

31

3.8

Tổ chức bộ gene của 5 mẫu virus KuMV.

39

3.9

Kết quả phân tích các motif chức năng trên vùng chung CR (common
region) của 5 mẫu virus.

42

3.10

Kết quả phân tích các motif chức năng trên protein Rep của 5 mẫu virus.

45

3.11

Protein CP của 5 mẫu KuMV với các motif hoặc gốc axít amin chủ

chốt liên quan đến các chức năng lắp ráp virion, lan truyền qua vector
và nhập nhân được đánh dấu.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

47

Page vi


3.12

Cây phả hệ dựa trên DNA-A của các begomovirus hại đậu đỗ

52

3.13

Vị trí các mồi LAMP trên vùng gene mục tiêu.

53

3.14

Kết quả thiết kế mồi LAMP trên 2 vùng gene CP và Rep sử dụng phần
mềm Primer Explorer V4.

55

3.15

Kết quả điện di sản phẩm phản ứng LAMP với 2 bộ mồi.

56

3.16

Kết quả điện di đánh giá độ nhạy của kỹ thuật LAMP với mồi LAMP
Primer-REP và so sánh với kỹ thuật PCR.

3.17

58

Kết quả điện di đánh giá khả năng phát hiện KuMV của kỹ thuật
LAMP với mồi LAMP Primer-REP với các mẫu DNA chiết từ cây.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

59

Page vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Từ viết tắt

Bộ NN và PTNT

Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn

Bp

Base pair

CP

Capsit protein

CR

Common region

CTAB

Cetryl Ammonium Bromide

DNA

Axit deoxyribonucleic

dNTP

Deoxynucleotide triphotphate

dsDNA

Double DNA

E.coli

Escherichia coli

FAO

Food and Agriculture Organization

ICTV

International Committee on Taxonomy of Viruses

IR

Intergenic region

Kb

Kilobase

KuMV

Kudzu mosaic virus

LAMP

Loop-Mediated Isothermal Amplification

LB

Luria and Bertani

ORF

Open reading frame

ori

Origin of replication

PCR

Polymerase chain reaction

RCA

Rolling Circle Amplification

RE

Restriction enzyme

Ren

Replication enhancer protein

Rep

Replication protein

ssDNA

Singe strand DNA

TYLCV

Tomato yellow leaf curl virus

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây đậu tương hay đậu nành (Glycine max) là cây trồng có tầm quan trọng
số một trong các cây họ đậu (Fabaceae), là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng
và kinh tế cao. Hiện nay, đậu tương có diện tích, năng suất và sản lượng lớn nhất
trong tất cả các cây họ đậu (Maesen and Somaatmadja, 1996). Tại Việt Nam, cây
đậu tương cũng là một cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao. Tuy nhiên, cây đậu tương
bị tấn công bởi rất nhiều bệnh hại, đặc biệt là virus. Theo Iwaki (1993) có tới 13
loài virus gây hại trên đậu tương ở Đông Nam Á. Gần đây, Kudzu mosaic virus
(KuMV) đã được phát hiện thấy trên cây đậu tương bị bệnh khảm vàng tại Hà Nội
và một số tỉnh khác thuộc miền Bắc Việt Nam (Hà Viết Cường, 2010). Khám phá
này là quan trọng vì đây là lần đầu tiên KuMV được phát hiện thấy trên cây đậu
tương, một cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao của Việt Nam và trên thế giới.
KuMV thuộc chi Begomovirus, thuộc họ Geminiviridae, được phát hiện lần
đầu tiên trên cây sắn dây tại tỉnh Hòa Bình năm 2005 (Ha et al., 2008) và tiếp theo
được phát hiện thấy cũng trên cây sắn dây tại Trung Quốc năm 2008 (mã số

