Nghiên cứu thành phần flavonoit từ cây kim tiền thảo desmodium stryracifolium

Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Hoạt chất sinh
học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Tiến Đạt – Phòng Hoạt chất
sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, người đã trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng cùng các thầy
giáo trong khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện
giúp đỡ và cung cấp cho em những kiến thức cơ bản nhất để em hoàn thành
khóa luận của mình.
Em xin cảm ơn các anh, chị cán bộ Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ và chỉ bảo tận
tình để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Khoá luận tốt nghiệp không tránh khỏi một số thiếu sót vì vậy em rất
mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của các thầy cô và các bạn sinh viên quan
tâm.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên

ĐINH THỊ NHẠN

K35C – Khoa Hóa học

i

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
[]D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

C NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
1

H NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-1H COSY

2D-NMR

1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional
NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectrometry

FAB-MS

Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High
Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry
IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

K35C – Khoa Hóa học

ii

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Desmodium stryracifolium .... 3
1.1.1. Mô tả................................................................................................. 3
1.1.2. Phân bố, sinh thái. ............................................................................ 4
1.1.3. Thành phần hóa học. ........................................................................ 4
1.1.4. Công dụng. ....................................................................................... 4
1.2. Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có trong cây Kim tiền thảo. .... 5
1.2.1. Giới thiệu chung. .............................................................................. 5
1.2.2. Các nhóm flavonoit. ......................................................................... 6
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật. .................................................. 12
1.3.1. Đặc điểm chung. ............................................................................. 12
1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết. ............................................................... 13
1.3.3. Quá trình chiết thực vật. ................................................................. 13
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ ............. 18
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký. ..................................... 18
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký....................................................... 18
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký. ................................................ 19
1.5. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. .... 22
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR). ................................. 23
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy). .......................................................................................... 25
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 28
2.1. Mẫu thực vật. ........................................................................................ 28
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất. .................................................... 28
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................ 28
K35C – Khoa Hóa học

iii

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế .............................................................. 29
2.2.3. Sắc ký cột (CC) .............................................................................. 29
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. ......................... 29
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) .................................................................... 29
2.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) .............................................................. 29
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .............................................. 29
2.3.4. Độ quay cực []D ........................................................................... 29
2.4. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 30
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết ......................................................... 30
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc ............................................. 30
2.5. Hoá chất. ............................................................................................... 30
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ......................................... 31
3.1. Chiết và phân lập các hợp chất ............................................................. 31
3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất ............................ 31

3.2.1. Hợp chất 1 ...................................................................................... 31
3.2.2. Hợp chất 2 ...................................................................................... 32
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ...................................................... 34
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1. ........................................... 34
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2. ........................................... 39
4.3 Kết quả đánh giá hoạt tính quét gốc tự do DPPH.................................. 42
KẾT LUẬN .................................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44

K35C – Khoa Hóa học

iv

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU
Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo ............................................................................. 3
Hình1.2: Flavan (2-phenyl chromen)………………………………………....6
Hình 1.3: Flavon (2-phenyl benzopyron, 2-phenyl cromon) ............................ 6
Hình 1.4: Flavonol (3-hidroxi flavon)............................................................... 7
Hình 1.5: Flavanon ............................................................................................ 7
Hình 1.6: Flavanon và Chalcon......................................................................... 8
Hình 1.7: Flavanonol-3 ..................................................................................... 8
Hình 1.8: Chalcon ............................................................................................ 9
Hình 1.9: Auron................................................................................................. 9

