kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử

1


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM



BÁO CÁO THỰC HÀNH
KỸ THUẬT DI TRUYỀN VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ









Nhóm 1
Giảng viên: TS. Nguyễn Huy Thuần
Họ và tên sinh viên: Đỗ Thị Hào
MSSV: DTN1153150024
Lớp: 43 CNSH
Khoa: CNSH& CNTP

Thái Nguyên, 2013

2

Bài 1
TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ E. COLI

I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc
bao bọc của tế bào, để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân
tử. Điều quan tâm là thu nhận được các phân tử DNA ở trạng thái nguyên vẹn
không bị phân hủy.
Cách pha hóa chất.
- Dung dịch đệm CTAB:
+ CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide): 2g
+ Tris-HCl (pH8): 1,5756 g
+ EDTA (Na
2
H
2
EDTA.2H
2

O): 0,58448 g
+ NaCl: 8,14 g
+ H
2
O: 100 ml
+ β-mercaptoethanol: 0,2 ml (chỉ bổ sung ngay trước khi sử dụng)

3
Dung dịch đệm CTAB có tác dụng phá màng tế bào , bào quan, giải phóng
ra DNA.
EDTA có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme DNase, bảo vệ DNA, phá
vỡ liên kết hóa trị II và do đó làm giảm tính bền vững của lớp màng ngoài
tế bào vi khuẩn.

- Dung dịch CIAA:
+ 24 ml chloroform
+ 1 ml isoamylalcohol
Chloroform không tan trong nước, do đó khi bổ sung vào dịch nuôi tế
bào sẽ làm cho dịch này phân thành 2 lớp( pha). Hỗn hợp ly tâm
mạnh để phân tách lớp. Protein bị kết tủa sẽ nằm ở pha giữa.
Isoamylancohol là 1 ancohol với sự có mặt của cation hóa trị I ( NA
+
,
K
+
, NH
4
+
) có tác dụng làm kết tủa DNA.

- Dung dịch TE 1x:
+ Tris: 0,1212 g
+ EDTA: 0,03 g
+ H
2
O: 100 ml
+ pH =8.0
- Cồn 70%:
+ cồn tuyệt đối: 70 ml
+ H
2
O: 30 ml
Sử dụng cồn tuyệt đối để loại bỏ một số muối lẫn tạp trong dung dịch
mà chúng kết tủa theo DNA.
II. CÁCH TIẾN HÀNH
3.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc tách chiết DNA từ tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn là
như nhau. Tuỳ từng loại mẫu phẩm sinh học, tuỳ từng mục đích nghiên cứu và
điều kiện phòng thí nghiệm có thể sử dụng các kỹ thuật tách chiết với các loại
hoá chất và dung môi khác nhau.
Các phương pháp tách chiết DNA thường được dùng gồm:
1. Phương pháp CTAB
2. Phương pháp PVP
3. Phương pháp phenol/chloroform

4
4. Phương pháp Silica
5. Phương pháp Guanidine-chloroform.
Trong phạm vi bài giảng thực hành này sẽ giới thiệu cách tách chiết DNA
tổng số theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl amomnium bromide) -