GenBank FJ539014). Vì KuMV là một begomovirus nên nhiều đặc tính chung của
nhóm virus này đã được hiểu rõ như chúng là các virus có bộ gene DNA, mạch
vòng, sợi đơn, không truyền qua hạt giống, lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn
(Bemisia tabaci) và có khả năng tái tổ hợp rất cao.
Tuy nhiên vì là một virus mới nên nhiều đặc điểm của KuMV cần phải được
nghiên cứu mới. Đối với một bệnh virus thực vật, các nghiên cứu chủ yếu tập trung
vào 4 lĩnh vực: (i) Nguyên nhân gây bệnh (đặc điểm hình thái, phân tử/di truyền,
phân loại, chẩn đoán…), (ii) Các đặc trưng sinh học (phạm vi ký chủ, quan hệ
vector, tính chất gây bệnh, tính hướng mô, chức năng gene…), (iii) Dịch tễ bệnh
(ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố bệnh học là ký chủ - điều kiện ngoại cảnh - virus
đến sự phát triển bệnh trên qui mô quần thể) và (iv) Phòng chống (các chiến lược
và chiến thuật phòng trừ bệnh).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


Dựa vào điều kiện và khả năng, đề tài này sẽ thực hiện một số nội dung có ý
nghĩa khoa học và thực tiễn cao như đánh giá mức độ đa dạng và phát triển kỹ thuật
chẩn đoán virus KuMV.
Để đánh giá mức độ đa dạng của KuMV, đề tài sẽ sử dụng kỹ thuật RCA
(Rolling Circle Amplification) để nhân bộ gene virus. Kỹ thuật RCA dùng enzyme
DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29 và mồi hexamer để nhân các phân tử
DNA mạch vòng thành các multimer. Sản phẩm RCA sẽ được cắt bằng enzyme cắt
giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thông thường. Đây
là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có bộ gene DNA
mạch vòng kể cả các begomovirus.
Để chẩn đoán KuMV, đề tài sẽ thử nghiệm một kỹ thuật chẩn đoán tương đối
mới là LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification). Kỹ thuật LAMP sử dụng

4 mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt nhận ra 6 đoạn riêng biệt trên gene đích nên
tích đặc hiệu cao. Phản ứng LAMP diễn ra trong điều kiện đẳng nhiệt, thời gian
phản ứng ngắn, độ nhạy cao hơn so với PCR, có thể kiểm tra sản phẩm bằng phát
hiện màu và không yêu cầu máy móc phức tạp.
Dựa trên cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Kỹ thuật chẩn
đoán và đặc trưng phân tử của Kudzu mosaic virus (KuMV) hại đậu tương”.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
- Xác định được đặc trưng phân tử và mức độ đa dạng phân tử của virus KuMV.
- Phát triển được kỹ thuật LAMP chẩn KuMV.
1.2.2. Yêu cầu
- Kiểm tra PCR phát hiện KuMV trên các mẫu đậu tương bị bệnh virus thu
thập ở miền Bắc Việt Nam với mồi đặc hiệu cho virus này.
- Dòng hóa toàn bộ bộ gene của 3-4 mẫu KuMV.
- Giải trình tự toàn bộ bộ gene của các mẫu virus đã dòng hóa.
- Phân tích đặc trưng phân tử, mức độ đa dạng bộ gene của các mẫu virus đã
được dòng hóa.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


- Thiết kế 1 bộ mồi LAMP cho chẩn đoán KuMV.
- Đánh giá tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng phát hiện KuMV trên các mẫu
DNA tổng số chiết từ cây đậu tương của mồi LAMP.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Nghiên cứu mức độ đa dạng, đặc trưng phân tử và phát triển kỹ thuật LAMP
chẩn đoán KuMV hại đậu tương từ đó tiến tới nghiên cứu các đặc trưng sinh học,
dịch tễ bệnh và phòng chống virus này.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
Cây đậu tương hay đậu nành (Glycine max) là cây họ đậu có nguồn gốc tử
Đông Á và được xem là 1 trong các cây trồng quan trọng trên thế giới. Theo thống
kê năm 2010 của Tổ chức Nông Lương thế giới (FAO), sản lượng đậu tương toàn
thế giới là 258,4 triệu tấn, trong đó 5 quốc gia sản xuất hàng đầu lần lượt là Mỹ
(90,6 triệu tấn, 35%), Brazil (68,5 triệu tấn, 26,5%), Argentina (52,7 triệu tấn,
20,4%), Trung Quốc (15,1 triệu tấn, 5,8%) và Ấn Độ (9,8 triệu tấn, 3,8%). Việt
Nam đứng hàng thứ 18 trong các nước sản xuất đậu tương trên thế giới với sản
lượng ~ 3 triệu tấn tương đương 1,1% tổng sản lượng toàn thế giới
( />Tại Việt Nam, cây đâu tương cũng là 1 cây trồng có ý nghĩa kinh tế. Theo
thống kê của Bộ NN và PTNT, năm 2010, sản lượng đậu tương cả nước đạt 296,9
nghìn tấn, tăng 81,7 nghìn tấn (+38,0%) so với năm trước, chủ yếu do tăng diện tích
gieo trồng. Diện tích gieo trồng ước đạt 197,8 nghìn ha, tăng 50,8 nghìn ha
(+34,6%); năng suất đạt 15,0 tạ/ha, tăng 0,4 tạ/ha (+2,5%). Sang năm 2011, sản
lượng đậu tương chỉ đạt 254,2 nghìn tấn, giảm 44,4 nghìn tấn (-14,9%) so cùng kỳ
năm trước. Sản lượng đậu tương giảm chủ yếu do diện tích gieo trồng năm 2011
giảm mạnh với mức giảm hơn 24 nghìn ha

