Phân tích mối quan hệ di truyền của sâm lào (panax SP ) và sâm ngọc linh (panax vietnamensis HA et grushv ) với một số loài khác nhau trong chi panax

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
---------------

LƢU THỊ NHƢ

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA
SÂM LÀO (PANAX SP.) VÀ SÂM NGỌC LINH
(PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) VỚI
MỘT SỐ LOÀI KHÁC TRONG CHI PANAX

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành:Thực vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN THỊ PHƢƠNG TRANG
TS. HÀ MINH TÂM

Hà Nội, 2013

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình làm khóa luận, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp
đỡ của TS. Nguyễn Thị Phương Trang và TS. Hà Minh Tâm. Nhân dịp này,
tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng Hệ thống học phân tử
và Di truyền bảo tồn - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tìm hiểu và nghiên
cứu tại viện.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của
nhiều tổ chức, cá nhân trong và ngoài trường. Nhân dịp này, tôi xin trân trọng
cảm ơn: Ban chủ nhiêm khoa Sinh – KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2; đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè trong suốt thời
gian tôi học tập và nghiên cứu.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Lưu Thị Như

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực, khách quan của khóa luận, tôi xin cam
đoan:
Khóa luận “Phân tích mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và
Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác
trong chi Panax ” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới
sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phương Trang và TS. Hà Minh Tâm. Các
kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa được
công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013.
Sinh viên
Lưu Thị Như

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABI

Applied Biosystems ABI 3100 DNA Sequencer (máy đọc trình
tự)

ADN

Acid Deoxyribonucleic

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism
(Đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại)

ARN

Acid Ribonucleic

Bp

Base pair (cặp bazơ)

CI

Cloroform-Isoamyalcohol

cpDNA

Chloroplast Acid Deoxyribonucleic (genome lục lạp)

cpSSR

Chloroplast-Simple Sequence Repeat (trình tự lặp lại đơn giản
trong genome lục lạp)

dH20

Nước khử ion

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphtate (các nucleotide tự do)

Genbank

Ngân hàng gen quốc tế

ISSR

Internal sinple sequence repeat (vùng giữa các đoạn trình tự lặp
lại đơn giản)

ITS

Internal Transcribed Spacer

Kb

Kilobase

MEGA

Phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử

NCBI

Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc tế

PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

rDNA

ADN ribosome

RE

Restriction Enzyme (enzyme giới hạn)

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism DNA

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2
SSR

Khóa luận tốt nghiệp

Simple Sequence Repeat (trình tự các đoạn lặp đơn giản)

DANH LỤC BẢNG
trang

Bảng 1

Danh sách các trình tự sử dụng trong nghiên cứu

18

Bảng 2

Khoảng cách di truyền của Sâm lào so sánh với 1 số

25

loài khác trong chi Panax

DANH LỤC HÌNH
Trang
Hình 1

Nhâm sâm việt nam – Panax vietnamensis

4

Hình 2

Sâm ngọc linh (thu tại Trà My, tỉnh Quảng Nam)

6

Hình 3

Lá và củ Sâm lào

15

Hình 4

Điện di ADN tổng số trên gel Agarose gel 1%

15

Hình 5

Sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1%

19

Hình 6

So sánh trình tự vùng ITS-rDNA của Sâm lào và

20

Sâm ngọc linh với một số loài khác trong chi Panax
Hình 7

Hình ảnh các đỉnh (peak) của sản phẩm PCR trên

21

máy đọc trình tự ABI 3100

Hình 8

So sánh trình tự vùng ITS-rADN của Sâm lào và

22

Sâm ngọc linh với một số loài khác trong chi Panax
Hình 9

Mối quan hệ di truyền của loài Sâm lào (Panax sp.)

27

và Panax vietnamensis với một số loài khác trong
chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự vùng ITSrDNA bằng phương pháp Maximum Parsimony

