Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn acetobacter xylinum BHN2

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
*********

PHAN THỊ HƢƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
MÔI TRƢỜNG DINH DƢỠNG ĐẾN KHẢ NĂNG
TẠO MÀNG BC CỦA CHỦNG VI KHUẨN
ACETOBACTER XYLINUM BHN2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

GVHD: TS. Dƣơng Minh Lam
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2012


LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc nhất đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Dương Minh Lam đã

tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.
Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy Nguyễn Khắc
Thanh cùng toàn thể thầy cô trong tổ vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và khuyến khích
em trong thời gian học tập.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em

hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã quan
tâm giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2012

Sinh viên

Phan Thị Hƣơng


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây
là kết quả nghiên cứu của riêng em. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ
thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả đã công bố.
Nếu sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2012

Sinh viên

Phan Thị Hƣơng


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
MỞ ĐẦU..........................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................1
2. Mục tiêu.....................................................................................................2
3. Nội dung....................................................................................................2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn...................................................................2
5. Điểm mới...................................................................................................2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................3
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của chủng A.xylinum trong sinh giới.............3
1.1.1. Vị trí phân loại của chủng A.xylinum...................................................3
1.1.2. Đặc điểm phân loại của chủng A.xylinum............................................4
1.2. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC..................................................5
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose và màng BC.....................................5
1.2.1.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose....................................................5
1.2.1.2. Đặc điểm cấu trúc của màng BC..................................................6
1.2.2. Cơ chế tổng hợp màng BC...................................................................7
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo màng BC......................................8
1.3.1. Nguồn cacbon......................................................................................8
1.3.2. Nguồn nitơ...........................................................................................9
1.3.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng...................................................................9


1.3.4. Các chất kích thích sinh trưởng.........................................................10
1.3.5. Điều kiện nuôi cấy.............................................................................10
1.3.5.1. Độ pH..........................................................................................10
1.3.5.2. Nhiệt độ.......................................................................................10
1.3.5.3. Thời gian nuôi cấy.......................................................................10
1.3.5.4. Ảnh hưởng giữa diện tích bề mặt và thể tích nuôi cấy (tỷ lệ
S/V)...........................................................................................................11

1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay........................................11
1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới....................................11
1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng BC ở Việt Nam.....................................11
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................13
2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất...........................................................13
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................13
2.1.2. Hoá chất và thiết bị............................................................................13
2.1.2.1. Hoá chất.......................................................................................13
2.1.2.2. Thiết bị.........................................................................................13
2.1.3. Môi trường nghiên cứu......................................................................14
2.2. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................14
2.2.1. Phương pháp vi sinh...........................................................................14
2.2.1.1. Phương pháp phân biệt tế bào chủng A.xylinum BHN2 bằng
phương pháp nhuộm Gram.......................................................................14
2.2.1.2. Phương pháp bảo quản chủng A.xylinum

BHN2

trên thạch

nghiêng.....................................................................................................14
2.2.1.3. Phương pháp hoạt hoá giống.......................................................15
2.2.1.4. Phương pháp lên men tạo màng BC............................................15
2.2.2. Các phương pháp hoá sinh.................................................................15
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase.........................................................15


2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic......................................15
2.2.2.3. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose..................16
2.2.2.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid acetic bằng chuẩn

độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị...........................16
2.2.3. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng............................16
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thống kê...................................................17
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................18
3.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng A.xylinum BHN2..........18
3.1.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2.................18
3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa...............................................19
3.1.3. Sinh trưởng trên môi trường lỏng......................................................19
3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn A.xylinum BHN2.............................20
3.1.4.1. Hoạt tính catalase.........................................................................20
3.1.4.2. Khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic....................20
3.1.4.3. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trên môi
trường Blue bromphenol...........................................................................21
3.1.4.4. Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose.........................................22
3.2. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường nuôi cấy khác nhau........22
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng tạo màng BC từ
chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2....................................................................23
3.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose...................................................23
3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4.............................................25
3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4.................................................27
3.3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4. 7H2O........................................29
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau...........31
3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC............................33
3.5.2. Ảnh hưởng của pH đến hình thành màng BC....................................34