Hình 1.10: Antoxianidin.................................................................................... 9
Hình 1.11: Các dạng chuyển hoá của antoxianidin........................................ 10
Hình 1.12: Leucoantoxianidin......................................................................... 10
Hình 1.13: (+) Catechin................................................................................... 11
Hình 1.14: (–) Catechin ................................................................................... 11
Hình 1.15: 3-phenyl chromen ......................................................................... 11
Hình 1.16: 3-phenylchromen-4-one ................................................................ 12
Hình 1.17: Rotenoit ......................................................................................... 12
Hình 2.1. Ảnh chụp tiêu bản mẫu Kim tiền thảo ............................................ 28
Hình 4.1.1. Phổ ESI-MS của hợp chất 1 ......................................................... 34
Hình 4.1.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 ....................................................... 35
Hình 4.1.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 ...................................................... 36
Hình 4.1.4. Phổ DEPT của hợp chất 1 ............................................................ 36
Hình 4.1.5. Cấu trúc hóa học của 1 ................................................................. 37
Hình 4.2.1. Phổ ESI-MS của hợp chất 2 ......................................................... 39
Hình 4.2.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 ....................................................... 40
Hình 4.2.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 ...................................................... 40
Hình 4.2.4. Phổ DEPT của hợp chất 2 ............................................................ 41
Hình 4.2.5. Cấu trúc hóa học của 2 ................................................................. 41
Hình 4.3: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của 1 ..................................................... 42
K35C – Khoa Hóa học

v

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

MỞ ĐẦU
Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao. Với
điều kiện tự nhiên thuận lợi như vậy nên hệ thực vật Việt Nam đã phát triển
rất phong phú và đa dạng. Khoảng 12000 loài thực vật không kể đến các loài
tảo, rêu và nấm, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta làm thảo dược
cùng với các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người. Điều này thực sự
có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của các ngành như ngành y
học, ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên và các ngành khác.
Việc sử dụng cây cỏ làm thuốc đã luôn gắn liền với lịch sử tồn tại và
phát triển của xã hội loài người. Từ xa xưa, cha ông ta đã biết dùng thực vật
vừa để tự nuôi sống mình, vừa để chữa bệnh và chăm sóc sức khoẻ cho bản
thân. Thiên nhiên đem lại cho chúng ta nguồn nguyên liệu phong phú cung
cấp các hoạt chất quý hiếm để tạo ra các biệt dược và các chất dẫn đường để
tổng hợp ra nhiều loại thuốc mới. Việc sử dụng hợp chất thiên nhiên và sản
phẩm có nguồn gốc thiên nhiên dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút
được sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như cộng đồng bởi ưu điểm của
chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hoá trong cơ thể cũng như có
khả năng trị bệnh rất cao.
Nhiều công ty dược phẩm trong và ngoài nước đã và đang tập trung
hướng nghiên cứu và kinh doanh vào các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ
thiên nhiên. Việc nghiên cứu tập trung đã thúc đẩy các hướng nghiên cứu tìm
kiếm dược liệu từ thiên nhiên, qua nghiên cứu các nhà khoa học đã tìm ra
nhiều loài thực vật có ứng dụng cao trong y dược như thanh hao hoa vàng Artemisia annua, nhân sâm - Panax ginseng, đan sâm - Salvia miltiorrhiza…
Những kết quả nghiên cứu này đã giúp cho việc cung cấp các hoạt chất quý
cho nghiên cứu tạo các sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng .
K35C – Khoa Hóa học

1

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Trong số những loài thực vật của Việt Nam, loài thực vật thuộc họ đậu
(Fabaceae) hiện đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới
và Việt Nam. Kim tiền thảo là một trong số những loại cây thuộc họ đậu có tác
dụng dược lý tốt, có tác dụng thanh nhiệt, lợi thuỷ, tiêu sạn, giải độc, tiêu
viêm; lợi thuỷ, thông lâm, tiêu tích tụ. Chủ trị các chứng nhiệt lâm, thạch lâm,
sỏi mật, hoàng đản, ung nhọt do nhiệt độ, trị gan mật kết sỏi, sỏi thận, tiểu
buốt, hoàng đản. Tuy nhiên cho tới nay chưa có một nghiên cứu chính thức
nào về hóa thực vật của cây.
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi đã chọn đề tài cho khoá luận
tốt nghiệp là:
“ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ cây Kim tiền thảo
(Desmodium stryracifolium)””.
Nhiệm vụ của đề tài là:
1. Thu mẫu lá cây Kim tiền thảo (Desmodium stryracifolium), xử lý
mẫu, tạo dịch chiết.
2. Phân lập các hợp chất flavonoit.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lâp được.