( />
es/statisticreport.aspx?TabId=thongke).
Bã đậu tương (bã đậu nành), sản phẩm còn lại sau khi chiết tách dầu, là thành
phần quan trọng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm và cá. Do ngành chăn
nuôi và nuôi trồng thủy sản phát triển rất mạnh trong những năm gần đây nên Việt

Nam đã phải nhập khẩu một lượng lớn mặt hàng này. Theo thống kê của FAO năm
2010, Việt Nam là quốc gia đứng đầu thế giới về nhập khẩu bã đậu tương (2,9 triệu
tấn, 5%) ( />1.2. Họ Geminiviridae
Họ Geminiviridae là một trong 2 họ virus thực vật lớn nhất (cùng với họ
Potyviridae). Số loài được công nhận chính thức bởi Ủy ban Phân loại và Danh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


pháp Virus Quốc tế (ICTV) năm 2013 là 325 loài (Bảng 1.1), chiếm khoảng 20%
tổng số loài virus thực vật. Từ “Gemini” có nghĩa là “sinh đôi hay cặp đôi”, ám chỉ
hình thái dạng cầu kép của phân tử virus (Hình 1.1).

Hình 1.1. Hình thái phân tử của geminivirus.
Ghi chú: A. Phân tử Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), bar = 100 nm (Gafni,
2003); B. Mô hình phân tử Maize streak virus (MSV) (Zhang et al., 2001).
Bảng 1.1. Phân loại các virus họ Geminiviridae theo ICTV năm 2013.
Chi

Loài điển hình

Bộ gene

Vector

Số loài

Mastrevirus

Maize streak virus (MSV)

Đơn

Rầy lá

29

Curtovirus

Beet curly top virus (BCTV)

Đơn

Rầy lá

3

Topocuvirus

Tomato pseudo-curly top virus (TPCTV)

Đơn

Rầy

1

Begomovirus

Bean golden mosaic virus (BGMV)

Đơn hoặc kép

Bọ phấn

288

Becurtovirus

Beet curly top Iran virus (BCTIV)

Đơn

2

Eragrovirus

Eragrostis curvula streak virus (ECSV)

Đơn

1

Đơn

1

Turncurtovirus Turnip curly top virus (TCTV)

325

Tổng số

Các geminivirus có bộ gene DNA mạch vòng, sợi đơn, kích thước ~ 2,7 kb.
Các geminivirus có thể có bộ gene đơn (monopartite) gồm 1 phân tử DNA hoặc bộ
gene kép (bipartite) nếu có 2 phân tử DNA genome (Fauquet et al., 2005).
Các geminivirus được phân loại trên cơ sở tổ chức bộ gene và vector truyền
bệnh. Cho tới nay (số liệu năm 2013 của ICTV), 7 chi trong họ được ghi nhận bao
gồm:

Mastrevirus,

Curtovirus,

Topocuvirus,

Begomovirus,

Becurtovirus,

Eragrovirus và Turncurtovirus ( />sion=2013).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


