Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng gluconacetobacter dưới tác dụng của tác nhân gây đột biến tia UV

Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2
LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ
em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này.
Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy Nguyễn Khắc Thanh,
thầy Phương Phú Công đã truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài
bộ môn.
Em cảm ơn chân thành tới các bạn cùng nhóm đề tài bộ môn vi sinh,
trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện
thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, những người thân, bạn bè đã
quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Ngọc Mai

Nguyễn Ngọc Mai

K35C Khoa Sinh-KTNN

Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là
kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực
nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không
trùng với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số tài liệu
của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn của mình.
Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2013

Sinh viên
Nguyễn Ngọc Mai

Nguyễn Ngọc Mai

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BC

: Bacterial cellulose

PMG

: Phosphoglucomutase

UGP

: Glucose-1-phosphate uridylytransferase

1PFK

: Fructose-1-phosphate kinase

Pru-6-P

: Fructose-6-phosphate

Glc-1-P

: Glucose-1-phosphate

UDPGlc

: Uridine diphospho glucose

GK

: Glucokinase

FBP

: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase

G6PDH

: Glucose-6-phosphate dehydrrogenase

PGI

: Phosphoglucoisomerase

PTS

: Hệ thống Phosphotransferase

Fru-bi-P

: Fructose-1,6-bi-phosphate

Glc-6-P

: Glucose-6-phosphate

PGA

: Phosphogluconic acid

FK

: Fructokinase

CS

: Cellulose synthate

CFU

: Clony Forming Unit

UV

: Ultra Violet

VSV

: Vi sinh vật

Cs

: Cộng sự

Nguyễn Ngọc Mai

K35C Khoa Sinh-KTNN

Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

Nguyễn Ngọc Mai

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật
chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh
với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công
nghiệp, y học...Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm
hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae.
Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành
trên bề mặt một lớp màng BC, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với
phân tử cellulose. Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer--1,4

glucopyranose không phân nhánh được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn khi
nuôi cấy chúng trên môi trường dịch lỏng.
Màng BC do Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính
cơ học giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý
đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi
lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vậy BC
được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ.
Trên thế giới màng BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực
công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước,
chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm chất biến
đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong
sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học,
màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều
trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt
nạ dưỡng da cho con người.

Nguyễn Ngọc Mai

5

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ
khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí

nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học
Sư phạm Hà Nợi 2 phân lập tuyển chọn được chủng Gluconacetobacter có
khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ
chủng Gluconacetobacter có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ
sở để tạo ra màng trị bỏng cho người. Màng BC hoàn toàn có thể sản xuất
trong nước bằng phương pháp lên men tĩnh của vi khuẩn Gluconacetobacter
trong môi trường lỏng. Tuy nhiên một vấn đề gặp phải là chủng
Gluconacetobacter dễ bị thoái hóa. Vì vậy việc không ngừng nâng cao hoạt
tính sinh tổng hợp cellulose là rất cần thiết. Chính vì lý do đó, với mong
muốn tuyển chọn được chủng có khả năng tạo màng BC trong thời gian nhanh
hơn, dai hơn chủng Gluconacetobacter tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter dưới tác
dụng của tác nhân gây đột biến tia UV ”
2. Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn được chủng đột biến từ chủng Gluconacetobacter có khả
năng tạo màng BC trong thời gian ngắn.
3. Nội dung đề tài

3.1. Xác định thời gian đột biến dưới tác nhân đột biến tia UV
3.2. Gây đột biến và tuyển chọn chủng đột biến.
3.3. Xác định sự thay đổi hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc của
chủng trước và sau khi đột biến.

Nguyễn Ngọc Mai

6

K35C Khoa Sinh-KTNN

Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

4. Ý nghĩa khoa học

Chọn chủng sau đột biến từ chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo
màng BC trong thời gian ngắn.
5. Ý nghĩa thực tiễn

Tạo màng BC trong thời gian ngắn nhất và tốt nhất có triển vọng ứng
dụng vào một số lĩnh vực trong cuộc sống, đặc biệt là lĩnh vực y học.
6. Điểm mới

Chọn được chủng sau đột biến từ chủng Gluconacetobacter có khả
năng tạo màng BC trong thời gian ngắn, dai hơn chủng gốc.