K35C – Khoa Hóa học

2

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Desmodium stryracifolium
1.1.1. Mô tả. [1,2]
Tên

khoa

học:

Desmodium

styracifolium (Osb.)Merr
Tên tiếng Việt: Cây kim tiền thảo
còn gọi là đồng tiền lông, kim tiền,
mắt trâu, vẩy rồng.
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)

Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo

Phân lớp: Hoa hồng (Fabaceae)
Họ: Đậu (Fabaceae)
Phân họ: Đậu (Faboideae)
Chi: Desmodium

Kim tiền thảo cao khoảng 40-80 cm. Thân cỏ mọc bò hình trụ màu
xanh hơi vàng có phủ đầy lông mịn màu vàng hoe. Lá mọc so le đơn hay kép
lông chim lẻ gồm 1-3 lá chét hình tròn có lông, lá chét ở giữa to hơn lá chét 2
bên, mặt trên lá màu lục lơ và nhẵn, mặt dưới có lông trắng bạc và mềm.
Cuống lá hình trụ phủ đầy lông trắng. Cụm hoa chụm hay chùy ở nách hay ở
ngọn có lông mềm màu hung hung. Hoa tự hình chùm, tràng hoa hình bướm,
màu tía xếp 2-3 cái một. Quả loại đậu dài khoảng 14-16 mm xụ xuống mang
đài tồn tại ở góc dẹp nhiều lông trắng mịn, mỗi quả chứa 4-5 hạt.

K35C – Khoa Hóa học

3

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

1.1.2. Phân bố, sinh thái.
Phổ biến ở Sri Lanka, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc, Lào,
Việt Nam, Campuchia... Ở nước ta có từ Lào Cai, Phú Thọ, Hòa Bình, Hà
Nội, Hải Hưng, Quảng Ninh, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa ThiênHuế vào Kontum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu,
thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dương, Tây Ninh, Cần Thơ. Thường Gặp trong
các bãi cỏ và các ruộng bỏ hoang trên đất có cát nha, ở vùng thấp và vùng
trung du, một số ít mọc ở vùng núi. Mùa hoa tháng 6-9, mùa quả tháng 9-10.
Tính vị và tác dụng: Theo dược học cổ truyền, Kim tiền thảo vị ngọt,
tính bình, có công dụng thanh nhiệt, lợi thấp, lợi niệu thông lâm, tiêu thũng
bài thạch, thường được dùng để chữa các chứng bệnh như viêm đường tiết

niệu, sỏi tiết niệu, sỏi mật, phù thũng do viêm thận, hoàng đản (vàng da), tích
tụ, ung thũng,...
1.1.3. Thành phần hóa học. [3, 4].
Toàn cây có mùi mạnh của coumarin. Trong cây kim tiền thảo có chứa
polysaccharid, saponin triterpenic và các flavonoid như isovitexin,
isoorientin, vicenin glycosid,... và các chất khác như desmodimin,
desmodilacton, lupenon, lupcol, tritriacontan, acid stearic,...
1.1.4. Công dụng.
Theo đông y, Kim tiền thảo có tác dụng dược lý tốt, thường dung để
chữa sỏi liệu đạo, sỏi bang quang, sỏi túi mật, chữa nhiễm khuẩn đường
niệu,viêm thận phù thũng, viêm gan vàng da [1,2]. Thanh nhiệt, tán thấp,
thông lâm. Nước sắc kim tiền thảo có tác dụng làm tăng tuần hoàn mạch, hạ
áp lực động mạch, làm chậm nhịp tim, giảm lượng oxi ở tim. Tuần hoàn của
thận và não tăng cơ tim co lại, do đó có thể nghĩ đến việc kim tiền thảo có tác
dụng chữa được cao huyết áp. Ngoài ra nó còn có tác dụng điều hào miễn