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................37
1. Kết luận.......................................................................................................37
2. Đề nghị .......................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................39

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
A.xylinum

: Acetobacter xylinum

BC

: Bacterial cellulose

MT

:Môi trường

Cs

: Cộng sự

PGM

: Phosphoglucomutase

CS

: Cellulose synthase

PC

: Plant cellulose

GK

: Glucokinase

FK

: Fructokinase

PC

: Plant cellulose

UGP

: Glucose-1- phosphate uridylytranseferase

1PFK

: Fructose-1-phosphatekinase

Fruc-6-P

: Fructose-1-phosphate

Glc-1-P

: Glucose-1-phosphate

Glc-6-P

: Glucose-6-phosphate

UDPGlc

: Uridine diphosphoglucose

FBP

: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase

G6PDH

: Glucose-6-phosphate dehydrodenase

PGI

: Phosphoglucoisomerase

PTS

: Hệ thống phosphotranferase

PGA

: Phosphogluconic acid

pABA

: p-aminobenzoic acid

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng A.xylinum
Bảng 3.1. Khả năng tạo màng BC trên các loại môi trường khác nhau của
chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến màng BC
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khối lượng tươi của
màng BC
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khối lượng tươi của màng
BC
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4. 7H2O đến khối lượng tươi của
màng BC
Bảng 3.6. Khối lượng tươi của màng BC qua thời gian nuôi cấy
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Chủng giống vi khuẩn A.xylinum BHN2
Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của A.xylinum BHN2
Hình 3.2. A.xylinum BHN2 trên môi trường thạch đĩ a
Hình 3.3. A.xylinum BHN2 trên môi trường lỏng
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng A.xylinum BHN2
Hình 3.5. Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn A.xylinum BHN2
Hình 3.6. Chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic của vi khuẩn A.xylinum
BHN2
Hình 3.7. Kết quả nhuộm màng BC
Hình 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khối lượng tươi màng BC

Hình 3.9. Khả năng tạo màng BC ở nồng độ glucose 20g/l và 17g/l
Hình 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khối lượng tươi của
màng BC
Hình 3.11. Khả năng tạo màng BC ở nồng độ (NH4)2SO4 1g/l và 3g/l
Hình 3.12. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khối lượng tươi màng
BC
Hình 3.13. Khả năng tạo màng BC ở nồng độ KH2PO4 2g/l và 1g/l
Hình 3.14. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4. 7H2O đến khối lượng tươi của
màng BC
Hình 3.15. Khả năng tạo màng BC ở nồng độ MgSO4. 7H2O 1g/l và 3g/l
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khối lượng màng BC qua thời gian
nuôi cấy


Hình 3.17. Khả năng tạo màng BC ở thời gian 2 ngày và 5 ngày
Hình 3.18. Khả năng tạo màng BC ở thời gian 250C và 300C
Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến sự hì nh thành màng BC
Hình 3.20. Khả năng tạo màng BC ở pH: 5 và pH: 3


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Chủng A.xylinum BHN2 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt
buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Khi nuôi cấy vi
khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp
màng BC, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose.
Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer--1,4 glucopyranose không phân
nhánh. Màng BC do chủng A.xylinum BHN2 tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc
tính cơ học giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất

hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính
đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì
vậy màng BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực
công nghệ.
Trên thế giới việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC đã đạt được nhiều
thành tựu to lớn trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp giấy, công nghệ
môi trường, công nghệ mỹ phẩm, trong y học,… Ở Việt Nam việc nghiên
cứu, sản xuất màng BC mới được quan tâm trong thời gian gần đây và mới
thu được những kết quả bước đầu (dùng màng BC đắp lên vết thương hở,
dùng màng BC đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ). Nhằm tìm kiếm nguồn
nguyên liệu có bản chất polyme sinh học để tạo cơ sở cho sản xuất màng trị
bỏng và nhiều ứng dụng khác tôi quyết định chọn đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo
màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 ”

