Nghiên cứu thành phần hợp chất flavonoit từ cây rì rì (homonoia riparia)

Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

LỜI CẢM ƠN
Khoá luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại Phòng Nghiên cứu cấu
trúc Viện hóa sinh biển, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS. TS. Phan
Văn Kiệm và các anh chị phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa Sinh biển Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ
em trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Hoàng
Lê Tuấn Anh - Viện Hoá Sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Hóa Sinh biển đã tạo điều
kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị tiên tiến của Viện để hoàn
thành tốt các mục tiêu đề ra của khóa luận tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn thầy giáo PGS. TS. Nguyễn Văn Bằng – Giám đốc TT
hỗ trợ NCKH&CGCN và cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Hoá học,
các thầy cô giáo trong Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt
những kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.
Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013
Sinh viên

Dương Thị Thu Linh

K35C – Khoa Hóa học

i

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
[]D
13

C NMR

Độ quay cực Specific Optical Rotation
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-1H COSY
2D-NMR

1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two-Dimensional NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectrometry

FAB-MS

Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao
High Resolution Fast Atom Bombardment Mass
Spectrometry
IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhúm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY
TLC

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy
Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

K35C – Khoa Hóa học

ii

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ CÁC BẢNG BIỂU
Hình 1.1: Lá cây Rì Rì…………………………………………………….3
Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen) ..................................................... 5
Hình 1.3: Flavon ..................................................................................... 5
Hình 1.4: Flavonol .................................................................................. 6
Hình 1.5: Flavanon .................................................................................. 6
Hình 1.6: Flavanonol-3 ........................................................................... 6
Hình 1.7: Chalcon .................................................................................. 7
Hình 1.8: Auron ...................................................................................... 7
Hình 1.9: Antoxianidin ........................................................................... 7
Hình 1.10: Leucoantoxianidin ................................................................. 8
Hình 1.11: (+)-Catechin .......................................................................... 8
Hình 1.12: (–)-Catechin .......................................................................... 8
Hình 1.13: 3-phenyl chromen .................................................................. 9
Hình 1.14: 3-phenylchromen-4-one ......................................................... 9
Hình1.15: Rotenoit .................................................................................. 9
Sơ đồ: Phân lập hợp chất từ lá cây rì rì ................................................. 25
Hình 4.1.1. Phổ 1 H-NMR của hợp chất 1 .............................................. 27
Hình 4.1.2. Phổ 1 H2-NMR của hợp chất 1 ............................................ 28
Hình 4.1.3. Phổ

13

C-NMR của hợp chất 1 ............................................. 29

Bảng 4.1. Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất 1 ................................... 30
Hình 4.1.4. Phổ 1 H-NMR của hợp chất 2 .............................................. 31

Hình 4.1.5. Phổ 1 H2-NMR của hợp chất 2 ............................................ 32
Hình 4.1.6. Phổ

13

C-NMR của hợp chất 2 ............................................. 33

Bảng 4.2. Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất 2 ................................... 34
Hình 4.1.7. Cấu trúc hóa học các hợp chất 1-2 ...................................... 35
Bảng 4.3: số liệu phổ NMR của hợp chất 1 -2………………………………35

K35C – Khoa Hóa học

iii

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................i
CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN ................................................................... 3
1.1. Vài nét về họ Thầu dầu, cây Rì Rì ........................................................ 3
1.1.1. Cây Rì rì (Homonoia riparia) .......................................................... 3
1.2. Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có trong cây Rì rì. .................. 5
1.2.1. Giới thiệu chung. [1, 3, 6, 7, 11] ..................................................... 5
1.2.2. Các nhóm flavonoit. [1, 3, 6, 7, 11] ................................................ 5