Nguyễn Ngọc Mai

7

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2
NỘI DUNG

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới

1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Theo

hệ

thống phân loại của

nhà

khoa

học

Bergey thì

Gluconacetobacter thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn
nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi Gluconacetobacter như một loài phụ của
A. aceti [17].
1.1.2. Đặc điểm phân loại
1.1.2.1.Đặc điểm hình thái, tế bào học
Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước
khoảng 2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả
năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo
váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc
nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể
tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic quá cao

vượt quá giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [13].
Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt
buộc, hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu,
nước ép hoa quả, trong đất.

Nguyễn Ngọc Mai

8

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter
1.2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành
khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu
trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi
trường. Vi khuẩn Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở
điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC.
Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với
kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra
những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh.
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
Đặc điểm sinh lý:
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH: 4 - 6.
Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thối hồn

toàn ngay cả trong mơi trường tới ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác

Nguyễn Ngọc Mai

9

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter sinh trưởng và tạo màng.
Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ
sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
Đặc điểm sinh hoá:
Năm 1950, Frateur [20] đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn
cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt
tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [20]…Theo quan
điểm này

Gluconacetobacter

là

chủng thuộc

chi

họ

Acetobacter,

Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân
biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây
[20] :
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
theo Frateur (1950)
STT
1
2
3
4
5
6
7

Đặc điểm

Hiện tượng

Oxy hố ethanol
thành acid acetic
Hoạt tính catalase
Sinh trưởng trên
mơi trường Hoyer
Chuyển hoá
glycerol thành

dihydroxyaceton
Chuyển hoá glucose
thành acid
Kiểm tra khả năng
sinh sắc tố nâu
Kiểm tra khả năng
tổng hợp cellulose

Chuyển hoá môi trường chứa Bromphenol
Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
Hiện tượng sủi bọt khí

Nguyễn Ngọc Mai

Kết quả
+
+

Sinh khối không phát triển

_

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên
men

+

Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn
lạc trên môi trường chứa CaCO3

+

Không hình thành sắc tố nâu

_

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

10

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter
1.1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật
dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất
có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ
bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử

trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở
1100 trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp
hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác
người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường
dùng 0,5-0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các loại
đường ở dạng đồng phân D [1].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [1].
1.1.3.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong mơi trường có sử dụng NH4+ thì sau
khi chúng đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ ( SO42-,
Cl- …) làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trường. Muối anion của các

Nguyễn Ngọc Mai

11

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

axit hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn
(mặc dù đắt hơn).
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,
xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết

NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [1].
Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu
cơ. Các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi
sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân
tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di
chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [1].
1.1.3.3. Hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men
Ethanol được sử dụng như một cơ chất. Hàm lượng ethanol có thể thay
đổi từ 2-10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo
Hong Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2-1% tốt
nhất ở 0,6% . Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở
3-3,5% . Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7-10% V.
Để tránh hiện tượng oxy hoá hoàn toàn acid acetic cần có một lượng ethanol
sót trong sản phẩm từ 0,2-0,5% để ức chế tự tổng hợp enzyme oxy hoá acid
acetic và muối acetate [1], [23].
Ngoài việc oxy hoá ethanol, vi khuẩn acetic còn có khả năng oxy hoá
các rượu khác thành các acid tương ứng.
1.2. Lƣợc sử nghiên cứu về vi khuẩn A. xylinum trên thế giới và Việt Nam

1.2.1. Tình hình nghiên cứu A. xylinum trên thế giới
Hiện nay, vi khuẩn A. xylinum và ứng dụng của nó đang được sự quan
tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Tập trung theo hai hướng cơ bản:

Nguyễn Ngọc Mai

12

K35C Khoa Sinh-KTNN

Khóa luận tốt nghiệp


Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

Hƣớng thứ nhất: Chủ yếu là phân lập tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính
sinh học của A. xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng trong sinh
giới.
Tiêu biểu là các nghiên cứu của Beijerinck, Frateur [20]. Trên cơ sở
nghiên cứu các đặc tính hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa các tác giả xác
định nguồn gốc, đặc điểm phân loại của A. xylinum. Các nghiên cứu của một
số nhà khoa học Nhật Bản như Kumiko Nanda và cs, P. M. Kutima; T.T.
Kadere và cs [25]. Các tác giả phân lập tuyển chọn và nghiên cứu đặc tính
sinh học của A. xylinum, và một số chủng vi khuẩn acetic khác phân lập từ các
sản phẩm lên men truyền thống của Nhật như Mnazi, Komesu, Kurosu.