K35C – Khoa Hóa học

4

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

dịch, giãn cơ trơn, nước sắc kim tiền thảo được dùng để điều trị các bệnh như
hen suyễn, sốt thương hàn, sốt rét, bệnh suy dinh dương ở trẻ em [3,4].
Ngoài ra trong cây còn chứa các hợp chất flavonoid, alkaloid, steroid,

triterpenoid, sapomin… đồng thời còn mang nhiều hoạt tính sinh học đáng
quan tâm như chống viêm, gây độc tế bào, kháng khuẩn, diệt vi - rút, chống
oxi hóa [3,4,5,6,7].
1.2. Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có trong cây Kim tiền thảo.
1.2.1. Giới thiệu chung. [8, 9, 10, 11, 12]
Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng rãi nhất
trong tự nhiên. Cho đến nay có hơn 4000 Flavonoid được tìm thấy từ thực vật.
Sự tiến hoá của Flavonoid liên quan đến quá trình tiến hoá thực vật. Từ các
loài có gỗ sơ khai đến các loài cây bụi đã phát triển dẫn đến 3 sự thay đổi
quan trọng về mặt cấu trúc của Flavonoid:
- Sự biến mất Proantoxianidin trong lá.

- Sự mất 3 nhóm OH ở vòng benzen.
- Sự thay thế Flavonol (Quercetin) bởi Flavon (Luteonin).
Flavonoid đặc trưng cho các loài sinh vật bậc cao song song với sự
phân bố axit Xiamic và Lignin trong cây. Flavonoid có mặt trong hầu hết các
bộ phận của cây như lá, hoa, quả, phấn, rễ… và cư trú ở thành tế bào. Nó
tham gia vào sự tạo thành màu sắc của cây đặc biệt là hoa.
Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol đa dạng về cấu trúc hoá học
và tác dụng sinh học. Chúng có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt
trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B
được nối bởi 1 dị vòng C với khung các bon C6-C3-C6.
Tại các vòng có đính một hay nhiều nhóm hydroxy tự do hay đã thay thế
một phần. Vì vậy về bản chất chúng là các poliphenol có tính axit. Các
poliphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxy để tạo thành các
K35C – Khoa Hóa học

5

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

phân tử phức tạp hơn hay có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các
Oza (dạng glicozit) hay protein.
Dựa trên sự khác nhau của nhóm C3 mà người ta phân loại các
flavonoit (các glicosit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà; antoxianin và
antoxianiđrin màu đỏ, xanh, tía và các dạng không màu; isoflavon, catecin và
leucoantoxianiđrin là các chất tan trong nước và thường nằm trong không
bào).
Các flavonoit là các dẫn xuất của 2–phenyl chromen (flavan).

Hình1.2: Flavan (2-phenyl chromen)

1.2.2. Các nhóm flavonoit. [9, 10, 11, 12, 13]
1.2.2.1. Flavon và flavonol: Trong công thức cấu tạo của Flavon và flavonol
chúng chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3.

Hình 1.3: Flavon (2-phenyl benzopyron, 2-phenyl cromon)

K35C – Khoa Hóa học

6

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Hình 1.4: Flavonol (3-hidroxi flavon)
Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lượng các
nhóm hydroxi liên kết với các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất
khác nhau.
Trong thực vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng
tự do mà thường dưới dạng glycozit.
1.2.2.2. Flavanon(dihydroflavon) :
Công thức cấu tạo chung của các flavanon:

Hình 1.5: Flavanon
Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến với các chalcon do vòng
dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành chalcon.

K35C – Khoa Hóa học

7

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Hình 1.6: Flavanon và Chalcon
1.2.2.3. Flavanonol-3: Các flavanonol-3 còn gọi là flavanon-3-ol hay

dihydroflavonol, flavanonol có cấu trúc giống như flavanon chỉ khác nhóm
thế hydroxi ở vị trí cacbon số 3 (C-3). Chúng có 2 nguyên tử cacbon bất đối là
C-2 và C-3 nên chúng có tính quang hoạt. Các hợp chất flavanonol-3 thường
gặp là aromadendrin, fustin và taxifolin.