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC

Lưu Thị Như

K35C - Sinh

Trường ĐHSP Hà Nội 2

7

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài:
Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv. 1985) được tìm thấy
ở Việt Nam và hiện đang được coi là loài đặc hữu hẹp, chỉ phân bố ở miền
trung Việt Nam (vĩ độ 14015) ở độ cao trên 1800m so với mặt biển [18]. Sâm
ngọc linh được xác định là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá
trị nguồn gen [16].
Nhiều công trình nghiên cứu về Sâm ngọc linh đã được triển khai, đặc
biệt từ năm 1985, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, chủ yếu với các nhà
khoa học Ba Lan và Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh có 52 hợp chất
Saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn
mới, lần đầu tiên được công bố. Khi so sánh với các nhóm sâm trồng có giá trị
trên thế giới như Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P. quinquefolius) và
Tam thất (P. notoginseng) thì thành phần saponin của Sâm ngọc linh rất giống
với 3 loài trên nhưng hàm lượng lại cao hơn rất nhiều. Điều này càng khẳng
định Sâm ngọc linh là một loài độc đáo về thành phần hóa học [17], là một
cây thuốc quý có giá trị sử dụng cao.
Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường cây thuốc xuất hiện một loại sâm
(đặc điểm hình thái gần giống Sâm ngọc linh) có nguồn gốc từ Lào, được làm
giả Sâm ngọc linh. Do mẫu vật chúng tôi thu được mới chỉ là mẫu lá và củ
nên chưa đủ cơ sở hình thái để chứng minh mối quan hệ của chúng với Sâm
ngọc linh, vì vậy, để phân tích mối quan hệ di truyền của loài sâm này với

Sâm ngọc linh của Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu “Phân tích
mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác trong chi Panax”

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

8

Khóa luận tốt nghiệp

Điểm mới của đề tài
đề tài của tôi nghiên cứu hoàn toàn mới chưa được công bố trong công
trình khoa học nào, đề tài được đăng trong hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa
học các trường sư phạm toàn quốc lần thứ VI.
Mục đích của đề tài
Đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền của cây sâm có nguồn gốc từ
Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam dựa trên phân tích trình tự gen ITS, từ đó
đánh giá mối quan hệ di truyền của chúng với một số loài sâm khác trên thế
giới.
Nội dung nghiên cứu
- Tách ADN tổng số của mẫu Sâm, nhân bản vùng gen ITS- rDNA
- Giải trình tự gen ITS – rDNA
- Phân tích số liệu: so sánh, phân tích các trình tự DNA của các mẫu
thu được và so với Panax vietnamsis ở Quảng Nam, và các loài
trong chi Panax.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học:
Góp phần bổ sung vốn kiến thức về đa dạng thực vật ở cấp độ phân tử,
chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo về loài Sâm lào.
Ý nghĩa thực tiễn:
Đánh giá sự sai khác về mặt di truyền giữa cây sâm có nguồn gốc từ
Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam.

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

9

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về chi Sâm (Panax)
Chi Nhâm sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì
(Araliaceae). Toàn bộ chi Sâm (Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11
loài và 1 dưới loài (thứ -var) [23]. Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới
cho thấy chúng chỉ xuất hiện ở bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ
biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2
loài P. quinquefolius và (P. trifoliatus) . Vùng Đông Bắc Á (gồm viễn đông
Nga, đông bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài P.
ginseng và P. japonica. Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây
Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực

này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt
Nam). Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới loài) mọc hoàn toàn tự nhiên. Hai
loài trồng là P. notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và P. pseudoginseng (không tìm
thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc
là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung
tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) của thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P.
notoginseng; P. quinquefolius và P. trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía
Nam của chi Panax L. là loài Sâm ngọc linh (Panax Vietnamensis) ở miền
trung của Việt Nam, tại 14015’ vĩ độ Bắc. Chính vì vậy Sâm ngọc linh được coi
là loài đặc hữu hẹp của miền trung Việt Nam [6].
Các loài Nhâm sâm nói chung có tính hàn, ưa khí hậu ôn hoà, mát mẻ,
sợ rét, sợ ánh nắng mặt trời mạnh chiếu trực tiếp, không ưa mưa nhiều và
nhiệt độ cao, sợ gió nóng. Nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng là 20 - 280C.
Candolle, 1830, Seemann 1868 mô tả Panax có cụm hoa tán, hoa nhỏ có năm
cánh, bộ nhụy có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

10

Khóa luận tốt nghiệp

- 5 hạt. Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tuỳ theo số
năm sinh trưởng [20]. Khái niệm này được chấp nhận bởi các công trình
nghiên cứu sau này (Wen và Zimmer, 1999; Choi và Wen, 2000) [34, 39].

Hình 1: Sâm Việt Nam - Panax vietnamensis
(nguồn: Wikipedia.org)
1.2 Sâm ngọc linh
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Sâm ngọc linh là cây thân thảo, sống nhiều năm. Thân rễ có đường kính
3.5cm, không có rễ phụ dầy dự trữ, đôi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có
củ gần hình cầu, đường kính đến 5cm. Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1- 4
thân. Thân cao từ 40cm - 100cm, rỗng, Lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5,
6). Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6,7) lá chét, lá dài 7 - 12cm (ít khi 15cm). Lá
chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 - 14cm, rộng 3 -