phương pháp 1. Do tác giả Gawel và cộng sự đưa ra năm 1991 và đã có sự cải
tiến.
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là
nghiền và các hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu là màng nhân, tạo thành hỗn
hợp đựng trong các ống Ependorp. Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, các hóa
chất và loại bỏ những thành phần không mong muốn, từ đó thu nhận DNA.
3.2. Quy trình tách DNA (Gồm 10 bước)
A. Bước 1: Bước chuẩn bị mẫu
Lấy 1.5 ml dịch nuôi vi khuẩn E. coli cho vào ống eppendoft 1.5 ml. Ly
tâm 5000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi để thu sinh khối tế bào. Lưu ý trình tự của
các mẫu phải sắp xếp phù hợp với số ống eppendorp (phần sau gọi là ống mẫu).
Đánh số thứ tự trên eppendorp bằng bút dạ không bị nhòe bởi nước theo thứ tự
mẫu (hình 4).
B. Bước 2: Tách DNA, loại bỏ protein và các thành phần không mong
muốn.
+ Bổ sung vào eppendorf chứa mẫu đã nghiền 500 µl dung dịch đệm CTAB,
đảo trộn đều mẫu bằng máy vortex sao cho mẫu tan đều trong dung dịch đệm. Sau
đó ủ ở 60
o
C trong 1h bằng máy lắc ổn nhiệt (hình 5). Nếu trường hợp không có
máy lắc ổn nhiệt thì ủ mẫu trong 60
o
C trong 1 h, cứ 10 lại lấy ra đảo trộn đều 1 lần
bằng máy vortex.
+ Sau 1 h, lấy eppendorf chứa mẫu ra, ly tâm nhẹ để toàn bộ dung dịch lắng
xuống đáy ống. Sau đó bổ sung 500 µl dung dịch CIAA, đảo trộn bằng máy
vortex trong vòng 30 giây.
+ Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
Chú ý: đặt eppendorf phải đối xứng nhau trong máy ly tâm (hình 6). Trong
trường hợp số lượng ống eppendorf lẻ, cần phải thêm 1 ống khác có trọng lượng

tương đương làm đối trọng.
+ Sau khi ly tâm, nhẹ nhàng lấy mẫu ra khỏi máy ly tâm rồi đặt vào giá để
eppendorf. Lúc này trong ống eppendorf có sự phân 3 pha bao gồm: pha dưới là
dung dịch, pha giữa là phần cặn xác tế bào và pha trên là dung dịch chứa DNA hòa
tan .

5



+ Dùng micropipette 200 µl hút nhẹ nhàng 300 µl dung dịch ở pha trên
sang ống eppendorf 1,5ml vô trùng mới. Chú ý: không được hút phần cặn tế bào
ở pha giữa. Tốt nhất là không nên hút hết toàn bộ phần dung dịch pha trên.
C. Bước 3: Kết tủa DNA
+ Bổ sung vào eppendorf 50 µl CH
3
COONa 3M (pH5.5) và 300 µl
isopropanol. Dùng micropipette 200 µl đảo trộn đều toàn bộ khối dung dịch
trong ống eppendorf. Lưu ý: dùng micropipette hút lên xuống khối dung
dịch thật nhẹ nhàng với tốc độ chậm để tránh dung dịch bị bắn ra ngoài.
+ Ly tâm nhẹ để khối dung dịch lắng xuống phía dưới của ống
eppendorf.
+ Đặt eppendorf chứa mẫu DNA vào tủ lạnh -20
o
C trong 2h.
+ Sau 2 h, lấy eppendorf chứa mẫu ra khỏi tủ lạnh, ly tâm 10.000
vòng/phút trong 30 phút.
+ Sau khi ly tâm, dùng micropipette cẩn thận loại bỏ toàn bộ phần
dung dịch sau cho không được hút phần cặn DNA bám dưới đáy ống
eppendorf (màu trắng đục). Sau khi hút phần dung dịch lần thứ nhất có thể

đặt eppendorf vào máy ly tâm rồi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để
toàn bộ phần dung dịch bám trên thành ống di chuyển xuống phía đáy ống
rồi hút loại bỏ hoàn toàn phần dung dịch.
D. Rửa kết tủa DNA.
+ Bổ sung vào eppendorf 1000 µl dung dịch cồn 70% rồi đảo trộn
mạnh bằng máy vortex sao cho phần cặn DNA long ra khỏi đáy ống.
+ Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Dùng micropipette 200 µl
hút loại bỏ hoàn toàn dung dịch cồn 70% ra khỏi ống. Ly tâm ống 10.000
vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ hoàn toàn dung dịch cồn 70% khỏi ống
lần 2.
+ Mở nắp eppendorf rồi để khô tự nhiên kết tủa DNA cho đến khi
trong eppendorf không còn mùi cồn và khô hoàn toàn (khoảng 10-15
phút) ở nơi sạch, thoáng, không có người qua lại. Tốt nhất là để khô tự
nhiên kết tủa DNA trong tủ Hood.
E. Hòa tan DNA