1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật. .................................................... 9
1.3.1. Chọn dung môi chiết. .................................................................... 10
1.3.2. Quá trình chiết. .............................................................................. 12
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ. [8,10] . 13
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký..................................... 13
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký. .................................................... 14
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký. ............................................... 14
1.5. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu
cơ.................................................................................................................19
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR). ................................ 17
1.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS). ................................... 17
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ......................................................... 18
Chương 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 21
2.1 Mẫu thực vật.......................................................................................... 21
2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất..................................................... 21
2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC): ................................................................ 21
2.2.2 Sắc ký cột (CC): ............................................................................. 21
2.2.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): .............................................. 21

K35C – Khoa Hóa học

iv

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ................... 21
2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) .................................................................... 21
2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) ........................................................... 22
2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): ............................................ 22
2.3.4. Độ quay cực []D .......................................................................... 22
2.4. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................... 22
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết........................................................ 22
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc ........................................... 22
2.5. Hoá chất................................................................................................ 23
CHƯƠNG 3 :THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .................................. 24
3.1 Xử lý mẫu ............................................................................................ 24
3.2 Phân lập các chất .................................................................................. 24
3.2 Hằng số vật lý và giữ liệu phổ của các hợp chất................................. 26
3.1.1. Hợp chất 1: Myricetin-3-α-D-xylopyranoside (1): ....................... 26
3.1.2. Hợp chất 2: Myricetin-3-O- β- xylopyranoside (2):……………….26
CHƯƠNG 4:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................ 27
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ........................................ 27
4.1.1 Hợp chất 1: Myricetin-3-O- α- arabinopyranoside (1): ................. 27
4.1.2 Hợp chất 2: Myricetin-3-β-D-xylopyranoside (2) ........................ 31
KẾT LUẬN .......................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................... 38

K35C – Khoa Hóa học

v

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

MỞ ĐẦU
Các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được con người
quan tâm và ứng dụng rộng rãi trong các ngành kinh tế quốc dân bởi đặc tính
ít độc, dễ hấp thụ và không làm tổn hại đến môi trường. Theo các tài liệu [2]
công bố hiện nay, có khoảng 60 - 70% các loại thuốc chữa bệnh đang được
lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc thiên nhiên.
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tương đối
lớn, độ ẩm cao (khoảng trên 80 %), Việt Nam hiện có một hệ thực vật rất phong
phú với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao, không kể đến các loại tảo và nấm
trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược [1]. Điều này
thực sự có ý nghĩa to lớn cho sự phát triển của ngành y tế, ngành hóa học và một
số ngành khác. Hệ thực vật phong phú như vậy được coi là tiền đề quan trọng
cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta.
Nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên có hoạt
tính sinh học cao để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác
trong đời sống con người là một trong những nhiệm vụ đã và đang được các
nhà khoa học trong và ngoài nước hết sức quan tâm.
Với sự phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học có giá trị từ thiên
nhiên, các nhà khoa học đã có những đóng góp đáng kể trong việc tạo ra các
loại thuốc điều trị những bệnh nhiệt đới và bệnh hiểm nghèo như: penicilin
(1941), artemisini (những năm 1970)… để kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất
lượng cuộc sống của con người. Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu
cung cấp các hoạt tính sinh học quý hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn tạo
cơ sở để tổng hợp ra các loại thuốc mới. Từ những tiền chất được phân lập
thiên nhiên, các nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hoạt chất có
khả năng trị bệnh rất cao.

K35C – Khoa Hóa học

1

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

Cây Rì rì (Homonoia riparia) thuộc họ Thầu dầu, là một cây đã được
sử dụng từ lâu trong dân gian để làm thuốc chữa một số bệnh như: viêm gan
mãn tính, đòn ngã, bệnh lậu, giang mai… Đây là cây thuốc quý, cần được
nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh của cây, tạo cơ sở để tìm kiếm
phương thuốc điều trị bệnh.
Từ các công dụng dân gian và các nghiên cứu của các nhà khoa học về
hoạt tính sinh học của loài Homonoia riparia…tôi đã lựa chọn loài này làm
đối tượng nghiên cứu. Mục đích của khóa luận là “Nghiên cứu và phân lập
thành phần flavonoit từ cây Homonoia riparia” để tìm tác dụng của cây.
Từ mục đích trên, tôi đưa ra nhiệm vụ đề tài:
- Thu hái mẫu lá cây rì rì, xử lý mẫu và tạo dịch chiết.
- Chiết tách các hợp chất Flavonoit.
- Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất đã tách chiết được.