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

11

Khóa luận tốt nghiệp

5cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm,
mép lá có răng cưa nhỏ đều . Cụm hoa dài 25cm, gấp 1.5 - 2 lần chiều dài của
cuống lá, thường mang tán đơn độc. Tán hoa chính đường kính 2.5 - 4, có 50 120 hoa. Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4mm. Bầu 1 ô, 1 vòi
(chiếm 80%) đôi khi có hai ô, hai vòi (chiếm 20%). Quả khi chín màu đỏ,
thường có một chấm đen ở trên đỉnh quả. Quả một hạt hình thận, quả 2 hạt
hình cầu hơi dẹt dài 7 - 10 mm rộng 4 - 6 mm [12, 15] (Hình 2).
Sinh thái:

Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt
độ ban ngày từ 20 - 25oC, ban đêm 15 - 18oC, Sâm ngọc linh có thể sống rất
lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm.
Công dụng:
Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể
dùng lá và rễ con.
Sinh học:
Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông,
thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành. Từ tháng 4 đến tháng 6,
cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9.
Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại 1 vết sẹo ở đầu củ
sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo
trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao
nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có 1 sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ
rụng 1 lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 tuổi [18, 20]. Mùa đông
cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm.

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

12

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 2: Sâm ngọc linh (Chụp tại vƣờn Sâm Đăc-Tô, Nam Trà My,
tỉnh Quảng Nam)

1.2.2. Phân bố tự nhiên của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis)
Cho đến nay, Sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên Trung
phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có (và quan trọng nhất) là núi
Ngọc Linh. Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã
Mường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà Cang,
Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam).
Theo Hà Thị Dụng, cây sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang
Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm 1970 cũng là Sâm ngọc linh [13].
Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của nó thì Sâm ngọc linh đã
có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng thuộc 2 điểm phân bố (dãy
Ngọc Linh và Lang Biang). Cả 2 khối núi này đều có độ cao trên 1.500m.
Điểm phát hiện có Sâm ngọc linh mọc tự nhiên đều vào khoảng 1.800 2.200m [6, 24].

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

13

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị và thành phần hoá học của cây Sâm ngọc
linh
a. Tầm quan trọng và giá trị
Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài
của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm vi
của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như Nhâm sâm

(Panax ginseng); Giả Nhâm sâm (P. pseudoginseng); Tây Dương Sâm (P.
quiquefolius); Tam thất (P. notogiseng) và Sâm ngọc linh (P. vietnamensis Ha et
Grushv.). Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống Pháp (1952 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng Nam đã được
đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thần dược để phòng thân
những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn và
các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu vết thương [20, 24].
Theo quan điểm hóa phân loại và dược lý học, những công trình nghiên
cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chia 12 loài thuộc chi Panax thuộc
2 nhóm chính:
- Nhóm 1 gồm các loài hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: Nhâm sâm
(Panax ginseng), Sâm mỹ (P. quinquefolius) và Tam thất (P. notoginseng), có
bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển và chứa các Saponin
có khung thuộc nhóm dammaran.
- Nhóm 2 gồm các loài mọc hoang như P. japonicas, P. zingiberensis, P.
stipuleanatus với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển theo hướng nằm ngang,
chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [17].
Tuy nhiên, hàm lượng Saponin của Sâm ngọc linh so với các loài
Panax trồng trọt thuộc nhóm 1 lại cao hơn rất nhiều.
Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả,
đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

14

Khóa luận tốt nghiệp

có 52 hợp chất Saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu
trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố. Khi so sánh với nhóm sâm
trồng có giá tri trên thế giới như Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P.
quinquefolius) và Tam thất (P. notoginseng) thì thành phần saponin của Sâm
ngọc linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượng lại cao hơn nhiều
[16, 17].
b. Thành phần hóa học
Từ năm 1974 - 1990 Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu
Nhâm sâm việt nam, so sánh với Nhâm sâm Triều Tiên (Panax ginseng),
Nhâm sâm nhật bản (Panax japonicus) và Nhâm sâm hoa kỳ (Panax
quinquefollium) [17]. Kết quả có thể tóm tắt như sau:
Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong Panax
vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu sắc
tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng. Chi tiết hơn nữa trong
Panax vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane (7.58%),
trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ saponin
của axit oleanolic. Điều này trái với quy luật chung là thông thường các cây
nhâm sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin của axit
oleanolic và lượng nhóm saponin damarane [17].
Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được 1 lượng lớn
majonozit R2 và ocotillol saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai
chất này đã chiếm 4.34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol
saponin cao nhất có trong các loài chi Panax. Ocotillol saponin đã trở thành 1
hợp chất cần chú ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học cho các
cây Panax vì nó có thể ảnh hưởng đến một số tác dụng mang tính đặc thù của
Panax vietnamensis. Sự có mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn
làm cho Sâm Việt Nam khác với Nhâm sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