1.3. Chi Begomovirus
1.3.1. Tầm quan trọng
Trong bốn chi của họ Geminiviridae, chi Begomovirus (được đặt tên từ Bean

golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng loài (288 loài vào năm
2013) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng. Tất cả các begomovirus
(tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều không truyền qua hạt giống
nhưng lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững
tuần hoàn (Fauquet et al., 2005; Seal et al., 2006).
Nhiều begomovirus là các tác nhân gây bệnh quan trọng trên cây trồng như
bệnh khảm lá sắn ở châu Phi, tiểu lục địa Ấn Độ, bệnh cuốn lá bông, và đặc biệt
bệnh xoăn vàng lá cà chua khắp thế giới (Briddon and Markham, 2000; Moriones
and Navas-Castillo, 2000; Legg and Fauquet, 2004; Seal et al., 2006).
1.3.2. Tổ chức bộ gene
Các begomovirus là các virus thực vật có bộ gene DNA sợi vòng đơn có kích
thước khoảng 2,6 – 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gene kép (bipartite) gồm 2 phân tử
DNA gọi là DNA-A và DNA-B (Hình 1.2) hoặc có bộ gene đơn (monopartite)
tương đương DNA-A.
Phân tử DNA-A chứa 6 gene được tổ chức theo 2 chiều ngược nhau. Trên
chiều kim đồng hồ (chiều virus) có 2 gene (i) AV1 mã hóa vỏ protein (CP) có chức
năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyền qua vector, vận chuyển bộ gene virus
vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gene virus giữa các tế bào; và
(ii) AV2 mã hóa protein V2 có chức năng liên quan đến vận chuyển virus giữa các
tế bào (Hanley-Bowdoin et al., 1999; Fauquet et al., 2005).
Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) có 4 gene là (i)
AC1 mã hóa protein tái sinh hay còn gọi là protein Rep có chức năng chính là cắt - nối
bộ gene virus tại một vị trí đặc biệt ở vùng nguồn gốc tái sinh và tương tác với protein
ký chủ để tạo điều kiện thuận lợi cho tái sinh virus, (ii) AC2 mã hóa một protein hoạt
hóa phiên mã (TrAP, transcriptional activator protein), (iii) AC3 mã hóa một protein
tăng cường tái sinh (REn, replication enhancer) và (iv) AC4 mã hóa protein AC4 với
chức năng liên quan đến phổ ký chủ và phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm
gene của tế bào ký chủ (Hanley-Bowdoin et al., 1999; Fauquet et al., 2005).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


Giữa hai vùng gene mã hóa ngược chiều nhau ở trên là một vùng liên gene
không mã hóa IR (intergenic region). Vùng IR chứa nguồn gốc tái sinh (ori = origin
of replication) gồm (i) các chuỗi lặp đảo (iteron) cần thiết cho sự nhận biết và gắn
kết của protein Rep và (ii) một cấu trúc kẹp tóc (hairpin) hay còn gọi là thân – thòng
lọng (stem – loop), trong đó chuỗi TAATATTAC trên vùng thòng lọng là giống
nhau ở tất cả các begomovirus. Vị trí T7-C8 của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và
nối bộ gene begomovirus trong quá trình tái sinh (Laufs et al., 1995).
Phân tử DNA-B chứa hai gene cũng được sắp xếp theo hai chiều ngược
nhau. Trên chiều kim đồng hồ là gene BV1 mã hóa protein con thoi (NSP, nuclear
shuttle protein) có chức năng chính là vận chuyển bộ gene virus vào và ra khỏi nhân
tế bào. Trên chiều ngược kim đồng hồ là gene BC1 mã hóa protein vận chuyển
(MP, movement protein) có chức năng vận chuyển bộ gene virus giữa các tế bào ký
chủ (Hanley-Bowdoin et al., 1999; Fauquet et al., 2005).

Hình 1.2. Tổ chức bộ gene của các begomovirus có bộ gene kép (Ha, 2007).
Ở vùng IR của DNA-A và DNA-B của các begomovirus có bộ gene kép có
một chuỗi bảo thủ cao (khoảng 150 nucleotide) giữa hai phân tử gọi là vùng chung
CR (common region). Vùng CR chứa chuỗi ori. Sở dĩ có vùng chung này vì DNA-B
không thể tự tái sinh mà phải cần sự nhận biết và cắt – nối của protein Rep mã hóa
trên DNA-A để tái sinh được trong tế bào ký chủ (Orozco and Hanley-Bowdoin,
1996; Orozco et al., 1998; Hanley-Bowdoin et al., 1999; Fauquet et al., 2005).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