Hƣớng thứ hai: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm và ứng
dụng của BC vi khuẩn A. xylinum.
Đó là các nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của các chủng
A.xylinum; ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến
quá trình sinh tổng hợp cellulose. Mở đầu là S. Hestrin; M. Scharmn và cs
[22], [27], [26], sau là một loạt các nghiên cứu tương tự, [19], [21], [23].
Tiếp đến là nghiên cứu cơ chế tổng hợp màng BC, con đường chuyển
hóa cacbon trong vi khuẩn A. xylinum. Mở đầu là nghiên cứu của R.M. Brown
và cs, K.Zaar [18]. Gần đây cơ chế sinh tổng hợp cenllulose, các hệ enzyme
tham gia và con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn A. xylinum mới dần
được sáng tỏ [27].
Từ nửa sau thế kỷ XIX đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu

về ứng dụng của màng BC trong các lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt là màng trị
bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã thu được kết
quả tốt như Wan và Millon đã được đăng ký bản quyền về làm màng BC từ A.
xylinum dùng trị bỏng [28]. Về sau có nhiều tác giả khác cũng nghiên cứu về
hướng này.
Nguyễn Ngọc Mai

13

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

1.2.2. Tình hình nghiên cứu A. xylinum ở Việt Nam
Trong điều trị bỏng, để giảm đau cho bệnh nhân, hạn chế mất dịch, máu
qua vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mô hoá ở
bỏng nông hay kích thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các
loại vật liệu che phủ tạm thời. Việc sử dụng các vật liệu che phủ tạm thời có
nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết thương phần mềm, vết bỏng đã được
sử dụng từ rất lâu. Tuy nhiên, việc sử dụng những loại da này cũng mới chỉ
dừng lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi. Mặc dù da dị loại tươi có
những ưu điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những
nhược điểm nhất định. Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và
xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Vật liệu từ da đồng
loại là lý tưởng nhất cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhưng trong nhiều
trường hợp rất khan hiếm; không đủ đáp ứng được. Chính vì vậy vật liệu che
phủ tạm thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan

trọng trong điều trị bỏng. Một trong các loại màng sinh học đã và đang được
quan tâm ngày nay là màng cellulose vi khuẩn.
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn A.
xylinum ngày càng được quan tâm . Có một số các nghiên cứu, công bố liên
quan đến A. xylinum sự hình thành màng BC và ứng dụng màng BC. Các
công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc
màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng [9]; sản xuất thạch dừa [7]. Gần đây
nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế
bào vi khuẩn của Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thành Hổ [29].
Theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ Vi sinh – Ký sinh, Đại học
Y Dược, Thành phố Hồ Chí Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ông chế tạo
thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên

Nguyễn Ngọc Mai

14

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

men. Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên
nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời [30].
Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan,
nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của A. xylinum và
hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u. Ngoài ra, có nghiên cứu về hiệu ứng làm
lành vết thương của hỗn hợp Chistosan tan trong nước, Bacterial cellulose ,

Nano bạc của nhóm tác giả Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê
Thị Mỹ Phước và Nguyễn Quốc Hiển [10].
Và tại phòng Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs đang tiến
hành nghiên cứu quy trình sản xuất màng BC với chất lượng tốt và ứng dụng
vào trị bỏng bước đầu đã đạt được thành cơng [14].
1.3. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC

1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng BC
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mạch
thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau.