K35C – Khoa Hóa học

2

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

CHƯƠNG 1:
TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về họ Thầu dầu, cây Rì Rì
1.1.1. Cây Rì rì (Homonoia riparia)
1.1.1.1. Mô tả
Tên khoa học: Homonoia riparia
Tên tiếng việt: Rù rì, Rì rì; Họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae)
Cây bụi hay cây nhỡ 1-2m, vỏ ráp. Lá hình dải dài 5-21cm, rộng 1,5-2,5cm;
gốc tù, chóp thuôn tù hay nhọn,
mép nguyên hoặc hơi có răng,
cuống lá có lông, lá kèm hình dùi,
hơi phình lên ở gốc. Hoa khác gốc.
Cụm hoa đực ở nách lá, thành
chùm bông, hoa đực có 2 loại lá
bắc; đài 3 mảnh; nhị nhiều do phân
nhánh. Cụm hoa cái thưa hoa, dạng
Hình 1.1: Lá cây Rì Rì

bông; hoa cái có hai loại lá bắc; đài

2 mảnh; bầu với 3 vòi nhụy. Quả nang hình cầu, có lông, 3 mảnh hơi lồi; hạt hình
trứng.
1.1.1.2. Phân bố sinh thái
- Phân bố địa lí: Loài này phân bố ở Trung Quốc, Campuchia, Việt

Nam, Thái Lan, Philippin, Malaixia, Xri Lanca, ấn Độ... ở nước ta, cây mọc
phổ biến ở các nơi từ thượng du đến trung du, hay gặp ở các tỉnh miền Bắc và
miền Trung. Có khi được trồng để giữ bờ sông suối. Có thể thu hái rễ và các
bộ phân của cây quanh năm, dùng tươi hay phơi khô.
- Tính vị và tác dụng: Rễ có vị đắng, tính hàn; có tác dụng thanh nhiệt
lợi thấp, tiêu viêm giải độc, lợi niệu.

K35C – Khoa Hóa học

3

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

1.1.1.3. Thành phần hoá học:
Dịch nhựa chứa albumin độc crepetin.
Hạt chứa dầu béo, tannin thuốc nhuộm. Hầu hết các bộ phận của cây có
hàm lượng tannin cao.
Chất độc, vỏ cây chứa cyanogenic glycosides.
Gỗ màu xám nâu cứng vừa phải và đóng hạt.
1.1.1.4. Công dụng, chỉ định và phối hợp:
Ở Việt Nam Rễ và các bộ phân của cây được thu hái quanh năm, được
dùng tươi hoặc phơi khô. Rễ có vị đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt lợi
thấp, tiêu viêm giải độc, lợi niệu.
Ở Vân Nam (Trung Quốc) người ta dùng rễ trị cảm, viêm gan mạn tính,
đòn ngã, bệnh lậu, giang mai, sỏi bàng quang.

Ở Ấn Độ, nước sắc rễ dùng chữa trĩ, sỏi ở bàng quang, lậu và giang
mai. Cũng dùng chữa loét, đái són đau, rối loạn đường tiết niệu.
Ở Campuchia, các chồi non và lá được dùng nấu nước gội đầu, gỗ cây
dùng nấu nước hãm uống chữa sốt rét.
Ở Lào, nước nấu lá dùng trị ghẻ.
Ở Java, người ta dùng dịch cây để nhuộm răng đen và làm bền chắc
răng bị lung lay.
Ở Malaixia, lá và quả nghiền ra dùng đắp trị bệnh ngoài da; cũng có thể
sắc nước uống.
Hiện nay, trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về loài H. riparia.
Năm 2007, nhóm tác giả Sang Y.M và cộng sự công bố phân lập được 1 chất
mới 1-oxo-aleuritolic acid và 12 chất đã biết từ rễ của loài Homonoia riparia
[15]. Mới đây nhất, nhóm tác giả Jin S. K. và cộng sự thông báo phân lập
được 6 hợp chất mới và 1 chất cũ dạng cycloartane tritecpent từ lá của loài
Homonoia riparia [16].