6
+ Bổ sung vào eppendorf chứa kết tủa DNA 100 µl dung dịch đệm TE
1x. rồi đảo trộn bằng máy vortex. Ủ eppendorf ở 70
o
C trong 10 phút trên
máy lắc ổn nhiệt.
F. Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di trên gel agaro
Kết quả thu được của nhóm 1:

Hình 1: Điện di tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E.coli
Nhận xét:
Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, không có DNA bị đứt
gãy, tuy nhiên lượng DNA thu được ít nên vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra
vẫn còn tạp chất như protein, không bị lẫn RNA, mẫu số 6 thành công nhất, sau

đó mẫu số 2,7,8 và 9 chấp nhận được, các mẫu còn lại tương đối, mẫu số 3,4,5
lẫn tạp khá nhiều protein.
- Giếng số 1: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch
gọn nhỏ, không có DNA bị đứt gãy, tuy nhiên lượng DNA thu
được ít nên vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra vẫn còn tạp
chất như protein, không bị lẫn RNA.
- Giếng số 2:Lượng DNA thu được ít ( hình ảnh bị mờ nên
không nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị
lẫn tạp chất protein bị dính ở miệng và giếng và RNA ở cuối
đường chạy điện di.
- Giếng số 3: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch
gọn nhỏ, tuy nhiên lượng DNA thu được ít nên vạch không
sáng rõ, còn mờ, ngoài ra vẫn còn lẫn tạp chất như protein và
RNA, DNA bị đứt gãy.

7
- Giếng số 4: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA
không bị đứt gãy, tuy nhiên còn lẫn tạp nhiều protein và RNA
ở cuối đường chạy điện di.
- Giếng số 5: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA
không bị đứt gãy, tuy nhiên còn lẫn tạp nhiều protein và RNA
ở cuối đường chạy điện di.

- Giếng số 6: Tách chiết DNA tổng số thành công, DNA không
bị đứt gãy, không lẫn RNA và protein.
- Giếng số 7: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch
gọn nhỏ, lượng DNA thu được ít,( hình ảnh bị mờ nên không
nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị lẫn tạp
chất protein bị dính ở miệng và giếng và RNA ở cuối đường
chạy điện di.

- Giếng số 8: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch
gọn nhỏ, lượng DNA thu được ít,( hình ảnh bị mờ nên không
nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị lẫn tạp
chất protein bị dính ở miệng và giếng và RNA ở cuối đường
chạy điện di.

- Giếng số 9: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch
gọn nhỏ, lượng DNA thu được ít,( hình ảnh bị mờ nên không
nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị lẫn tạp
chất protein khá nhiều bị dính ở miệng giếng, tuy nhiên giếng
9 không bị lẫn RNA.
IV. Giải thích
Nguyên lí của quá trình tách chiết phá vỡ tế bào vi khuẩn E.coli:
- Phá vỡ tế bào , màng tế bào và mô.
- Loại bỏ tạp chất không phải DNA ( Protein, lipid, đường…)
- Phá vỡ tế bào bằng cách xử lí nhiệt, dung lực mạnh hơn để
phá vỡ liên kết, lực cơ học đảo trộn bằng máy vortex.
- CTAB : Chất tẩy rửa thường dùng để phá vỡ màng tế bào,
bào mòn màng tế bào. Màng tế bào là lớp kép phospholipid,
CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hòa tan.
Trong dung dịch đệm có các thành phần:
- Tris- HCl: ổn định pH.

8
- EDTA: Có ái lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim
loại nặng, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của enzyme DNase,
enzyme nội bào hấp thụ Ca
+
, Mg

