Ngiên cứu sản xuất một số chế phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị hội chứng hô hấp trên lợn và gà

Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành dưới sự giúp đỡ tận tình của thầy (cô)
khoa Hóa học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 cùng cán bộ Viện Hóa Sinh
Biển – Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Với tất cả lòng biết
ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng đã giao
cho em đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Phan Văn Kiệm cùng
các cán bộ phòng Nghiên cứu cấu trúc hóa học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo
em trong quá trình làm thực ngiệm để hoàn thành khóa luận này.
Khóa luận này được hoàn thành với hỗ trợ của đề tài “ Nghiên cứu sản
xuất một số chế phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị hội chứng
hô hấp trên lợn và gà’’ do PGS.TS. Lã Văn Kính, Viện Khoa học Kỹ thuật
Nông nghiệp miền Nam làm chủ nhiệm đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy (cô) khoa Hóa học trường Đại Học
Sư Phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ em trong thời gian học tập, tu dưỡng tại trường.
Bản thân em đã cố gắng để hoàn thành khóa luận, nhưng cũng không
tránh khỏi những thiếu xót. Vì vậy, em kính mong sự đóng góp ý kiến quý
báu của thầy (cô) và các bạn đọc để khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn.
Hà Nội, tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Mai Hương

Nguyễn Thị Mai Hương

K35C – Khoa Hóa học

Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Morus alba ............................. 3
1.1.1. Mô tả ....................................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố và sinh thái ................................................................................ 4
1.1.3. Công dụng ............................................................................................... 4
1.1.4. Thành phần hóa học ................................................................................ 4
1.1.5. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Morus alba. ......................... 5
1.2. Giới thiệu về lớp chất flavonoit. .............................................................. 6
1.2.1. Giới thiệu chung . .................................................................................... 6
1.2.2. Các nhóm flavonoit..........................................................................................7
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật. ................................................. 13
1.3.1. Chọn dung môi chiết ............................................................................. 13
1.3.2. Quá trình chiết. ..............................................................................................16
1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ. ................. 17
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí. ............................................ 17
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí. ............................................................. 18
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí. ....................................................... 18
1.5. Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. 20
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR). ....................................... 20
1.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) ............................................ 21
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ................................................................. 22
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 25
2.1. Mẫu thực vật ........................................................................................... 25
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất. ................................................... 25
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................ 25
Nguyễn Thị Mai Hương

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ...................................................................... 25
2.2.3. Sắc ký cột (CC)...................................................................................... 25
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. ...................... 25
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) ........................................................................... 25
2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) ...................................................................... 26
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)..................................................... 26
2.3.4. Độ quay cực []D ................................................................................. 26
2.4. Dụng cụ và thiết bị. ................................................................................ 26
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết. .............................................................. 26
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc. .................................................. 27
2.5. Hoá chất. ................................................................................................. 27
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ......................................... 28
3.1. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất.......................................... 28
3.1.1. Xử lý mẫu .............................................................................................. 28
3.1.2. Chiết tách và phân lập các hợp chất ..................................................... 28
3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất. ................................. 31
3.2.1.Hợp chất 1 - Sanggenon J. ..................................................................... 31

3.2.2. Hợp chất 2- Atalantoflavone. ................................................................ 31
CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ...................................................... 32
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 ( Sanggenon J ) ............... 32
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 ( Atalantoflavone ). ......... 37
KẾT LUẬN .................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 43