1


2. Mục tiêu
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo
màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2.
3. Nội dung
3.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng A.xylinum BHN2
3.2. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường nuôi cấy khác nhau
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng
BC từ chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2
3.4. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi
khuẩn A.xylinum BHN2
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1. Ý nghĩa khoa học
Tìm được môi trường dinh dưỡng thích hợp cho chủng A.xylinum
BHN2 để tạo màng BC có chất lượng tốt trong thời gian ngắn.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo được màng BC bước đầu ứng dụng trong lĩnh vực trị bỏng ở thỏ
5. Điểm mới
Sự hì nh thành màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tốt nhất
trong môi trường dinh dưỡng gồm: nước dừa 1000ml, glucose: 20g/l,
(NH4)2SO4: 3g/l, KH2PO4: 2g/l, MgSO4. 7H2O: 3g/l. Lên men tĩnh trong 5
ngày ở điều kiện nuôi cấy là t0: 300C, pH: 5

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của chủng A.xylinum trong sinh giới
1.1.1. Vị trí phân loại của chủng A.xylinum
Tên gọi: A.xylinum là một tên gọi chính thức theo hệ thống danh pháp
quốc tế 1990. Vi khuẩn acetic nói chung, A.xylinum nói riêng đã và đang thu
hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới từ xưa tới nay.
Từ thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân lập và phân loại chúng.
Tuy nhiên cho đến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn nhiều tranh cãi [7].
Năm 1950, Frateur đã xếp A.xylinum vào nhóm Meroxydans [24].
Năm 1957, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology” ông
đã xếp A.xylinum vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes [19].
Năm 1974, “Bergey’s manual of determinative bacteriology”.
A.xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi
Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc [19]. Cùng với

thời gian loài vi khuẩn này lại được sắp xếp vào những vị trí khác nhau. Theo
“Applied and Envitromene microbiology” và “Bergey’s manual of systematic
bacteriology” thì họ Acetobacteraceae gồm hai chi vi khuẩn acetic quan trọng là
Acetobacter và Gluconobacter. Vi khuẩn A.xylinum được xếp vào chi
Acetobacter.
Các nghiên cứu tiếp nhằm cải thiện hơn quá trình lên men và từng bước
phân loại Acetobacter nói chung và A.xylinum nói riêng thành các nhóm khác

3


nhau đồng thời nghiên cứu đặc tính sinh học đặc trưng cũng như ứng dụng
của từng nhóm.
1.1.2. Đặc điểm phân loại của chủng A.xylinum
Đặc điểm hình thái - tế bào học
Chủng A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước
khoảng 2 μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả
năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo
váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc
nhuộm iốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể
tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic cao vượt
giới hạn cho phép, nó sẽ gây ức chế hoạt động của vi khuẩn [4], [20], [21].
Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, chủng A.xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn
hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong
suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Chủng
A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình
thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC. Ngược lại ở trong điều kiện
nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và
phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác

hẳn với cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [14], [21], [26].
Đặc điểm sinh lý – sinh hoá
Đặc điểm sinh lý
Chủng A.xylinum phát triển pH: 4 – 6, nhiệt độ 25 - 350C, nhiệt độ, pH
tối ưu tuỳ thuộc chủng. Khi tăng nhiệt độ lên 370C thì vi khuẩn không sinh
cellulose và tế bào sẽ suy thoái dù được nuôi cấy trong môi trường tối ưu.
Chủng A.xylinum chịu được pH thấp, bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi
cấy để giảm sự nhiễm khuẩn lạ [23].