+
canh tranh với enzyme làm
enzyme không hoạt động.
- Khi bổ sung CTAB thì ủ ở 65ºC trong 1h và 10 phút đảo trộn
1 lần.
- CTAB hoạt động mạnh hiệu quả ở nhiệt độ khoảng 60- 70ºC,
mạnh hơn khi có ái lực cơ học tác động vào ( CTAB hoạt
động trong trường hợp có NaCl).
- CIAA bổ sung để tách chiết DNA, loại bỏ protein và các
thành phần khác không mong muốn, chloroform không kết
tủa DNA, có tác dụng biến tính CTAB, kết tủa CTAB.
- Isoamyalcohol: Loại bỏ, giảm khả năng tạo bọt, đồng thời
giúp tăng cường hỗ trợ khả năng kết tủa protein, hỗ trợ sự
phân pha. Sau khi bổ sung CIAA ly tâm thì có hiện tượng
phân pha ( 3 pha).
+ Pha trên : Là DNA.
+ Pha giữa: Chứa protein.
+ Pha dưới: Chứa xác cặn tế bào và dung dịch chloroform.
- CH
3
COONa 3M pH 5.5 : ion Na
+
vào trung hòa DNA triệt
tiêu khả năng hòa tan DNA, bổ sung isopropanol sẽ kết tủa
được DNA, phân tách và thu được DNA ( CH
3
COONa,
CH
3
COOK, NaCl : hỗ trợ kết tủa nhanh hơn).

- Rửa tủa bằng cồn 70%, không sử dụng nước cất để rửa để rửa
tủa vì DNA bị hòa tan trong nước không hòa tan trong cồn.
Nếu tủa lẫn muối : Muối hòa tan trong cồn 70%, cồn 100%
muối không tan, cồn kết tủa cả protein vì cậy khi rửa tủa bằng
cồn xong thì hút hết hết cồn và làm bay hơi hết cồn. Nếu còn
cồn sẽ làm biến tính enzyme không thực hiện được các phản
ứng sinh học phân tử tiếp theo.
- Hòa tan DNA bằng TE 1X hoặc nước khử ion, nước khử ion
và TE 1X đều có thể hòa tan tủa DNA nhưng ít khi sử dụng
nước khử ion vì rửa tủa bằng TE 1X hiệu quả hơn có thể bảo
quản được lâu, TE bảo quản tốt nhất vì có chứa EDTA ái lực
với ion kim loại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của
enzyme giúp bảo quản được lâu.
Hạn chế của TE là khi có sự có mặt của EDTA ức chế các
enzyme các phản ứng sinh học phân tử sau này. Cho nên sử
dụng TE ở nồng độ loãng, nếu không sẽ ức chế các phản ứng
sinh học sau này.
Sử dụng TE 1X là được.




9
Bài 2
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ DNA BẰNG QUANG PHỔ KẾ

I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
Phương pháp định lượng acid nucleic được sử dụng phổ biến nhất là
phương pháp quang phổ do tính tiện dụng và chỉ số tin cậy ở mức cho phép.

II. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.1 Thiết bị, dụng cụ
- Máy đo OD bước sóng 260 và 280 nm
- Pipet
- Đầu tip các loại
- Cuvet
2.2. Hóa chất và cách pha hóa chất
- Nước khử ion
III. CÁCH TIẾN HÀNH
3.1. Nguyên lý
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên sự hấp thụ tia tử ngoại ở bước
sóng 260 nm của các base. Một dung dịch chứa càng nhiều acid nucleic, hay nói
cách khác nồng độ acid nucleic càng cao, thì càng hấp thụ nhiều ánh sáng. Do đó
nồng độ acid nucleic được tính theo tương quan giá trị mật độ quang học tại
bước sóng 260 nm (Optical Density260nm - OD260). Một đơn vị OD260 tương
ứng với nồng độ 50 µg/ml đối với dung dịch chứa DNA mạch kép và 40 µg/ml
đối với RNA và DNA mạch đơn.

3.2. Các bước tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị cuvet.
- Lấy cuvet ra khỏi dung dịch bảo vệ. Rửa sạch bằng nước cất 2 lần.
Bước 2: Chuẩn bị blank
- Lấy 2 ml nước khử ion cho vào 1 cuvet
Bước 3: Bố trí dãy pha loãng

10
- Lấy 2 ml nước khử ion cho vào 3 cuvet khác, sắp theo thứ tự 1,2,3.
- Lấy 20 µl DNA cho vào cuvet thứ nhất, trộn đều bằng pipet
- Lấy 20 µl từ cuvet thứ nhất cho sang cuvet thứ 2, trộn đều
- Lấy 20 µl từ cuvet thứ hai cho sang cuvet thứ 3, trộn đều