Hình 1.7: Flavanonol-3
1.2.2.4. Chalcon: Chalcon khác với các loại Flavonoid khác là nhóm chalcon
có phân tử gồm hai vòng benzen A và B được nối với nhau bởi một mạch hở
có 3 nguyên tử cacbon, số thứ tự các nguyên tố được bắt đầu đánh từ vòng B.
Chalcon có thể bị đồng phân hoá thành flavanon khi đun nóng với axit
clohydric (HCl).

K35C – Khoa Hóa học

8

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Hình 1.8: Chalcon
1.2.2.5. Auron: Auron có màu vàng đậm và không tạo màu khi thực hiện
phản ứng Shinoda (phản ứng định tính flavonoid). Auron là hợp chất có vòng
C là một dị vòng 5 cạnh, có công thức cấu tạo chung như sau:

Hình 1.9: Auron
1.2.2.6. Antoxianidin: Thường gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan

trong nước.

Hình 1.10: Antoxianidin

K35C – Khoa Hóa học

9

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Màu sắc của antoxianidin thay đổi theo pH. Trong môi trường kiềm
antoxianidin tạo thành các anhydrobazơ với một nhóm quinoid màu xanh.
Trong dung dịch axit vô cơ chúng cho muối oxoni có màu đỏ.

HO

OH HO

O

O

O

OH

OH

OH
D¹ng oxoni (®á)

H

OH

O

O

O

H
OH
D¹ng ph©n tö trung tÝnh (tÝm)

OH
D¹ng anion (xanh )

Hình 1.11: Các dạng chuyển hoá của antoxianidin
1.2.2.7. Leucoantoxianidin: Leucoantoxianidin là các dẫn xuất flavan-3,4diol. Các hợp chất này mới chỉ tìm thấy ở dạng agycon, chưa tìm thấy ở dạng
glycozit.

Hình 1.12: Leucoantoxianidin
1.2.2.8. Catechin:.Catechin là các dẫn xuất flavan-3-ol. Do có 2 trung tâm
cacbon bất đối nên chúng tồn tại dưới dạng 2 cặp đồng phân đối quang. Ví dụ
như các cặp catechin và epicatechin.Trong đó chỉ có (+)- catechin và (-)epicatechin xuất hiện trong thiên nhiên

K35C – Khoa Hóa học

10

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Hình 1.13: (+) Catechin

Hình 1.14: (–) Catechin
1.2.2.9. Isoflavonoit: Isoflavonoid bao gồm các dẫn xuất của 3- phenyl
chromen.

Hình 1.15: 3-phenyl chromen

K35C – Khoa Hóa học

11

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Hình 1.16: 3-phenylchromen-4-one
1.2.2.10. Rotenoit và neoflavonoit: Các rotenoit có quan hệ chặt chẽ với các
isoflavon về mặt cấu trúc cũng như sinh tổng hợp. Khung cacbon được mở
rộng thêm một nguyên tử cacbon nên có thể tạo thêm một vòng pyran thứ hai.

Hình 1.17: Rotenoit
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật.
1.3.1. Đặc điểm chung.
Khái niệm: Chiết là chuyển chất giữa hai pha lỏng không trộn lẫn. Chất
đang hòa tan hoặc huyền phù ở pha này được chuyển vào pha kia.
Mục đích: Dùng để chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một
lượng lớn thể tích dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm
K35C – Khoa Hóa học

12

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

nâng cao nồng độ của chất nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu. Ngoài ra
còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất ra khỏi một
hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Phương pháp này thường được
dùng để phân tách các hợp chất tự nhiên có trong thực vật.
1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết.
Cơ sở của quá trình chiết là dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất

trong hai chất lỏng không tan lẫn với nhau. Theo Nernst, giả định các nồng độ
là thấp (lý tưởng) thì ở mỗi nhiệt độ:

KA = CA/CB
Trong đó: KA: hằng số phân bố.
CA, CB: nồng độ chất ở các pha A, B
1.3.3. Quá trình chiết thực vật.
1.3.3.1. Hợp chất tự nhiên trong cây.
Dựa vào chức năng sinh học, người ta chia các hợp chất trong cây
thành hai nhóm lớn:
- Chất chuyển hóa sơ cấp (primary metabolite) là chất tham gia vào quá
trình sinh trưởng của cây như hydrat cacbon, lipit, axit amin. Nói chung là
chúng không thể thiếu trong cây cỏ.
- Chất chuyển hóa thứ cấp (secondary metabolite) là những chất mà vai
trò chủ yếu của chúng không phải để nuôi sống và phát triển cây cỏ, chúng có
thể có ở cây này nhưng không có ở cây kia. Hiện nay, có rất nhiều giả thiết về
vai trò của chúng trong thực vật. Có ý kiến cho rằng chúng là những chất thải,
góp phần giải độc cho cây (ancaloid, tinh dầu), góp phần tạo màu sắc, quyến
rũ ong bướm giúp cho sự phát triển nòi giống (flavonoid, carotenoid…), hoặc
góp phần bảo vệ chống các tác nhân làm hại cây (flavonoid, saponin, tinh dầu,
terpenoid…) v.v…
K35C – Khoa Hóa học

13

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Do có tác dụng sinh lý và dược lý quan trong như tác dụng diệt nấm,
kháng sinh, tác dụng gây độc đối với tế bào, tác dụng kích thích hoặc ức chế
sinh trưởng v.v… Chính vì thế cho nên các chất trao đổi bậc hai không những
là mối quan tâm khoa học mà nó còn có ý nghĩa trong lĩnh vực như y dược
học, nông nghiệp.
Trong cây có chứa các muối vô cơ. Các muối vô cơ ít tham gia vào tác
dụng sinh lý của dược liệu, tuy nhiên nó lại là các nguồn nguyên tố vi lượng
không thể thiếu đối với cây cỏ. Ở một số loài các muối vô cơ cũng có một số
tác dụng như tác dụng trị vi khuẩn của lưu huỳnh trong họ cải, tác dụng lợi
tiểu của muối kali (natri) trong râu ngô, tác dụng trị bướu cổ của các hợp chất
Iot của các loại tảo biển v.v…
Trong cây các hợp chất hữu cơ có tính chất hóa lý rất khác nhau, chúng
tồn tại ở dạng hòa tan trong nước, dầu béo hoặc tinh dầu. Các chất hòa tan
trong nước (dịch tế bào) là các hydrat cacbon phân tử bé (monosaccarit,
oligosaccarit), một số polysacarit (pectin, gôm), các glycozit (saponin,
flavonoid…), muối ancaloid của các axit vô cơ, axit hữu cơ, muối amin, axit
amin. Các chất tan trong dầu béo và tinh dầu là các hydro cacbon,
monoterpen, sterol, carotenoid secquiterpen, và các dẫn xuất phenyl
propanoid. Dầu béo và tinh dầu tồn tại trong các bộ phận riêng biệt của cây
như ở hạt (dầu béo), vỏ thân (tinh dầu) , ở hạch tiết của lá.
Trong cây còn có chứa các loại enzyme, trong quá trình nghiên cứu,
các glycozit có thể bị thủy phân một phần hoặc toàn phần làm thay đổi tính
phân cực dẫn đến thay đổi độ hòa tan của hợp chất trong dung môi nếu không
khống chế sự hoạt động các enzyme.

K35C – Khoa Hóa học

14

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

1.3.3.2 Chọn dung môi chiết.
Các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Tuy
nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng
trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, được loại bỏ dễ dàng, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Những dung môi này cần được chưng cất trước khi sử dụng. Nếu chúng
có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá
trình chiết. Một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-nbutyl-axetylcitrar và tributylphosphat. Những chất này chúng có thể lẫn với
dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các
thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)
phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Nó là nguyên nhân làm sai lệch kết quả
phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong
thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chloroform,
methanol và metylen clorit là những dung môi thường được lựa chọn trong
quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như lá, thân, rễ, củ, quả, hoa...
Chloroform có chứa những tạp chất như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản
ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm
khác. Sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có thể gây ra sự
phân huỷ, sự đồng phân hoá với các hợp chất kháchay sự khử nước.