4


Đặc điểm sinh hoá
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính
catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [22]…Theo quan điểm
này chủng A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae,
bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng
khác trong một chi được trình bày bảng 1.1:
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng A.xylinum
STT
1
2
3
4
5
6
7

Đặc điểm

Hiện tƣợng

Chuyển hoá môi trường chứa
Oxy hoá ethanol thành
Bromphenol Blue 0,04% từ màu
acid acetic
xanh sang màu vàng
Hoạt tính catalase
Hiện tượng sủi bọt khí
Sinh trưởng trên môi
Sinh khối không phát triển
trường Hoyer
Chuyển hoá glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch
thành dihydroxyaceton sau lên men
Vòng sáng xuất hiện xung quanh
Chuyển hoá glucose
khuẩn lạc trên môi trường chứa
thành acid
CaCO3
Kiểm tra khả năng sinh
Không hình thành sắc tố nâu
sắc tố nâu
Kiểm tra khả năng tổng Váng vi khuẩn xuất hiện màu
hợp cellulose
lam

Kết
quả
+

+
_
+
+
_
+

1.2. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose và màng BC
1.2.1.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose
Cellulose là một polisaccarit có phân tử lượng: 8.105 – 22,68.105 đvC.
Có công thức chung của tinh bột (C6H10O5)n trong đó n có thể nằm trong
khoảng 5000 – 14000. Mỗi phân tử cellulose gồm những đường đa được cấu
tạo từ các liên kết glucose. Các phân tử glucose nối với nhau ở vị trí β-1,4

5


bằng cầu nối oxi, có thể được cấu tạo từ 200 đến 1000 phân tử glucose [1],
[25]. Cellulose có hình dạng sợi dài, nhiều sợi liên kết song song với nhau
thành chùm nhờ các liên kết hydro giữa các nhóm (- OH). Mạch cellulose xếp
đối song song tạo thành các sợi có đường kính 3,5 nm. Mỗi phân tử cellulose
chứa khoảng 8000 gốc momosaccharide. Cellulose có tính chất của 1 tinh thể
Crystal và có tính khúc xạ kép vì do cấu tạo mà phân tử cellulose có tính định
hướng không gian 3 chiều sắp xếp song song với nhau [26], [28].
Cellulose là chất rắn dạng sợi, có màu trắng, không mùi, không vị. Tính
bền vững cơ học cao, chịu được nhiệt độ đến 200 oC mà không bị phân hủy.
Tỷ trọng khô là 1,45. Khi khô cellulose dai và khi tẩm nước nó mềm đi.
Cellulose không tan trong nước và các dung môi hữu cơ nhưng tan trong dung
môi như: HCl, HNO3…và một số dung dịch muối: ZnCl2, PbCl2…

Cellulose được cấu tạo bởi các mắt xích β-D glucose liên kết với nhau
bằng liên kết 1,4 glucocid, liên kết này thường không bền: Đun nóng cellulose
trong dung dịch acid vô cơ đặc thu được glucose.
(C6H10O5)n + nH2O -> nC6H12O6
Đun nóng cellulose trong hỗn hợp acid nitric đặc và acid sunfuric đặc
thu được cellulose nitrat.
[C6H7O2(OH)3]n + 3n HNO3 (đặc) -> [C6H7O2(ONO2)3]n + 3nH2O
1.2.1.2. Đặc điểm cấu trúc của màng BC
Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mạch
thẳng. Chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với
những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc vandecvan tạo thành

6


dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi
quần thể vi khuẩn sinh trưởng [7], [10], [30].
Màng BC có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ
chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ
khác mà được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song song
cấu thành mạng lưới cellulose. Do đó màng BC có độ bền cơ học cao, độ tinh
khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn… hơn hẳn cellulose của thực vật [13].
1.2.2. Cơ chế tổng hợp màng BC
Khi nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum trong môi trường có nguồn dinh
dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbonhidrate, vitamin B1, B2, B12... và các chất
kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình
bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần

để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra
môi trường, các sợi tơ nhỏ ngày càng dài phát triển từ đáy lên bề mặt trong
môi trường nuôi cấy. Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose
như sau: các tế bào A.xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện
quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp
đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này
được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một
enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà.
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc
tác tổng hợp cellulose ở chủng A.xylinum:
Glucokinase (GK)
Phosphoglucomutase (PGM)

7


Glucose-1-phosphate uridylyltransferase
(UDPG pyrophosphorylase hay UGP)
Cellulose synthase (CS).
Trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [19], [28].