Bước 4: Đo OD bằng máy
- Chọn chế độ đo OD 260/280
- Đưa cuvet blank vào, chuẩn hóa
- Lần lượt đưa cuvet 1,2,3 vào và đo OD, ghi lại kết quả
Bước 5: Tính toán và kết luận
- Từ số liệu thu được, tính toán nồng độ DNA trong dung dịch gốc
bằng cách nhân với 1000.
- Dựng đường chuẩn với 3 điểm
- Kết luận về độ sạch của DNA dựa trên chỉ số OD260/280.
IV. Nhận xét: Đã sử dụng mẫu 16 ( tách DNA tổng số khá
thành công) để tiến hành trong bài này , tuy nhiên do nhân tố chủ
quan nên mẫu không cho được kết quả.

11
Bài 3
ĐIỆN DI TRONG GEL AGAROSE

I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng
và hàm lượng DNA. Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của
axít nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu
tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
II. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.1 Thiết bị, dụng cụ
- Bộ điện di DNA: Nguồn điện di (80 - 120V), giá và bể điện di, lược tạo
giếng điện di, khay thăng bằng nhờ giọt nước đổ bản gel.
- Cân điện tử
- Bình chịu nhiệt để đun agarose
- Lò vi sóng

- Ống eppendorp loại 2 ml
- Khay nhựa có nắp kín kích thước (10 x 20 x 30 cm) để nhuộm bản gel
- Máy lắc
- Máy soi gen
- Máy chụp ảnh (nếu có)
2.2. Hóa chất và cách pha hóa chất
- Agarose
- TAE 1X. TAE 1X được pha từ TAE 50X stock bao gồm:
+ 242 gam Tris base (FW = 121)
+ 57,1 ml glacial actic axit (axit axetic băng)
+ 100 ml EDTA (pH = 8)
+ Bổ sung nước cất lên thể tích 1lít.
Khi pha 1X sẽ cần 1 ml dung dịch 50X stock + 9 ml nước cất.
- Ethydium Bromide Solution nhuộm ở nồng độ 0,5% (0,5 μl/ml)

12
- Dye 6X. Dye 6X được pha loãng từ Dye 10X. Trong đó 10X sample
buffer stock bao gồm: 50% glycerol, 0,25% bromophenol, 0,25% xylene cyanole
FF và pha trong 1 x TAE buffer. Ví dụ: Để pha được 10 ml Dye 10X cần:
+ 5ml glycerol
+ 0,25% x 10 gam bromophenol
+ 0,25% x 10 gam xylene
+ Còn lại là 1 x TAE
10 ml Dye 6X sẽ được pha từ 6 ml Dye 10 X + 4 ml nước cất.
III. NỘI DUNG THÍ NGHIỆM
3.1. Nguyên lý
Dựa vào đặc tính cấu trúc của axít nucleic là đại phân tử tích điện âm
đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường chúng sẽ
di chuyển về cực dương của điện trường.
3.2. Các bước tiến hành

- Bước 1: Pha 0,8 gam agarose trong 100 ml TAE 1X, đun sôi bằng lò vi
sóng. Lưu ý khi đun bằng bình chịu nhiệt có nắp không được đậy nắp kín, hoặc
đun bằng cốc thủy tinh chỉ nên đổ khoảng 2 phần 3 thể tích cốc nhằm tránh tràn
khi sôi. Đun sôi để nguội đến 60
o
C (khi có thể dùng tai cầm được bình đựng
agarose là được) mới tiến hành đổ bản gel.
- Bước 2: Trước khi đổ bản gel cần lau sạch giá đổ bằng giấy thấm mềm
dễ hút nước sau đó mới cài lược. Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể
điện di. Tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước trên giá .
Đổ bản gel, bản gel trong bài thực hành này có kích thước dài 10 cm,
rộng 6,5 cm và cao 0,4 cm. Mỗi giếng sâu 0,3 cm, thể tích giếng chứa được 0,8
μl mẫu. Do vậy mỗi bản gel cần đổ 50 ml. Đợi khoảng 1 giờ cho khô và tháo
lược (hình 9 và 10).
- Bước 3: Đổ khoảng 150 ml dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung
tích TAE có thể linh động thay đổi để phù hợp khi đặt bản gel trong bể.
- Bước 4: Đặt bản gel (hình 10) vào bể điện di, lưu ý có thể thêm hay bớt
dung dịch TAE 1X, để được bản gel ngập 0,1 cm (1mm) so với bề mặt dung
dịch điện di.
- Bước 5: Lấy 10 μl ở các mẫu DNA đã tách chiết trộn với 2μl Dye 6X
bằng các ống eppendorp mới (đã ghi thứ tự), vẩy nhẹ tay để mẫu DNA được trộn
đều với Dye 6X. Cho cẩn thận hỗn hợp 8μl ở ống vào giếng điện di bằng