Sợi cellulose của màng BC

Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.2. Cấu trúc cellulose

Nguyễn Ngọc Mai

15

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với
với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc Vandesvan tạo
thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng
lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể
xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng.
1.3.2. Cơ chế tổng hợp màng BC
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [16].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc
tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter:
Glucokinase (GK): Phosphoryl hóa C6 của glucose.
Phosphoglucomutase (PGM): Xúc tác quá trình chuyển hóa Glucose – 6
phosphat thành glucose – 1 phosphat.
Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay
UGP): Xúc tác tổng hợp UDP – Glucose.
Cellulose synthase (CS): Xúc tác tổng hợp cellulose từ UDP – glucose.
Con đường sinh tổng hợp cellulose được thể hiện rõ ở hình dưới đây

Nguyễn Ngọc Mai

16

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter
1.4. Đột biến ở vi sinh vật

Đột biến (Mutation) bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa là biến đổi,
được nhiều nhà nghiên cứu khai thác ở các khía cạnh khác nhau. Theo quan
điểm hiện đại, đột biến là những biến đổi trong vật chất di truyền xảy ra đột
ngột.
Với vi sinh vật, các nhà nghiên cứu quan tâm phân loại đột biến theo
hai hướng: tác nhân gây đột biến, và tính trạng biến đổi do đột biến.

Nguyễn Ngọc Mai

17

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

Các phương pháp chính gây đột biến vi sinh vật:
Gây đột biến bằng tác nhân hóa học: Có rất nhiều hóa chất có thể gây
đột biến, trong đó các chất gây đột biến mạnh nhất gồm có:
metylmetansunfonat, etylmetansunfonat, đimetylsunfat, đietylsunfat,
metylnitronitrozoguanidin,…
Gây đột biến bằng tác nhân vật lý: Là sử dụng các tia phóng xạ như tia

α, β, γ, và tia tử ngoại có tác dụng gây nhiều loại đột biến, thường dùng trong
phòng thí nghiệm. Tia tử ngoại với bước sóng 260nm có hiệu quả cao trong
việc gây đột biến cho vi sinh vật , tác dụng chủ yếu lên các bazơ pirimidin.
Tia tử ngoại (ultraviolet) (UV) là tác nhân được nhà nghiên cứu sử dụng gây
đột biến từ những năm đầu của thế kỉ XIX, do đó có những ưu điểm vượt trội
so với các phương pháp đương thời. Tia UV tác động vào bộ máy di truyền
gây biến đổi mạnh có thể tạo ra các chủng có hoạt tính mạnh, ngồi ra tia UV
còn khá an toàn đới với người sử dụng. Nên trong khuôn khổ luận văn này,
chúng tôi đi sâu phân tích ảnh hưởng của tia UV đến đột biến của vi sinh vật.
Tia UV nằm trong vùng quang phổ không nhìn thấy của ánh sáng mặt
trời. Là sóng điện từ có bước sóng từ: 150.10-10m ÷ 0,4.10-6 m (150A0 ÷
4000A0). Theo các nghiên cứu đợt biến tia UV thì bước sóng 2600A0 đến
2800A0 có tác dụng biến đổi mạnh nhất tới bộ máy di truyền VSV. Đây cũng
bước sóng mà các nhà nghiên cứu hay dùng.
Cơ chế gây đột biến của tia UV đối với VSV còn nhiều tranh cãi, tuy
nhiên nhiều nghiên cứu đưa ra một giả thuyết chung như sau: Ở bước sóng
2600A0 ADN của vi khuẩn hấp thụ mạnh nhất. Dưới tác động của tia UV,
bazo cystein gắn thêm phân tử H2O vào liên kết C = C của mạch vòng và
thymin bị đứt liên kết C = C mạch vòng nối hai phân tử dime thymin. Do đó
các nhánh thymin gần nhau trong chuỗi ADN xuất hiện các liên kết cộng hóa
trị, ức chế sự nhân đôi của ADN [3].
Nguyễn Ngọc Mai