1.3.3. Cơ chế gây bệnh của begomovirus

Một trong các cơ chế gây bệnh chủ yếu của begomovirus chúng tương tác
với các yếu tố ký chủ liên quan đến bộ máy tái bản. Quá trình tái bản của
begomovirus xảy ra trong nhân tế bào, kể cả ở các tế bào không phân chia. Do vậy,
sau khi nhiễm vào tế bào, begomovirus phải khởi động bộ máy tái sinh của tế bào. Một
trong các protein của tế bào ký chủ thực vật điều khiển chu kỳ tế bào là pRBR (plant
retinoblastoma-related protein) - chịu trách nhiệm chuyển chu kỳ tế bào từ pha G1 sang
pha S (pha tổng hợp). Protein Rep của begomovirus đã được chứng minh tương tác với
pRBR của tế bào ký chủ, cho phép khởi động lại chu kỳ tế bào để tạo điều kiện cho
virus tái sinh (Hanley-Bowdoin et al., 1999; Gutierrez et al., 2004).
1.3.4. Lan truyền của begomovirus
Tất cả các begomovirus đều không truyền qua hạt giống nhưng có thể truyền dễ
dàng qua nhân giống vô tính. Con đường lan truyền chính của begomovirus ngoài tự
nhiên là nhờ bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Ghanim et al., 1998;
Kunik et al., 1998; Seal et al., 2006; Fauquet et al., 2008).
1.4. Begomovirus trên cây họ đậu
Cho tới nay, có khoảng 20 begomovirus được ghi nhận hại cây đậu đỗ trên
thế giới và được chia thành hai cụm phân biệt trên cơ sở phân bố địa lý là cụm Tân
Thế giới gồm các virus được phân lập từ châu Mỹ và cụm Cựu Thế giới gồm các
virus được phân lập từ phần còn lại của thế giới (Fauquet et al., 2008).
Các virus thuộc cụm Cựu Thế Giới lại được chia thành hai cụm phân biệt
dựa trên đặc điểm bộ gene là:
(i) Cụm hai begomovirus có bộ gene đơn là Soybean crinkleaf virus
(SbCLV), phân lập trên đậu tương từ Thái Lan, và Mimosa yellow leaf curl virus
(MiYLCV), phân lập trên cây xấu hổ của Việt Nam. Mặc dù đây là hai virus hại cây
họ đậu nhưng vị trí tiến hóa của chúng thường không được đề cập (Ha et al., 2008).
(ii) Cụm legumovirus gồm tất gồm tất cả các virus hại cây họ đậu có bộ gene
kép gồm MYMV (Mungbean yellow mosaic virus), MYMIV (Mungbean yellow
mosaic India virus), HgYMV (Horsegram yellow mosaic virus), VeBSMV (Velvet
bean severe mosaic virus), LeYMV (Legume yellow mosaic virus), CowGMV
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


(Cowpea golden mosaic virus) và KuMV (Kudzu mosaic virus). Trong số các virus
này, KuMV có nguồn gốc phân lập từ Việt Nam và phía Nam Trung Quốc còn các
virus còn lại đều có nguồn gốc từ Tiểu lục địa Ấn Độ (Ha et al., 2008; Nawaz-ulRehman and Fauquet, 2009; Briddon et al., 2010).
1.5. KuMV (Kudzu mosaic virus)
Năm 2005, một bệnh khảm lá đã được quan sát thấy trên cây sắn dây tại tỉnh
Hòa Bình của Việt Nam. Các nghiên cứu dựa trên phân tích phân tử toàn bộ bộ gene
đã xác định được tác nhân gây bệnh thuộc một loài mới (chi Begomovirus, họ
Germiniviridae) và đã được đặt tên là Kudzu mosaic virus (KuMV), trong đó từ
“Kudzu” là tên tiếng Anh của cây sắn dây (Ha et al., 2008). Tiếp theo KuMV cũng
đã được phát hiện thấy cũng trên cây sắn dây tại phía Nam Trung Quốc năm 2008
(mã số GenBank FJ539014).
Năm 2009, KuMV đã được phát hiện thấy lần đầu tiên trên cây đậu tương
trồng thí nghiệm tại khoa Nông học (Học viện Nông nghiệp Việt Nam) (Hình 1.3).
Một mẫu KuMV trên đậu tương đã được giải trình tự toàn bộ bộ gene. Sử dụng cặp
mồi dùng cho giải trình tự (không phải mồi chẩn đoán) đã cho thấy KuMV dường
như khá phổ biến trên đậu tương (Hà Viết Cường, 2010). Việc phát hiện thấy
KuMV trên cây đậu tương có tầm quan trọng đặc biệt vì đậu tương là một cây trồng
có ý nghĩa kinh tế.
Tuy nhiên vì là một loài virus mới nên nhiều đặc điểm sinh học quan
trọng như phổ ký chủ, đặc tính gây bệnh, phân bố địa lý vẫn chưa được nghiên
cứu. Chỉ khi các các đặc điểm này được hiểu rõ thì mới có thể áp dụng các biện
pháp phòng chống.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9