Nguyễn Thị Mai Hương

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ

Hình 1.1

Lá dâu tằm

3

Hình 1.2

Flavan

7

Hình 1.3

Flavon

8

Hình 1.4

Flavonol

8

Hình 1.5

Flavanon

9

Hình 1.6

Flavonon và Chalcon

9

Hình 1.7

Flavanonol-3

9

Hình 1.8

Taxifolin

9

Hình 1.9

Chalcon

10

Hình 1.10

Auron

10

Hình 1.11

Antoxianidin

10

Hình 1.12

Các dạng chuyển hoá của antoxianidin

11

Hình 1.13

Leucoantoxianidin

11

Hình 1.14

(-) Catechin

11

Hình 1.15

(+) Catechin

12

Hình 1.16

3-phenyl chromen

12

Hình 1.17

Isoflavon

12

Hình 1.18

Isoflavanon

12

Hình 1.19

Rotenoid

13

Sơ đồ 1

Sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết metanol từ lá dâu

29

tằm (Morus abla)
Sơ đồ 2

Sơ đồ phân lập phân đoạn cloroform từ lá dâu tằm

30

Hình 4.1.a

Phổ proton 1H của hợp chất 1

32

Hình 4.1.b Phổ cacbon 13C của hợp chất 1

Nguyễn Thị Mai Hương

33

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Hình 4.1.c

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Phổ 13C và DEPT của hợp chất 1

33

Hình 4.1.d Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 1

34

Hình 4.1.e

Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 1

35

Hình 4.1.f

Các tương tác HMBC chính (HC) của hợp chất 1

35

Hình 4.1.g

Cấu trúc hóa học của hợp chất 1

35

Hình 4.2.a

Phổ proton 1H của hợp chất 2

38

Hình 4.2.b Phổ cacbon 13C của hợp chất 2
Hình 4.2.c

Phổ cacbon 13C và DEPT của hợp chất 2

39
39

Hình 4.2.d Cấu trúc hóa học của hợp chất 1

40

Bảng 4.1.1 Số liệu phổ của hợp chất 1

36

Bảng 4.2.2 Số liệu phổ của hợp chất 2

40

Nguyễn Thị Mai Hương

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
[]D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

C NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
1

H NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-1H COSY

1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectrometry

FAB-MS

Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High
Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry
IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

Nguyễn Thị Mai Hương

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, có bốn mùa rõ
rệt, có độ ẩm trên 80% và có lượng mưa lớn. Đây chính là điều kiện thuận lợi
để các thảm thực vật phát triển. Nước ta hiện có một hệ thống thảm thực vật
phong phú và đa dạng với khoảng 12000 loài, trong đó có khoảng 4000 loài
được nhân dân sử dụng làm thảo dược để phục vụ cho mục đích chữa bệnh. [1]
Sử dụng cây cỏ để làm thuốc luôn gắn liền với lịch sử tồn tại và phát
triển của xã hội loài người. Từ xa xưa, cha ông ta đã biết sử dụng thực vật để
nuôi sống bản thân đồng thời cũng dùng để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe
cho chính mình. Hầu hết các loài cây thuốc đều có chứa các hoạt chất sinh
học, vì tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc chủ yếu là do các hợp chất tự
nhiên đặc biệt là các hợp chất trao đổi thứ cấp. Việc sử dụng các hợp chất
thiên nhiên và sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên đang là mối quan tâm
của các nhà khoa học đa ngành cũng như cộng đồng bởi ưu điểm của chúng là
độc tính thấp, ít tác dụng phụ, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so
với các dược phẩm tổng hợp.
Họ dâu tằm (Moracae) là một họ lớn chứa từ 40-60 chi và khoảng
1000-1500 loài thực vật phân bố rộng rãi ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới
nhưng ít phổ biến ở các vùng ôn đới. Ở Việt Nam, họ Moraceae hiện biết có

khoảng trên 10 chi với gần 140 loài được phân bố rộng rãi khắp nước, bao
gồm cả cây trồng và cây mọc dại, nhiều loài có giá trị kinh tế cao.
Cây dâu tằm ( Morus alba), thuộc họ dâu tằm ( Moracae) là cây được
sử dụng để chữa bệnh từ rất lâu, lá dâu dùng để chữa cảm mạo, hạ huyết
áp,làm lành vết thương; vỏ và rễ dâu chữa chứng ho lâu ngày, sốt cao, băng
huyết; cành dâu non có tác dụng trừ phong, lợi các khớp, thông kinh lạc, tiêu
viêm……

Nguyễn Thị Mai Hương

1

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi đã chọn đề tài cho khóa luận
tốt nghiệp là:
“Nghiên cứu phân lập các flavonoit từ lá dâu tằm (Morus alba)’’
Nhiệm vụ của đề tài là:
1. Thu mẫu từ lá cây dâu tằm (Morus alba), xử lý mẫu, tạo dịch chiết;
2. Phân lập các hợp chất flavonoit thu được từ dịch chiết lá cây dâu tằm
(Morus alba).
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.