13
micropipet. Ghi chép lại thứ tự của ống mẫu tương ứng với thứ tự của giếng.
Mỗi ống mẫu được dùng một đầu côn hút riêng. Khi tra mẫu vào giếng, một tay
tỳ lên thành giá của điện di làm điểm dựa, tay kia đưa micropipet sao cho đầu
côn vừa sát miệng giếng rồi bơm từ micropipet ra. Cần lưu ý thao tác này nếu
không cẩn thận sẽ làm tràn ra ngoài giếng hoặc vỡ miệng giếng .
- Bước 6: Chạy điện di ở điện thế 100V trong 30 phút (hình 12). Lúc này

quan sát bằng mắt thường có thể thấy hỗn hợp mẫu trong giếng điện di dịch
chuyển chậm từ phía cực âm sang cực dương. Trên hình 12 là bộ điên di Power
station - 300 do hãng Labonet của Mỹ sản xuất năm 2002.
- Bước 7: Lấy bản gel từ bể điện di ra nhuộm trong ethydium bromid
0,5μl/ml trong 10 phút, thao tác nhuộm được thực hiện trên máy lắc, tốc độ
chậm, chỉ khoảng 50-70 vòng/phút. Lưu ý khi mang bản gel nhuộm cần cẩn thận
vì ethydium bromid rất độc hại với người và môi trường. Do đó, để giảm thiểu
việc tiếp xúc trực tiếp, cần dùng bằng thìa to, dạng bản, có cán dài (hình 13) để
đưa bản gel vào khay nhuộm, lấy ra khỏi khay, mang rửa lại bằng nước sạch,
đến khi đưa bản gel lên máy soi.
- Bước 8: Soi bản gel trên máy tia tử ngoại, khi đó các axít nucleic trong
gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) có bước sóng λ ≈ 300 nm nhờ
ethydium bromid. Chất này có khả năng xen gắn vào giữa các bazơ của axít
nucleic làm chúng phát sáng dưới dạng những vạch màu đỏ cam, dễ quan sát và
chụp ảnh.


IV. Nhận xét:
- Điện di xác định độ tinh sạch, nguyên vẹn của DNA nhưng chỉ định
tính ( có hay không, nhiều hay ít, sáng hay mờ). Băng sáng thì
nhiều, băng mờ thì ít.
- Xác định độ tinh sạch: Lẫn tạp protein, RNA, protein điện tích
không rõ ràng thường bám vào DNA.
- Độ nguyên vẹn hoàn toàn không có nghĩa là toàn bộ đoạn DNA mà
là các dải đứt gãy lớn đảm bảo nguyên vẹn ( băng sáng).



14
Bài 4

KỸ THUẬT PCR


I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
PCR (Polymerase Chain Reaction) lần đầu tiên được Karl Mulis mô tả năm
1984. Phản ứng chuỗi polymerase là một kỹ thuật đơn giản cho phép nhân bản nhanh
một trình tự DNA lên rất nhiều lần trong vài giờ. PCR được thực hiện khi có khuôn,
Taq-polymerase, các mồi chuyên biệt gồm, bốn loại deoxy-ribonucleotide
triphotphate (dNTP), dung dịch đệm và ion Mg
2+
. PCR là một công cụ hữu hiệu cho
việc phân tích gen, vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu
từ bất kỳ cơ thể nào.
II. DỤNG CỤ HÓA CHẤT
2.1. Dụng cụ
- Lò vi sóng
- Cân điện tử
- Bình chịu nhiệt 500 ml
- Ống PCR
- Máy ly tâm
- Máy lắc
- Máy PCR
- Bộ điện di
- Máy soi gen
2.1. Hóa chất và các thành phần của phản ứng PCR
- Enzyme Taq polymerase
- Buffer PCR
- MgCl
2