Hình 1.1. Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose ở chủng A.xylinum
1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình tạo màng BC
1.3.1. Nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong các phân tử enzyme,
acid nucleic và sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy, hợp chất hữu cơ chứa cacbon
có ý nghĩa quan trọng trong đời sống vi sinh vật. Người ta dùng đường làm

nguồn cung cấp cacbon chủ yếu cho phần lớn vi sinh vật dị dưỡng. Để tránh
hiện tượng ở nhiệt độ cao và trong môi trường kiềm đường bị chuyển hóa khi
khử trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm

8


1100 trong 30 phút. Để nuôi cấy vi khuẩn thường dùng 0,2 – 0,5% đường. Hầu
hết các vi khuẩn chỉ đồng hoá được các loại đường ở dạng đồng phân D [2],
[6], [31].
1.3.2. Nguồn nitơ
(NH4)2SO4 là nguồn cung cấp nitơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát
triển của chủng A.xylinum. Khi nuôi cấy chủng A.xylinum trong môi trường có
sử dụng NH4+ sau khi đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô
cơ (SO42-, Cl-…) làm giảm pH môi trường [6]. Chủng A.xylinum có khả năng
đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, không có khả năng hấp thụ
các protein cao phân tử, chỉ các polypeptid không chứa quá 5 gốc acid amin
mới có thể di chuyển qua màng tế bào chất [2], [28]. Hàm lượng nitơ quá cao
hay quá thấp sẽ ảnh hưởng đến tính chất lý hoá môi trường, vì vậy ảnh hưởng
tới quá trình tạo thành cellulose của chủng A.xylinum.
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [2].
1.3.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng
Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào
vi sinh vật. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta dùng các loại
phospho vô cơ: KH2PO4, K2HPO4, KNO3… [2]. Bổ sung phosphat các môi
trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường [15].
Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến
sinh trưởng của chủng A.xylinum và quá trình hình thành màng BC như Mg,

Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố vi lượng thì
chủng A.xylinum không sinh trưởng và phát triển bình thường [13], [15].

9


1.3.4. Các chất kích thích sinh trưởng
Các vitamin pyridoxine, acid nicotinic, p-aminobenzoic acid (pABA),
biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng của tế bào và tổng hợp
cellulose, trong đó pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại.
Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy
A.xylinum thu màng BC. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà xác định
thành phần hóa học trong nước dừa khác nhau. Lượng đường khử tổng và
protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín. Trong nước dừa già có rất
nhiều nguyên tố vi lượng, các vitamin và acid amin cần thiết cho sự phát triển
của vi khuẩn.
1.3.5. Điều kiện nuôi cấy
1.3.5.1. Độ pH
Vi khuẩn A.xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp do
đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung acid acetic nhằm acid hóa môi
trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự
phát triển của vi sinh vật có hại.
1.3.5.2. Nhiệt độ
Theo Beyger nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A.xylinum vào khoảng 25
- 300C. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự
sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm.
1.3.5.3. Thời gian nuôi cấy
Trong môi trường dinh dưỡng lỏng sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện
một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 –
48 giờ hình thành một lớp trong và ngày càng dày.

Theo Thesis Holmes (2004), hàm lượng glucose giảm nhất sau 150 giờ
nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi khuẩn bắt đầu sử dụng