Chloroform nó còn có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc
với chất này cần được thao tác cẩn thận, khéo léo ở nơi thoáng và phải đeo
mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform.

K35C – Khoa Hóa học

15

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên
màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn
các thành phần có trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chloroform
thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Do các ancol hoà tan
phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung
bình và thấp, vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng
thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho
quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ: trechlonolide A thu được từ
Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.

Đietyl ete ít khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ
bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ
nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất không
có khả năng tạo cholesterol như các carotenoit. Trong môi trường axit axeton
cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol. Quá trình chiết dưới điều kiện
axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có
khi xử lý các dịch chiết bằng axit - bazơ có thể tạo thành những sản phẩm
mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
không quá 30 - 400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt
độ cao hơn.

K35C – Khoa Hóa học

16

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

1.3.3.3. Quá trình chiết.
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Quá trình chiết sử dụng bình chiết Soxhlet:
Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với
chất rắn một thời gian rồi rút ra, dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục
và để tiết kiệm dung môi.
- Chiết ngâm:

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết
thực vật vì nó không đòi hỏi nhiều công sức, thời gian. Thiết bị sử dụng là
một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy
thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Ngâm chất rắn vào dung môi trong
một thời gian rồi chiết dung môi ra (chiết nguội).. Thông thường bình chiết
ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục vì mẫu được ngâm
trong dung môi khoảng 24h sau đó lấy chất chiết ra. Thông thường quá trình
chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không
còn chứa những chất giá trị nữa. Việc kết thúc quá trình chiết được xác định
bằng một số cách sau:
+ Với ancaloid, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các hợp chất này
bằng sự tạo thành kết tủa với các chất đặc trưng như: Dragendorff, Mayer…
+ Với flavonoid, do chúng thường là các chất màu nên khi dịch chảy
ra không còn màu cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết.
+ Trong trường hợp các lacton của secquiterpen và các glycozit trợ
tim phản ứng Kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc
khi cho phản ứng với aniline axetat cho biết sự xuất hiện của các hydrat
cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.

K35C – Khoa Hóa học

17

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao
nhất. Ngoài ra, cũng có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của
các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ. [13,14]
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký.
Sắc ký là một phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự
khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai
pha: pha tĩnh và pha động.
Phương pháp sắc ký dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các
chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với pha tĩnh. Nguyên nhân của sự
khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do
khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với pha tĩnh. Khi tiếp
xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh
tương ứng với tính chất của chúng (tính tan, tính bị hấp phụ...). Các chất khác
nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình sắc khí,
pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha
tĩnh khác, quá trình hấp phụ và phản hấp phụ sẽ lặp đi lặp lại. Kết quả là các
chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký
so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta
có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký.
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha tĩnh và pha động. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật này mô tả sự
K35C – Khoa Hóa học

18

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch
(hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử
đẳng nhiệt Langmuir:

n

n .b.C
1  b.C

Trong đó:
- n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
- n∞: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất
hấp phụ nào đó.
- b: hằng số.
- C: nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký.
Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng
thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai
nhóm: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa
pha động và pha tĩnh, người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu

sau:
1.4.3.1. Sắc ký cột (C.C).
Sắc ký cột là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha
tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha
đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng
thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp
phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của
chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn,
khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích
K35C – Khoa Hóa học

19

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Đinh Thị Nhạn

thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu
lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không
chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình
(MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu
cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.
Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với
quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác
nhau. Dkhác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ

chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu
tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 – 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ
này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau R f của các
chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là
tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh,
thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột
với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột ướt, chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy
cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ
lượng cần thiết.
- Cách 2: Nhồi cột khô, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn
khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp

K35C – Khoa Hóa học

20

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2