K35C – Khoa Hóa học

4

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

1.2. Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có trong cây Rì rì.
1.2.1. Giới thiệu chung. [1, 4, 6, 7, 11]
Các flavonoit là lớp chất phổ biến có trong thực vật.

Chúng là hợp chất có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A, B được nối với
nhau bởi một dị vòng C với bộ khung cacbon C6-C3-C6.
Việc phân loại các flavonoit dựa trên sự khác nhau của nhóm C3 (các
glucosit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà; antoxianin và antoxianiđrin
màu đỏ, xanh, tía và các dạng không màu; isoflavon, catecin và
leucoantoxianiđrin là các chất tan trong nước và thường nằm trong không
bào). Các flavonoit là các dẫn xuất của 2–phenyl chromen (flavan).
2'

A

1'

8
9

7

O

B

3'
4'

2
5'
3

6

10
5

4

6'

C

Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen)
1.2.2. Các nhóm flavonoit. [1, 4, 6, 7, 11]
1.2.2.1. Flavon và flavonol
Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên. Công thức cấu tạo của
chúng chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3.

Hình 1.3: Flavon

K35C – Khoa Hóa học

5

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

Hình 1.4: Flavonol

1.2.2.2. Flavanon
Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến các Chalcon do vòng
dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành
chalcon.

Hình 1.5: Flavanon
1.2.2.3. Flavanonol-3
Có 2 nguyên tử cacbon bất đối là C-2 và C-3 nên chúng có tính quang
hoạt. Các hợp chất thường gặp là aromadendrin, fustin và taxifolin.

Hình 1.6: Flavanonol-3

K35C – Khoa Hóa học

6

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

1.2.2.4. Chalcon
Chalcon có thể bị đồng phân hoá thành flavonon khi đun nóng với axit
clohydric (HCl).

Hình 1.7: Chalcon
1.2.2.5. Auron
Có màu đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng shinoda.

Hình 1.8: Auron
1.2.2.6. Antoxianidin
Thường gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan trong nước. Màu sắc
của nó thay đổi theo pH.

Hình 1.9: Antoxianidin
1.2.2.7. Leucoantoxianidin
Các hợp chất này mới chỉ tìm thấy ở dạng agycon, chưa tìm thấy ở
dạng glycozit.

K35C – Khoa Hóa học

7

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

Hình 1.10: Leucoantoxianidin
1.2.2.8. Catechin
Catechin là các dẫn xuất flavan-3-ol. Do có 2 trung tâm cacbon bất đối
nên chúng tồn tại dưới dạng 2 cặp đồng phân đối quang.

Hình 1.11: (+)-Catechin

Hình 1.12: (–)-Catechin

1.2.2.9. Isoflavonoit: Bao gồm các dẫn xuất của 3-phenyl chroman.

K35C – Khoa Hóa học

8

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

Hình 1.14: 3-phenylchromen-4-one

Hình 1.13: 3-phenyl chromen
1.2.2.10. Rotenoit và neoflavonoit:

Các rotenoit có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc cũng
như sinh tổng hợp.

Hình1.15: Rotenoit
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật.
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.

K35C – Khoa Hóa học

9

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

1.3.1. Chọn dung môi chiết.
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch
trước khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng
đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất
dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar
và tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình
sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy
bằng nhựa.
Methanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch
kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện
hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của
cây. Chloroform, metylen clorit và methanol là những dung môi thường
được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá,
thân, rễ, củ, quả, hoa...
Những tạp chất của chloroform như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản
ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm

khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng
có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp
chất khác. Chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm

K35C – Khoa Hóa học

10

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải
đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chloroform.
Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chloroform thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết [5]. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân

huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất
không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoit. Tiếp đến là axeton
cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.
Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình
phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit - bazơ có thể
tạo thành những sản phẩm mong muốn.