Nguyễn Thị Mai Hương

2

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây dâu tằm (Morus alba)
1.1.1. Mô tả
Tên khác: Tang, Dâu cang, Dâu ta.
Tên khoa học: Morus alba.
Họ: Dâu tằm (Moracae ).
Chi: Morus.
Tên nước ngoài: White mulberry (Anh ).
Dâu tằm là loại cây gỗ nhỏ, cao khoảng 2-3m.Thông thường cây dâu
sống từ 8-12 năm, nếu đất tốt và chăm sóc tốt thì tuổi thọ tới 50 năm và có thể
cao tới 15-20m. Thân cành nhiều nhựa, không gai, trên thân cành có nhiều
mầm, mầm đỉnh, mầm nách. Lá mọc so le, nguyên hoặc chia 3 thùy. Trên các
cây già, lá dài 8-15cm, có hình tim ở gốc lá,
nhọn ở chóp lá và có các khứa răng cưa ở mép
lá từ cuống lá tỏa ra 3 gân rõ rệt. Hoa đơn
tính, hoa đực mọc thành bông, có 4 lá đài, có
4 nhị. Hoa cái cũng mọc thành bông hoặc
hình khối cầu, có 4 lá đài. Quả bé bao bọc các
đài, mọng nước thành 1 quả phức. Quả có
màu từ trắng đến hồng đối với cây nuôi trồng
, nhưng màu quả tự nhiên của loài này khi

mọc hoang là màu tím sẫm. Rễ ăn sâu và rộng
2-3m. Phân bố nhiều ở tầng đất 10-30m và
rộng theo tán cây.

Hình 1.1: Lá cây dâu.

Nguyễn Thị Mai Hương

3

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.1.2. Phân bố và sinh thái
Nguyên sản ở Trung Quốc, được trồng rộng rãi ở các nước Châu Á.
Ở Việt Nam, đã được trồng từ lâu đời khi người ta biết nuôi tằm. Cây
được trồng nhiều ở các tỉnh Thái Bình, Bắc Giang, Bắc Ninh.
Cây dâu ưa đất phù sa, bãi bồi, đất ẩm xốp và khí trời ấm áp.
1.1.3. Công dụng
Lá dâu (Tang diệp) có vị đắng, tính bình, có tác dụng tán phong, thanh
nhiệt, lương huyết chữa cảm mạo,hạ huyết áp, làm sáng mắt, chữa chứng mồ
hôi trộm ở trẻ con, chứng thổ huyết, làm lành vết thương.
Vỏ rễ dâu (Tang bạch bì) đã cạo sạch lớp vỏ ngoài, phơi hay sấy khô,
có vị ngọt hơi đắng, tính mát,có tác dụng thanh phế nhiệt, lợi thủy, hạ suyễn,
tiêu sưng, chứng ho lâu ngày, sốt cao, băng huyết.
Cành dâu non (Tang chi) đã phơi hay sấy khô có vị đắng nhạt, tính

bình, có tác dụng trừ phong, lợi các khớp, thông kinh lạc, tiêu viêm, hạ nhiệt,
giảm đau.
Quả dâu (Tang thầm) có vị ngọt, chua, tính mát, có tác dụng bổ gan, trị
tiểu đường, lao hạch.
1.1.4. Thành phần hóa học [13]
Lá cây dâu tằm chứa các thành phần bay hơi như tinh dầu (0,0035%),
các thành phần không bay hơi gồm protein, carbohydrat, flavonoid, coumarin,
vitamin…

Các

flavonoid:

rutin,

quercetin,

moracetin

(quercetin-3-

triglucosid), quercitrin (quercetin 3- rhamnosid), isoquercitrin (quercetin-3glucosid). Các dẫn chất coumarin: umbeliferon, scopoletin, scopolin. Các
vitamin B, C, D, caroten. Các sterol: β-sitosterol, campesterol, β-sitosterol
glycosid, β- ecdyson và inokosterol. Các acid hữu cơ: oxalic, malic, tartric,
citric, fumaric, palmitic và ester ethyl palmitat.