Hình 1.3. Cây đậu tương tại Hà Nội nhiễm KuMV (Hà Viết Cường, 2010).
1.6. Kỹ thuật RCA
Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA (Rolling
Circle Amplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gene DNA dạng mạch vòng.
Kỹ thuật RCA dùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29, một
enzyme có hoạt tính chuyển mạch (strand-displacement) rất cao, và mồi hexamer để
nhân các phân tử DNA mạch vòng thành các multimer mạch thẳng (gồm nhiều bộ
gene virus liên tiếp) (Hình 1.4). Sản phẩm RCA sẽ được cắt bằng enzyme cắt giới
hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thông thường. Đây là kỹ
thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có bộ gene DNA mạch
vòng kể cả các begomovirus (Inoue-Nagata et al., 2004; Haible et al., 2006;
Knierim and Maiss, 2007).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


Hình 1.4. Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật
RCA (Rolling Circle Amplification) dùng hexamer và Φ29polymeraseDNA
(Fujii et al., 2006).
Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm của
begomovirus. Sản phẩm RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giới
hạn thích hợp trong điều kiện không triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer (1
bộ gene), dimer (2 bộ gene) và multimer (nhiều bộ gene). Chỉ các sản phẩm dimer
được tinh chiết khỏi gel agarose và nối vào vector nhị nguyên. Bằng cách đơn giản
này, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus có thể được tạo ra khá nhanh chóng
(Inoue-Nagata et al., 2004; Knierim and Maiss, 2007; Ferreira et al., 2008; Wu et

al., 2008; Wyant et al., 2011).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


1.7. Kỹ thuật LAMP
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) là phương pháp khuếch đại
nucleic acid đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm. LAMP sử dụng 4 mồi khác nhau
được thiết kế đặc biệt nhận ra 6 đoạn riêng biệt trên gene đích và quá trình phản ứng
xảy ra ở nhiệt độ cố định dùng phản ứng thay thế mạch. Khuếch đại và phát hiện
gene có thể được hoàn thành chỉ trong 1 bước bằng cách ủ DNA, primers, bst DNA
polymerase có hoạt tính thay thế mạch và dung dịch đệm ở nhiệt độ cố định
(khoảng 650C). Phương pháp này cho hiệu quả khuếch đại cao với lượng DNA
được khuếch đại đến 109-1010 lần trong vòng 15-60 phút. Bởi vì tính đặc hiệu cao,
sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại có thể chứng tỏ sự có mặt của đoạn gene
quan tâm.
Bốn mồi của LAMP được thiết kế dựa theo 6 đoạn riêng biệt trên đoạn gene
quan tâm: đoạn F3c, F2c và F1c ở đầu 3' và đoạn B1, B2 và B3 ở đầu 5'.
-

FIP: Forward Inner Primer (FIP) bao gồm đoạn F2 (ở đầu 3') bổ sung cho
đoạn F2c, và đoạn giống như đoạn F1c ở đầu 5'.

-

F3 Primer: Forward Outer Primer bao gồm đoạn F3 bổ sung cho đoạn F3c.

-

BIP: Backward Inner Primer (BIP) bao gồm đoạn B2 (ở đầu 3’) bổ sung cho
đoạn B2c và đoạn giống như B1c ở đầu 5’.