10


acid gluconic và 5 – keto acid gluconic trong quá trình trao đổi chất. Tác giả
cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt đến trạng thái tốt nhất.
1.3.5.4. Ảnh hưởng giữa diện tích bề mặt và thể tích nuôi cấy (tỷ lệ S/V)
Theo tác giả Trần Như Quỳnh khả năng hình thành màng tốt nhất ở tỷ
lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên men là 1,25 cm.
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay
1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới
Chủng A.xylinum và màng BC đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa
học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Trong công nghệ
thực phẩm sử dụng chủng A.xylinum tạo màng BC dày để sản xuất thạch dừa,
màng BC để bảo quản thực phẩm. Trong công nghiệp giấy, màng BC được
dùng để sản xuất giấy chất lượng cao, dùng để làm màng lọc nước trong công
nghệ môi trường, làm chất mang đặc biệt cho các pin và tế bào năng lượng.
Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng BC được dùng làm mặt nạ dưỡng da. Trong
lĩnh vực y học, màng BC bước đầu được nghiên cứu làm màng trị bỏng, da
nhân tạo thay thế da tạm thời, mạch máu nhân tạo…
1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng BC ở Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng
A.xylinum ngày càng được nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có nhiều các
nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng A.xylinum sự hình thành màng BC
và ứng dụng màng BC. Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình
tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở sản xuất thạch dừa của
Nguyễn Thúy Hương (Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách
Khoa TP. HCM). Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả Huỳnh Thị Ngọc

Lan, nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của chủng
A.xylinum và hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u. Tác giả Nguyễn Văn Thanh
và nhóm nghiên cứu của ông chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có

11


tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên men. Gần đây nhất có nhóm nghiên cứu
của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự đang nghiên cứu một số đặc tính
sinh học của vi khuẩn A.xylinum bước đầu ứng dụng màng BC trong điều trị
bỏng trên thỏ [12].

12


CHƢƠNG 2
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng A.xylinum BHN2 được phân lập từ màng của các nguồn nguyên
liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên men theo phương
pháp cổ truyền, chủng A.xylinum BHN2 nhận từ phòng Vi sinh,
Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
Các loại hóa chất được cung cấp từ phòng thí nghiệm Vi sinh,
khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 gồm:
Nguồn cacbon: glucose (công ty dược trung ương MEDI PTANTEX).
Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 (Trung Quốc)
Các loại muối khoáng: KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4

Thuốc thử: dung dịch fehling, dung dịch blue bromophenol.
Thuốc nhuộm: tím gentian, fucshin, lugol (Việt Nam)
Ngoài ra còn sử dụng : acid acetic, NaOH 0,1N, nước dừa (Việt Nam).
2.1.2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), máy so màu UV –
vis ( Nhật), máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ), máy lắc Orbital
Shakergallenkump (Anh), máy li tâm Sorvall (Mỹ), Micropipet Jinson (Pháp),
các loại tử 20l – 1000µl, kính hiển vi quang học Labomed (Mỹ), cân (Precisa
XT 320M - Thụy sỹ), hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn
cồn,…

13


2.1.3. Môi trường nghiên cứu
Thành phần
1. Glucose
2. Agar
3. (NH4)2SO4
4. KH2PO4
5. MgSO4. 7H2O
6. Acid acetic
7. Pepton
8. Nước mía ép
9. Nước dừa
10. Nước máy

MT1
20 g
20 g

3g
2g
2g
2%
0
0
0
1000
ml

MT2
20 g
0
3g
2g
2g
2%
5g
0
0
1000
ml

MT3
20 g
0
3g
2g
2g
2%

0
0
0
1000
ml

MT4
20 g
0
3g
2g
2g
2%
3g
200 ml
0
800 ml

MT5
20 g
0
5g
2g
0
2%
5g
0
0
1000
ml

MT6
20 g
0
3g
2g
2g
2%
0
0
1000 ml
0

Chú ý: Acid acetic được bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường
Trong đó:

MT1 là môi trường phân lập.
MT2 là môi trường nhân giống cơ bản.
MT3…MT6 là môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân biệt tế bào chủng A.xylinum BHN2 bằng phương
pháp nhuộm Gram
Chủng A.xylinum BHN2 là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân
biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép).
Tiến hành: Lấy chủng chủng A.xylinum BHN2 đem nhuộm tiêu bản theo
phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi
quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần [4], [16], [9].
2.2.1.2. Phương pháp bảo quản chủng A.xylinum BHN2 trên thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi phân lập, sơ bộ xác định là chủng A.xylinum
BHN2 được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4 - 5 ngày trong tủ ấm ở 300C.

14