18

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

Từ nhu cầu sản xuất trên quy mô công nghiệp, các nhà nghiên cứu đã
và đang tiến hành những phương pháp tác động đến bộ máy di truyền của các
chủng dại, nhằm chọn ra giống có khả năng “siêu tổng hợp” đáp ứng những
nhu cầu cấp thiết hiện nay. Thành tựu nổi bật nhất nhờ sử dụng phương pháp
đột biến này mang lại là việc tuyển chọn thành công “siêu chủng” Penicillium
chrysogenum Wis 49-133 dùng để sản xuất Pennicillin. Nhờ phương pháp này
từ chủng gốc ban đầu (1941) hoạt tính chỉ đạt 30 UI/ml đến năm 1967 đạt
5000 UI/ml. Với công đoạn gây đột biến sau đó chọn lọc các chủng có hoạt
tính mạnh. Các nhà nghiên cứu đã tạo ra được “siêu chủng” có năng suất gấp
700 lần so với chủng dại. Thành công này đã góp phần không nhỏ trong công
nghiệp sản xuất kháng sinh phục vụ nhu cầu cấp thiết cho con người.
Ngày nay, với những kỹ thuật hiện đại gây biến đổi bộ máy di truyền của
VSV theo những hướng xác định như lai ghép tế bào trần và chuyển gen. Đã
thu được những chủng có năng suất rất cao nhưng các nhà nghiên cứu vẫn
thường xuyên dùng phương pháp tuyển chọn bằng tia UV. Phương pháp này
đơn giản, dễ làm, an toàn đặc biệt chi phí thấp.

Nguyễn Ngọc Mai

19

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 được phân lập từ màng của
các nguồn nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên
men theo phương pháp cổ truyền, chủng giống nhận từ phòng Vi sinh vật,
khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nợi 2.
2.1.2. Hóa chất
- Nguồn đường: glucose (sản xuất tại cty Dược T.W MEDIPLANTEX
Hà Nội, Việt Nam)
- Nguồn nitơ:
+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4 (sản xuất tại Trung Quốc)
+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton (sản xuất tại Trung Quốc)
- Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH (sản xuất tại
Trung Quốc)
- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch
lugol
- Agar (sản xuất tại cty TNHH Hải Long, Hải Phòng, Việt Nam)
- Acid acetic (sản xuất tại cty hóa chất Đức Giang, Hà Nội, Việt Nam)
(được cung cấp bởi phòng Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2)
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng những dụng
cụ thiết bị như:
Nồi hấp khử trùng, tủ sấy (Haraeus, Đức).
Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức).
Nguyễn Ngọc Mai

20

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ)
Micropipep (Gilson, Pháp).
Tủ lạnh (Tawasi, Nhật).
Kính hiển vi quang học (Olympus CX41 , Nhật).
Hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác, lam
kính, la men, đèn cồn,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác (được
cung cấp bởi phòng Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2)
2.1.4. Môi trường nghiên cứu
2.1.4.1. Môi trường giữ giống (môi trường cơ bản):
Glucose: 20g/l;

MgSO4.7H2O: 2g/l

Pepton: 5g/l

Nước máy: 1000 ml

(NH4)2SO4: 3g/l

Agar: 20g/l.

KH2PO4: 2g/l
2.1.4.2. Môi trường nhân giống:
Glucose: 20g/l

MgSO4.7H2O: 2g/l

Pepton: 5g/l

Nước máy: 1000 ml

KH2PO4: 2g/l
(NH4)2SO4: 3g/l
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng
theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha

Nguyễn Ngọc Mai

21

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 30 oC trong 5 ngày đếm
khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa Petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi
khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.
N = Ai .

Trong đó

1000
Vi

.

1
10

-n

N : Tổng số CFU trong 1ml mẫu ban đầu.
Ai: Số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giải
CaCO3 trên đĩa phân lập có độ pha loãng 10-n.
Vi : Thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập.
10-n : Là độ pha loãng của mẫu phân lập.

2.2.1.2. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter bằng
phương pháp nhuộm Gram
Vi khuẩn Gluconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể
phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm
kép).
Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter đem nhuộm tiêu
bản theo phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính

hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần [2], [4], [5].
2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ bộ xác định là
Gluconacetobacter được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm
ở 300C. Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Cấy truyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần [4], [5].
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hố giống
Giớng từ ớng nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử
dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật
Nguyễn Ngọc Mai