Nguyễn Thị Mai Hương

4

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Vỏ rễ cây dâu tằm chứa mulberin, cyclomulberin, mulberochomen,,
cyclomulberochromen, mulberanol, oxydihydromorusin (morusinol), kuwanon,
mulberofuran, albanol, albafuran, albafuran B, C. Ngoài ra, vỏ rễ còn chứa ptocopherol, umberiferon, socopoletin, ethyl 2,4 - dihydrobenzoat, 5,7dihydroxychoromon, morin (3,5,7,2’,4’- pentahydroxyfalavon) dihydromorin,
dihydrokaemferol, acid betulenic, 2,4,4’,6-tetrahydroxybenzophenol (R=H),
macrulin (2,3’,4,4’,6-pentahydroxybenzophenol (R=OH), sitosterol, resinotanol.
1.1.5. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây dâu tằm (Morus alba).
Các nghiên cứu gần đây cho thấy một số hợp chất phân lập từ rễ cây
dâu tằm có nhiều hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất flavonoid.
Năm 1986, Hirakura đã cô lập được hợp chất Mulberrosid từ rễ cây dâu
tằm và đã thử nghiệm thành công hoạt tính kháng virus Herpes simplex-l
(HSV-l: một loại virus gây viêm não)[10].
Các công trình nghiên cứu của một số tác giả Nhật Bản (1994) [11],
Trung Quốc (1996)[12] đã chứng minh polyphenol chứa trong lá dâu có nhiều
tác dụng quý và có thể ứng dụng trong sinh học như: làm hạ glucose máu,
chống oxy hóa, hạn chế rối loạn lipit máu.
Năm 2003, K.M.Park và các cộng sự đã phân lập được hợp chất
Kuwanon G từ rễ cây dâu tằm, các nghiên cứu cũng cho thấy hợp chấy này có
thể kháng lại vi khuẩn Streptococcus (vi khuẩn gây ra nhiễm trùng) và các
loại vi khuẩn Cariogenic như S. mutans (loại khuẩn này chuyên bám trên bề
mặt răng và tạo cao răng)……
Khi dùng cloroform để chiết các hợp chất hữu cơ từ rễ cây dâu tằm, các
nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện dung dịch thu được có tác dụng bổ trợ
cho trực khuẩn Bacillus subtilis phát triển mạnh, trực khuẩn này sinh nhiều

loại kháng sinh, vitamin và đặc biệt là các loại men tiêu hóa như: proteaza,
amylaza… có tác dụng ngừa tiêu chảy hiệu. Ngoài ra, nếu dùng acid acetic để

Nguyễn Thị Mai Hương

5

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

chiết có thể kháng được vi khuẩn Staphylococcus aureus (một nhóm vi khuẩn
sống trên da tay, chân của con người. Hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm cấp
tính do Staphylococcus aureus gây ra) và Escherichia colia (vi khuẩn này là
nguyên nhân gây tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiết niệu như viêm thận,
nhiễm trùng huyết,…)[12].
Năm 2013,TS.BS.Nguyễn Quang Trung là người đầu tiên ở Việt Nam
công bố nghiên cứu tác dụng của bột chiết lá dâu tằm dùng để điều trị giảm
đường huyết và điều hòa rối loạn lipid ở bệnh nhân đái tháo đường, giúp kéo
dài thời gian ổn định đường huyết.
Các nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy cây dâu tằm có hoạt tính
kháng virus rất mạnh nhưng cho đến nay vẫn chưa có nhiều hợp chất được
phát hiện và phân lập. Vì vậy mà cây dâu tằm vẫn đang là đối tượng quan tâm
của các nhà khoa học để tiếp tục tìm ra các hợp chất mới có khả năng trị bệnh
phục vụ cho cuộc sống con người.
1.2. Giới thiệu về lớp chất flavonoit.
1.2.1. Giới thiệu chung .[2, 3, 5, 6, 7].