K35C – Khoa Hóa học

11

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp
trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp
cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo
thành chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá
30 - 400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.

1.3.2. Quá trình chiết.
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và
thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy
để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung
môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước
đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể
dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.

K35C – Khoa Hóa học

12

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:
Đragendroff và tác nhân Mayer.
- Các flavoloit thường là những hợp chất màu, vì vậy khi dịch chiết chảy
ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự
xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde
có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với
anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể
biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ. [8,10]
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký.
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp
phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha động.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan...). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác
nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc

K35C – Khoa Hóa học

13

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá
trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh
sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu
hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá
trình sắc ký.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký.
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
hai pha tĩnh và pha động. ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự
phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch
(hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử
đẳng nhiệt Langmuir:

n

n .b.C
1  b.C

n - lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n∞ - lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b - hằng số.
C - nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký.
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng
thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm
lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra
thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.4.3.1. Sắc ký cột (C.C).
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm
các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,
ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh

K35C – Khoa Hóa học

14

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết
sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp
phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng
tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt
càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng
trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy
được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp
suất cao (HPLC).

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu
cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là
Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này
mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp
phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ
này thấp (từ 1/5-1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số
tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong
khoảng 1/20-1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là
tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh,
thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột
với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất

K35C – Khoa Hóa học

15

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột
đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung
môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó, đưa dần vào cột đến
khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có
bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột
không được nứt, gẫy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy
quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica
gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu
chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silica
gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký,
người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ
bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện
chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng
lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.5. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ.
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các
phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà
người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể nào. Cấu trúc càng phức tạp thỡ
yờu cầu phối hợp cỏc phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp,
để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa

K35C – Khoa Hóa học

16

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các
phương pháp sắc ký so sánh…
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR).
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động
của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng
ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác
nhau. Do đó, dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm
chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH
tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300- 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl
C = O trong khoảng 1700-1750 cm-1…
1.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS).
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của
phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các
pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân
mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều
loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào
sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau,
phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là

phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp
hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử
và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị
phá vỡ.
- Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá
nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó
phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.

K35C – Khoa Hóa học

17

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass
Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ
chính xác cao.
- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương
pháp sắc ký kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc ký khí-khối
phổ), LC-MS (sắc ký lỏng-khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn
đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là
phân tích thuốc trong ngành dược).
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu

hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một
chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của
hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và
cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ( 1H và

13

C)

dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được
biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc
trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân
từ với nhau (spin coupling).
1.5.3.1. Phổ 1H-NMR:
Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hoá học của các proton được xác
định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên
tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ
chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc
hoá học của hợp chất.

K35C – Khoa Hóa học

18

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

1.5.3.2. Phổ 13C-NMR:
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng
phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 - 230ppm.
1.5.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer):
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên
phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và
CH3 nằm ở phía trên và của CH2 ở phía dưới trên phổ DEPT 1350. Trên phổ
DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR:
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của
các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.
Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương
tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ,
một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các
proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử
được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ
biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên
phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định
về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu
diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên
kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả
phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.

K35C – Khoa Hóa học

19

Trường ĐHSP Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Dương Thị Thu Linh

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE
differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào
một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các
proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng
hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu
trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể.
Nhưng phạm vi sử dụng của nó hạn chế vì yêu cầu cần tiên quyết của phương
pháp này là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối
với các hợp chất hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người còn sử dụng
kết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so
sánh kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín
hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các
mạch. Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại
đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp
thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với
các đường chuẩn dự kiến.

K35C – Khoa Hóa học

20

Trường ĐHSP Hà Nội 2