-

B3 Primer: Backward Outer Primer bao gồm đoạn B3 bổ sung cho đoạn B3c.
Khi đoạn gene quan tâm và các thành phần phản ứng được ủ ở nhiệt độ cố

định khoảng 60-65°C trong vòng 45-60 phút và kết thúc phản ứng bằng cách ủ ở
nhiệt độ 80°C trong 2-10 phút, các bước phản ứng xảy xa (Hình 1.5):
Bước 1: Một trong những LAMP primers có thể bám vào mạch bổ sung của
đoạn DNA mạch đôi quan tâm và khởi động quá trình tổng hợp DNA sử dụng DNA
polymerase có hoạt tính thay thế mạch, thay thế và giải phóng DNA mạch đơn. Với
phương pháp LAMP, không giống như PCR, không cấn biến tính nhiệt đoạn DNA
mạch đôi thành mạch đơn. Cơ cấu khuếch đại sau đây giải thích từ khi FIP bám vào
để giải phóng DNA template mạch đơn.
Bước 2: Thông qua hoạt tính thay thế mạch của DNA polymerase, đoạn DNA
bổ sung cho template DNA được tổng hợp, bắt đầu từ đầu 3’ của đoạn F2 của FIP.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


Bước 3: F3 Primer bám vào đoạn F3c, ngoài FIP trên đoạn DNA quan tâm
và bắt đầu tổng hợp DNA thay thế mạch, giải phóng mạch bổ sung gắn FIP.
Bước 4: Mạch đôi được tạo thành từ đoạn DNA tổng hợp từ F3 primer và
đoạn template DNA.
Bước 5: Đoạn bổ sung gắn FIP được tách thành mạch đơn vì sự thay thế của
đoạn DNA tổng hợp từ F3 primer. Sau đó, mạch đơn được giải phóng tạo thành cấu

trúc stem loop ở đầu 5’ do đoạn bổ sung F1c và F1.
Bước 6: Đoạn DNA đơn trong bước (5) là template cho sự tổng hợp DNA do
BIP khởi đầu và sự tổng hợp DNA thay thế mạch do B3 làm mồi sau đó. BIP bám
vào đoạn DNA tạo thành trong bước (5). Bắt đầu từ đầu 3’ của BIP, sự tổng hợp
DNA bổ sung bắt đầu. Thông qua quá trình này, đoạn DNA chuyển từ cấu trúc
mạch vòng thành cấu trúc thẳng. B3 primer bám vào bên ngoài BIP và sau đó qua
hoạt tính của DNA polymerase bắt đầu từ đầu 3’, DNA được tổng hợp từ BIP được
thay thế và giải phóng thành mạch đơn trước khi tổng hợp DNA từ B3 primer.
Bước 7: Mạch đôi DNA được tạo thành qua quá trình điễn tả trong bước (6).
Bước 8: Đoạn bổ sung gắn BIP thay thế trong bước (6) tạo thành cấu trúc
vòng ở mỗi đầu nhìn như cấu trúc quả tạ. Cấu trúc này là cấu trúc khởi đầu cho
vòng khuếch đại trong phương pháp LAMP. Quá trình bên trên được coi như là quá
trình tạo ra cấu trúc ban đầu cho vòng LAMP.
Bước 8-11: Cấu trúc DNA hình quả tạ nhanh chóng chuyển thành DNA
mạch vòng do tổng hợp DNA tự mồi. FIP bám vào đoạn mạch đơn trong DNA vòng
và mồi quá trình tổng hợp DNA thay thế mạch giải phóng đoạn DNA tổng hợp
trước. Mạch đơn giải phóng tạo cấu trúc mạch vòng ở đầu 3’ tạo bởi đoạn B1c bổ
sung và B1. Sau đó bắt đầu từ đầu 3’ của đoạn B1, sự tổng hợp DNA dùng cấu trúc
của mình làm template và giải phóng mạch bổ sung gắn FIP (Bước (9)). Mạch đơn
mới được giải phóng tạo cấu trúc quả tạ vì hai đầu có đoạn bổ sung F1 - F1c và B1c
- B1 (Bước (11)). Cấu trúc này là cấu trúc ngược lại của cấu trúc tạo thành trong
bước (8). Giống như từ bước (8) đến (11), cấu trúc trong bước (11) dẫn đến quá
trình tổng hợp DNA tự mồi bắt đầu từ đầu 3’ trong đoạn B1. Hơn nữa, BIP bám vào
đoạn B2c và bắt đầu sự tổng hợp DNA thay thế mạch, giải phóng đoạn DNA do B1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