Các flavonoit là lớp chất phổ biến có trong thực vật, có cấu tạo gồm 2
vòng benzen A, B được nối với nhau bởi một dị vòng C với bộ khung cacbon
C6 – C3 – C6.
Flavonoit xuất hiện cách đây 280 triệu năm ở hai loại tảo, vòng.
Sự tiến hoá của Flavonoid liên quan đến quá trình tiến hoá thực vật. Từ
các loài có gỗ sơ khai đến các loài cây bụi đã phát triển dẫn đến 3 sự thay đổi
quan trọng về mặt cấu trúc của Flavonoid:
- Sự biến mất Proantoxianidin trong lá.
- Sự mất 3 nhóm OH ở vòng benzen.
- Sự thay thế Flavonol (Quercetin) bởi Flavon (Luteonin).

Nguyễn Thị Mai Hương

6

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Việc phân loại các flavonoit dựa trên sự khác nhau của nhóm C3 (các
glicosit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà; antoxianin và antoxianiđrin màu
đỏ, xanh, tía và các dạng không màu; isoflavon, catecin và leucoantoxianiđrin
là các chất tan trong nước và thường nằm trong không bào).
Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol, đa dạng về cấu trúc hoá học
và tác dụng sinh học. Chúng có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt
trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B
được kết nối bởi 1 dị vòng C với khung các bon C6-C3-C6. Tại các vòng có đính

một hay nhiều nhóm hydroxy tự do hay đã thay thế một phần. Vì vậy về bản chất
chúng là các poliphenol có tính axit. Các poliphenol có thể phản ứng lẫn nhau
qua các nhóm hydroxy để tạo thành các phân tử phức tạp hơn hay có thể liên kết
với các hợp chất khác trong cây như các Oza (dạng glycozit) hay protein.
Các flavonoit là các dẫn xuất của 2–phenyl chromen (flavan).
2'

A

1'

8
9

7

O

B

3'
4'

2
5'
3

6

10

5

4

6'

C

Hình 1.2: Flavan (2- phenyl chromen )
1.2.2. Các nhóm flavonoit
1.2.2.1 Flavon và flavonol
Nhóm flavon và flavonol chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3. Công thức
cấu tạo của các hợp chất như sau:

Nguyễn Thị Mai Hương

7

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

O

O
OH

RO

OH

RO

OH
O

O

Hình 1.3: Flavon

Hình 1.4: Flavonol

(2-phenyl benzopyron,

(3-hidroxi flavon)

2-phenyl cromon)
Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lượng các
nhóm hydroxi liên kết với các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất
khác nhau.
Trong thực vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng
tự do mà thường dưới dạng glycozit.
1.2.2.2. Flavanon (dihydroflavon).
Các flavanon có công thức cấu tạo chung như sau:
OR

O

RO

O

Hình 1.5: Flavanon
Các flavanon tồn tại ở dạng cân bằng hỗ biến với các chalcon, do vòng
dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành chalcon.
OR
O

OH

OR

[OH]

RO

[H]

O

O

Hình 1.6: Flavonon và Chalcon

Nguyễn Thị Mai Hương

8

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.2.2.3. Flavanonol-3.
Các flavanonol-3 còn gọi là flavanon-3-ol hay dihydroflavonol,
flavanonol có cấu trúc giống như flavanon chỉ khác nhóm thế hydroxi ở vị trí
cacbon số 3 (C3).
OR
O
RO
OH
O