PCR
- Nước cất đã khử ion
- Đoạn DNA làm mồi (primer) gồm: Hai đoạn mồi chuyên biệt mồi xuôi
“sens primer” hay “forward primer” và mồi ngược “antinsens primer” hay

15
“reverse primer”, chúng là những đoạn DNA mạch đơn ngắn (olgonucleotide) có
khả năng bắt cặp bổ sung với đầu 3’ theo chiều phiên mã của gen.
- dNTP gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP và dGTP
- Ethydium bromid
III. CÁCH TIẾN HÀNH
3.1. Nguyên lý
Phản ứng chuỗi polymerase là một kỹ thuật đơn giản cho phép nhân bản
nhanh một trình tự DNA lên rất nhiều lần trong vài giờ. PCR được thực hiện khi
có khuôn, Taq-polymerase, các mồi chuyên biệt gồm, bốn loại
deoxyribonucleotide triphotphate (dNTP), dung dịch đệm và ion Mg
2+
.
3.2. Các bước thực hiện
- Bước 1: Trộn các thành phần đã nêu trên trong ống eppendorp loại 1.5 ml
và đưa vào ống PCR với thể tích 25μl đến 50μl, cho vào máy ly tâm ở tốc độ nhẹ
(spin) 3000 vòng/phút. Bước này nhằm để các thành phần nêu trên lắng xuống đáy
ống PCR.
Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR như sau:
TT Thành phần phản ứng Hàm lượng (µl)
1
10x Buffer 2,5
2
25 mM MgCl2 1,5
3

Primer F 1,0
4
Primer R 1,0
5
100 µM dNTPs 1,5
6
5U DNA taq polymerase 0,2
7
DNA khuôn 2,0
8
H
2
O khử ion 15,3
Tổng
25


Bước 2: Chạy PCR khuếch đại vùng trình tự gen mục tiêu
Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau:
- Biến tính ban đầu: 94
o
C trong 5 phút
- Khuếch đại: 35 chu kỳ gồm các bước:

16
+ Biến tính: 94
o
C trong 30 giây
+ Gắn mồi: 55
o

C trong 30 giây
+ Kéo dài: 72
o
C trong 45 giây
- Kéo dài cuối cùng: 72
o
C trong 5 phút
- Ủ bảo quản: 4
o
C trong ∞
Dưới đây là mô tả và cách vận hành trên máy PCR - System - 9700 của
do hãnh Applied Biosystem của Mỹ sản xuất năm 2002.
- Bước 3: Kiểm tra sản phẩm nhân gen bằng phương pháp điện di trên
agarose 1% trong 40 phút.
- Bước 4: Nhuộm bản gel trong ethydium bromid 10 phút
- Bước 5: Soi và chụp ảnh (Sử dụng các bước trong bài 2).
IV. Kết quả thu được:

Nhận xét: Mẫu 2 và 4 thành công, mẫu 1 và 3 không thành công.

17
Bài 5
TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR
I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
Sản phẩm PCR của bài 5 sẽ được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Điều kiện tiên quyết của sản phẩm PCR là phải sạch, không lẫn các sản phẩm
phụ và không còn sót các thành phần khác của PCR như enzyme, muối, dNTP
Bài thực hành này sẽ thực hiện thao tác tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương
pháp cho qua cột.
II. CÁCH TIẾN HÀNH
3.1. Nguyên tắc
Một số thí nghiệm như giải trình tự gene cần nguồn DNA có độ tinh khiết
cao. Tinh sạch qua cột là cách làm phổ biến nhất để đáp ứng yêu cầu này. Bài
thực hành này dựa trên nguyên lý sắc ký chọn lọc kích thước. Dung dịch chứa
DNA hòa tan chảy qua một mạng lưới cấu tạo bởi các lỗ nhỏ và các hạt hấp thụ.
Các phân tử nhỏ như muối và các nucleotide riêng lẻ sẽ chui vào trong các hạt
hấp thụ, còn các phân tử lớn như các phân đoạn acid nucleic sẽ đi qua các lỗ.
Đây là một phương pháp khá nhanh và đơn giản để tinh sạch acid nucleic.