mồi. Theo đó, cấu trúc tương tư như ở bước (9) và (10) cũng như giống cấu trúc do

bước (8) tạo thành. Với cấu trúc tạo thành ở bước (10), BIP bám vào đoạn mạch
đơn B2c, sự tổng hợp DNA tiếp tục bởi sự thay thế đoạn mạch đôi DNA. Kết quả
của quá trình này là nhiều cấu trúc bao gồm nhiều đoạn lặp lại ngược của đoạn quan
tâm trên cùng một mạch được tạo thành.
Kỹ thuật LAMP lần đầu tiên được công bố năm 2000 (Notomi et al., 2000), từ đó
cho đến nay kỹ thuật này được nghiên cứu phát triển rộng rãi trong chẩn đoán nhanh
virus (Parida et al., 2008). Gần đây kỹ thuật LAMP cũng được sử dụng trong chẩn đoán
nhanh các begomovirus (Fukuta et al., 2003; Kuan et al., 2010; Almasi et al., 2013).

Hình 1.5. Cơ chế nhân dòng DNA bằng kỹ thuật LAMP
(Loop-mediated isothermal amplification) (Fujii et al., 2006).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Kuzdu mosaic virus hại đậu tương.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp
Việt Nam.
2.1.3. Thời gian nghiên cứu
- Từ tháng 12/2013 đến tháng 08/2014.
2.1.4. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu cây đậu tương bệnh virus có triệu chứng điển hình được thu thập và bảo
quản tại Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Các đệm, dung dịch, hóa chất và môi trường chính: đệm 1X TAE, đệm CTAB,

kháng sinh tetracycline, kháng sinh, môi trường LB lỏng, LB agar, môi trường SOB,
môi trường SOC, và đệm TB. Thành phần của các đệm và môi trường được trình bày ở
Phụ lục.
- Các mồi PCR, multiplex PCR và mồi sử dụng để giải trình tự toàn bộ bộ gene
của KuMV được liệt kê ở Bảng 2.1.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15


Bảng 2.1. Trình tự các mồi PCR, multiplex PCR và mồi sử dụng để giải trình
tự toàn bộ bộ gene của KuMV.
STT

Mồi

Trình tự

1

F3-KuMV-CP

CATTCTCAAGTCCGATATCCTCG

2

LegA-repR1

TCAYCTVCATGTTCTGCTTC

3

LegA-repR2

CAYATTWCCATCCGAACATTCAG

4

LegA-cpF1

GGTCAAGTKTTYAACATGTATGA

5

LegA-cpR1

GCATGAGTACATGCCATATAC

6

pCambia SeqF

CATTAGGCACCCCAGGCTTTACAC

7

pCambia SeqR

CTGATCCAAGCTCAAGCTGCTC

8

KuA-For1

CTTTGAGACTCGCATTATTCTC

9

KuA-Rev1

TCAATTCAGGCGATACAACATC

10

KuB-For1

CGTGTTGCTCGCAAGTTATCC

11

KuB-Rev1

TACGCCGTTGTGACGAGAAC

12

KuB-Rev2

GAAAGGGATGTCTACCGCATC

13

KuBXmaFor

CCCGGGTCTAATGACGACTCAGGT

14

KuBXmaRev

CCCGGGAGACTCAGTCTCACAGG

15

KuAEcoRev

GAATTCATGGGCGCGCAAAAGGAC

16

KuAEcoFor

GAATTCTTTGAAATGTTTCAGATAATGC

17

B3-KuMV-CP

CCAACATGGGAAATATCATGCCT

2.2. Nội dung nghiên cứu
- PCR kiểm tra các mẫu đậu tương bệnh đã được thu thập với mồi đặc hiệu
phát hiện DNA-A của KuMV.
- RCA nhân toàn bộ bộ gene của virus đối với một số mẫu bệnh đã kiểm tra
dương với KuMV.
- Cắt sản phẩm RCA bằng enzyme cắt giới hạn để thu các sản phẩm
monomer hoặc dimer bộ gene virus.
- Nối các sản phẩm monomer hoặc dimer vào vector pCAMBIA 2300 và
nhân dòng trong E.coli.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 16