22

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu
chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng. Sau đó đem xử lý trong đèn
tím 15 phút, cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135
vòng/phút trong 24 giờ [4], [5].
2.2.1.5. Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng. Sau đó
khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trường 5% giống
hoạt hoá. Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh trong 3 - 4 ngày.
2.2.2. Phương pháp đột biến vi sinh vật
Nguyên tắc đột biến: lấy chủng có khả năng tạo màng chất lượng cao

nhân thuần, ổn định hoạt tính [8].
Chúng tôi tiến hành đột biến vi sinh vật dưới tác dụng của đèn UV có
bước sóng 253,7 nm trong các thời gian khác nhau: 3, 5 ,7, 9 phút. Với cách
đột biến như sau:
Đột biến trên môi trường thạch đĩa: nuôi vi khuẩn trên môi trường lỏng
(môi trường lên men) ở 25-300C trong 8-12h (khoảng thời gian quần thể vi
sinh vật bắt đầu phân chia mạnh khi bước vào pha log). Pha loãng mẫu, trang
đều trên môi trường thạch. Để trong tủ ấm ở 25-300C trong 2-3h để các tế
bào phân chia. Sau đó tiến hành gây đột biến dưới đèn UV.
2.2.3. Phương pháp tuyển chọn sơ bộ các chủng sau đột biến
Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường thạch, trang vi khuẩn
Gluconacetobacter và đột biến ở thời gian thích hợp. Sau đó các đĩa này
được nuôi ở tủ ấm 25-300C. Khi các khuẩn lạc mọc, dùng que cấy tách riêng
các khuẩn lạc cấy sang môi trường thạch nghiêng, sau đó đem nuôi ở tủ ấm.
Khi vi khuẩn Gluconacetobacter trong các ống thạch nghiêng này mọc, tiến
hành hoạt hóa và lên men tạo màng.
Nguyễn Ngọc Mai

23

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

2.2.4. Phương pháp tốn học
Xử lý thớng kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp
trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” [11], và “Thống kê và ứng

dụng” [15] như:
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
X=

thí nghiệm:

1 n
åX
n i =1 i
n

* Trung bình bình phương các sai lệch:



(X
i 1

 X )2

n 1

d

±m =

n

* Sai số đại diện của trung bình cộng:
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:

i

Cv 

x100
X

* Tính giá trị trung bình cộng tổng thể:
Theo công thức:
n

M=
Trong đó:

Xi
å
i =1 n
M:

Giá trị trung bình tổng thể

Xi:

Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm

n: Số lần thí nghiệm

Nguyễn Ngọc Mai

24

K35C Khoa Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Ðại học Sư phạm Hà Nội 2

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định thời gian gây đột biến phù hợp

Chúng tôi tiến hành đột biến bằng cách đặt mẫu cần đột biến cách đèn
UV có bước sóng 253,7nm là 15cm ở các thời gian khác nhau. Kết quả thể
hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian tác động tia UV đến khả năng sinh
trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
Thời gian đột biến (phút)

Khả năng mọc của vi khuẩn

3

++++

5

++

7

+

9

-

Chú thích:
++++: Mọc rất tốt (mật độ khuẩn lạc >30CFU/đĩa)
++ : Mọc khá (mật độ khuẩn lạc từ 4 - 10 CFU/đĩa petri)
+

: Mọc yếu (mật độ khuẩn từ 1-3 CFU/đĩa petri)

-

: Không mọc trên 50% số đĩa petri

Nhận xét 1: Tại thời điểm 3 phút số lượng khuẩn lạc mọc tốt, tại thời điểm
5 phút, khả năng sống sót của vi khuẩn khá, tại thời điểm 7 phút số lượng
khuẩn lạc mọc yếu nhất. Ở thời gian 9 phút, không một tế bào nào của vi
khuẩn sống sót, tuy nhiên tác động tia UV dưới 7 phút thì chúng vẫn mọc.
Qua bảng số liệu ta thấy , thời gian tác động của tia UV càng dài thì càng
ảnh hưởng càng mạnh tới khả năng sống sót của vi khuẩn.Vậy chứng tỏ tại
thời điểm 7 phút chính là ranh giới của sự đột biến và không đột biến nên tôi
quyết định chọn chủng đột biến với thời gian đột biến là 7 phút với khoảng

Nguyễn Ngọc Mai

25

K35C Khoa Sinh-KTNN