3.2. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và cột
- Bổ sung 5 lần thể tích Buffer PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR. Trộn
đều bằng pipet. Ví dụ: bổ sung 200µl Buffer PB vào 20 µl sản phẩm
PCR.
- Đặt cột vào ống chứa 2 ml.
Bước 2: Bám DNA lên cột
- Chuyển hỗn hợp DNA ở bước 1 lên cột bằng micropipette 500 ml.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút.
- Loại bỏ dung dịch trong ống thu 2 ml.

Bước 3: Rửa trôi các thành phần không mong muốn
- Bổ sung 750 µl Buffer PE lên cột.
- Ly tâm 10,000 vòng/phút trong 30 giây.
- Chuyển cột sang ống eppendoft 1.5 ml mới.
- Loại bỏ cột thu 2 ml.

18
Bước 4: Đẩy DNA ra khỏi cột và thu nhận
- Dùng micropipette 100 µl để nhỏ 20 µl Buffer EB vào chính giữa
của màng.
- Ly tâm 12,000 v/p trong 4 phút.
- Loại bỏ cột.
Bước 5: Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di trên gel agarose
IV. Kết quả:
Mẫu không lên sản phẩm , lỗi có thể do hóa chất hoặc thao tác trong quá trình
thực hiện.




19
Bài 6
CẮT DNA BẰNG ENZYME GIỚI HẠN

I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
Mục đích
Endonuclease giới hạn hay còn gọi là enzyme giới hạn là những enzyme
có khả năng nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu và phá vỡ liên kết
phosphodiester ngay tại đó. Bài thực tập này cho phép sinh viên sử dụng enzyme
giới hạn HindIII để cắt vector pRSET-A từ dạng mạch vòng thành dạng mạch

thẳng.
II. DỤNG CỤ HÓA CHẤT
2.1. Dụng cụ
- Bể ổn nhiệt
- Ống eppendoft 1.5 ml
- Micropipet các loại
- Máy ly tâm
- Bộ điện di
- Máy soi gen
2.1. Hóa chất và các thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn
- Enzyme giới hạn ECoRI
- Buffer
- Plasmid pRSET
- Nước khử ion
- Và bao gồm toàn bộ các thành phần của bài điện di.
III. CÁCH TIẾN HÀNH
3.1. Nguyên lý
Endonuclease giới hạn hay còn gọi là enzyme giới hạn là những enzyme
có khả năng nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu và phá vỡ liên kết
phosphodiester ngay tại đó. Enzyme giới hạn ECoRI có 1 vị trí nhận biết duy
nhất trên vector do đó khi cắt vector này sẽ bị chuyển từ dạng mạch vòng sang
dạng mạch thẳng và phân biệt được trên bản gel điện di.


20
3.2. Các bước thực hiện
- Bước 1: Trộn các thành phần đã nêu trên trong ống eppendorp loại 1.5 ml,
cho vào máy ly tâm ở tốc độ nhẹ (spin). Bước này nhằm để các thành phần nêu trên
lắng xuống đáy ống.
Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt enzyme HindIII:

TT Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
1
10x Buffer 1,5
2
Plasmid pRSET 2,5
3
ECoRI 0.5
4
H
2
O 1,0
Tổng
15

- Bước 2: Ủ phản ứng ở 37
o
C trong 1h để enzyme hoạt động.
- Bước 3: Kiểm tra sản phẩm nhân gen bằng phương pháp điện di trên
agarose 1% trong 40 phút.
IV. Kết quả:

Nhận xét:
Cắt bằng enzyme giới hạn thành công, đã được cắt sau điện di cho ta hình
ảnh 1 vạch chứng tỏ enzyme đã đã cắt plasmid thành công. ( Giếng số 2,3 và
5,6).