Hình 1.7: Flavanonol-3
Người ta đã biết đến khoảng 30 hợp chất thuộc nhóm này, phần lớn
chúng ở dạng aglycon, chỉ có vài chất ở dạng glycozit. Flavanonol-3 có hai
nguyên tử cacbon bất đối là C2 và C3 nên chúng có tính quang hoạt. Các hợp
chất flavanonol-3 thường gặp là aromadendrin, fustin và taxifolin
OH
O
HO

OH
OH
OH

O
Taxifolin

Hình 1.8: Taxifolin
1.2.2.4. Chalcon.
Chalcon khác với các loại Flavonoid khác là nhóm chalcon gồm hai
vòng benzen A và B được nối với nhau bởi một mạch hở có 3 nguyên tử
cacbon, số thứ tự các nguyên tố được bắt đầu đánh từ vòng B.

Nguyễn Thị Mai Hương

9

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

OR
OH
RO

O

Hình 1.9: Chalcon
Hiện nay người ta biết đến khoảng 20 hợp chất chalcon, ngoài ra còn
thấy hợp chất dihydrochalcon. Tuy vậy, giữa chalcon và dihydrochalcon hầu
như không có mối quan hệ khăng khít nào. Chalcon có thể bị đồng phân hoá

thành flavanon khi đun nóng với axit clohydric (HCl).
1.2.2.5. Auron.
Auron là hợp chất có vòng C là một dị vòng 5 cạnh. Công thức cấu tạo
chung của nhóm auron như sau:
O
RO

A

OR

C

CH

B

O

Hình 1.10: Auron
Auron có màu vàng đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng
Shinoda (phản ứng định tính flavonoid). Trong tự nhiên, các chalcon-glycozit
dễ bị oxy hóa thành auron-glycozit nên hai nhóm chất này tồn tại cạnh nhau.
Các auron-glycozit hay xuất hiện trong họ Cúc.
1.2.2.6. Antoxianidin.
Antoxianidin thường gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan trong
nước. Công thức chung như sau:

Nguyễn Thị Mai Hương

10

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

OR

O
RO

OH

Hình 1.11: Antoxianidin
Màu sắc của antoxianidin thay đổi theo pH. Trong dung dịch axit vô
cơ, antoxianidin cho muối oxoni có màu đỏ, còn trong môi trường kiềm
chúng tạo thành các anhydrobazơ với một nhóm quinoid màu xanh:
HO

OH HO

O

O

O

OH
OH

H

OH

OH

O

O

H
OH
D¹ng ph©n tö trung tÝnh (tÝm)

D¹ng oxoni (®á)

O

OH
D¹ng anion (xanh )

Hình 1.12: Các dạng chuyển hoá của antoxianidin
1.2.2.7. Leucoantoxianidin (flavan – 3,4 – điol)
Leucoantoxianidin còn gọi là flavan-3,4- diol. Các hợp chất này mới
chỉ tìm thấy ở dạng aglycon, chưa tìm thấy ở dạng glycozit.
O

OH
O

Hình 1.13: Leucoantoxianidin
1.2.2.8. Catechin.
Catechin là các dẫn xuất flavan-3-ol. Do có hai trung tâm cacbon bất
đối nên chúng tồn tại dưới dạng hai cặp đồng phân đối quang.

Nguyễn Thị Mai Hương

11

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

OH

O
HO

OH

OH
OH

Hình 1.14: (–) Catechin

OH

O
HO

OH

OH
OH

Hình 1.15: (+) Catechin
1.2.2.9. Isoflavonoid.
Isoflavonoid bao gồm các dẫn xuất của 3- phenyl chroman, được chia
thành các nhóm nhỏ như sau:
O

O
3- phenyl chroman

Hình 1.16: 3-phenyl chroman
O
RO

O
OR

O

O

Iso flavon

Iso flavanon

Hình 1.17: Isoflavon
Nguyễn Thị Mai Hương

Hình 1.18: Isoflavanon
12

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.2.2.10. Rotenoid và neoflavonoid.
Các rotenoid có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc
cũng như sinh tổng hợp. Khung cacbon được mở rộng thêm một nguyên tử
cacbon nên có thể tạo thêm một vòng pyran thứ hai. Công thức như sau:

H
O

O
O

H
O

OMe
MeO

Hình 1.19: Rotenoid
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật.
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.1. Chọn dung môi chiết
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Độ hòa tan của các flavonoid phụ thuộc vào vị trí và số lượng nhóm
- OH và các nhóm thế khác của chúng. Do số lượng và vị trí nhóm –OH giữa
các flavonoid khác nhau nên không thể ấn định một phương pháp chiết chung
cho tất cả flavonoid. Tuy nhiên cũng có thể có một số nguyên tắc sau:

Nguyễn Thị Mai Hương

13

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

- Flavonoid glycozit là các flavon và các flavonol có nhiều nhóm –OH,
các biflavon là các chất phân cực mạnh thì người ta dung các dung môi phân
cực như CH3OH, C2H5OH.
- Aglycon, các flavon, flavonol có nhiều nhóm metoxy, ít nhóm –OH là
những chất có độ phân cực yếu. Để chiết chúng, người ta dùng các dung môi
phân cực yếu như C6H6, CHCl3, CH3COOC2H5.
Dung môi nếu lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và
chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này cần được chưng
cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Có một số chất dẻo thường lẫn
trong dung môi như: diankyl phtalat, tri-n-butyl photsphat và tri-n-butyl
axetylcitrar. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất
hoặc trong khâu bảo quản như trong các nút đậy bằng nhựa hoặc trong các
thùng chứa.
Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)
phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom, metyl
clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: Rễ, thân, lá, hoa, củ, quả…
Những tạp chất của chlorofom như CH2ClBr, CH2Cl2 có thể phản ứng
với vài hợp chất như các ancaloid tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác.
Tương tự như vậy, sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có
thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất
khác. Chlorofom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với
chất này cần thao tác cẩn thận và khéo léo ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt
nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofom.

Nguyễn Thị Mai Hương

14

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hidrocacbon thế clo. Các dung môi thuộc nhóm rượu được cho rằng sẽ thấm
tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được
lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm được tạo thành khi dùng methanol
trong suốt quá trình chiết [4]. Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechonaetes
aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ 1hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết
trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, dễ bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành
peroxit dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp
chất không có khả năng tạo cholesterol như các calotenoid. Tiếp đến là axeton
cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.
Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình

phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazơ có thể
tạo thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp
trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp

Nguyễn Thị Mai Hương

15

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ của chất bởi dung môi và quá trình
tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không
quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.3.2. Qúa trình chiết.
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy
để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung
môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước

đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể
dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:
Đragendroff và tác nhân Mayer.

Nguyễn Thị Mai Hương

16

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

- Các flavoloit thường là những hợp chất màu, vì vậy khi dịch chiết
chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và
sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde
có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với

anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ.[7, 8]
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí.
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất
hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha động.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan...). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác
nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc
theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá
trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh
sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu
hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá
trình sắc ký.

Nguyễn Thị Mai Hương

17

K35C – Khoa Hóa học

Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí.
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
hai pha tĩnh và pha động. ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự
phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch
(hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử
đẳng nhiệt Langmuir:

n

n .b.C
1  b.C

n - lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n∞ - lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b - hằng số.
C - nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí.
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng
thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm
lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra
thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.4.3.1. Sắc ký cột (C.C).
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm
các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,
ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh

hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết
sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp
phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng
tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt
càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng

Nguyễn Thị Mai Hương

18

K35C – Khoa Hóa học


Khóa luận tốt nghiệp

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy
được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp
suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu
cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là
Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này
mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp
phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ
này thấp (từ 1/5 – 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ
số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong
khoảng 1/20-1/30.

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là
tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh,
thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột
với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất
hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột
đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung
môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến
khi đủ lượng cần thiết.

Nguyễn Thị Mai Hương

19

K35C – Khoa Hóa học