15

Khóa luận tốt nghiệp

chưa tìm thấy ocotillol trong Nhâm sâm triều tiên. Năm 1994, Nguyễn Minh
Đức còn chứng minh Nhâm sâm việt nam có hàm lượng saponin damarane
cao nhất (12 - 15%) so với Nhâm sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin
nhiều nhất (49%) so với 26% trong nhâm sâm triều tiên [10].
Ngoài những saponin nói trên, trong Nhâm sâm việt nam còn chứa các
polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng [15].
1.2.4 Hiện trạng của loài Sâm ngọc linh ở Việt Nam
Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có khoảng 5 loài,
trong đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (P.notogineng) và Nhâm sâm
(P.ginseng) [1]. Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là Sâm Vũ
Diệp (P.bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P.stipuleanatus Tsai et Feng)
và đặc biệt Sâm ngọc linh (P.vietnamensis Ha et Grushv.) là loài đặc hữu hẹp
của miền Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông,
huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), Huyện Nam Trà My, huyện Phước Sơn
(tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh độ cao trên 1500m. Tuy nhiên
hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên, do tình trạng khai thác
kiệt quệ trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng
tự nhiên bị thu hẹp. Hiện tại Sâm ngọc linh đã được đưa vào danh lục đỏ của
IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích

thương mại (nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006 về quản lý thực vật
rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo sách đỏ Việt Nam (2007), Sâm
ngọc linh được xếp vào hạng EN A1a, c, d, B1 + 2b, c, e [3]. Hiện nay Sâm
ngọc linh chỉ còn tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã Măng Ri,
huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh (xã Trà
Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng khoảng
10 hecta [18].

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

16

Khóa luận tốt nghiệp

1.3. Phương pháp phân loại học phân tử.
Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất trong việc xác định
mối quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự ADN, bởi vật liệu di truyền là
duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh
hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và
chế biến. ADN chiết từ lá và củ đều mang cùng thông tin di truyền. ADN
chiết thì ổn định và có thể giữ ở -200C trong thời gian dài (khoảng 3 - 5 năm),
do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích. Chỉ sử dụng một lượng
ít mẫu cũng có hiệu quả, đây là một thuận lợi trong việc phân tích mẫu có giới
hạn [2, 9,21].
1.4. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử

1.4.1 Thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử
Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang
được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hóa, phân loại và đa
dạng di truyền quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân
tích ADN. Các chỉ thị AFLP (đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại),
RFLP (đa hình các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các ADN Khuếch đại
ngẫu nhiên), SSR (trình tự các đoạn lặp đơn giản), cpSSR (trình tự lặp đơn
giản), gen mã hóa 18S - RNA,… hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di
truyền, nhận dạng các đoạn ADN hoặc các trình tự đặc trưng cho loài [23,
19]. Với số lượng bản sao lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật
PCR với các cặp mồi thích hợp.
Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (GenBank, 2007) đã lưu
dữ trên 70 triệu trình tự ADN với gần 90 tỷ nucleotit. Đây là nguồn dữ liệu có
giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là (1)
số liệu về trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị
bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2)

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

17

Khóa luận tốt nghiệp

số liệu trình tự nucleotit đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt
nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, trong nghiên cứu di truyền quần thể

(population genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa
các quần thể, giữa các cá thể, giữa cha mẹ và con cái …; (3) kết quả ADN cho
phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật
không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài,
các quần thể địa lý,…; (4) kết quả nghiên cứu ADN không bị ảnh hưởng vào
bất cứ yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra.
Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang
là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài
mới, giải quyết mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tình trạng
di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hóa của nhiều loài động thực vật
và vi sinh vật . Các kết quả nghiên cứu ở mức độ ADN đã và đang góp phần
đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai
thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt
Nam.
Trong nước: nhìn chung, các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ
công tác bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan
tâm và phát triển. Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã
từng bước tiếp cận. Tuy nhiên, nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN có
tính thống nhất cao mới được thực hiện tại Viện sinh Thái và Tài nguyên Sinh
vật cho một số loài động vật quý hiếm, còn với thực vật thì hầu như chưa có.
Hơn nữa trong thực tế, có nhiều loài tồn tại và phân bố biệt lập, nên chứa
đựng tính đa dạng nguồn gen rất lớn mà chưa được nghiên cứu.
Một số cơ sở nghiên cứu như Viện công nghệ sinh học, Viện sinh thái và
Tài nguyên sinh, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp,
Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,…đã thực hiện một số nghiên cứu về đa dạng

Lưu Thị Như

K35C - Sinh

Trường ĐHSP Hà Nội 2

18

Khóa luận tốt nghiệp

di truyền thực vật, trên các đối tượng cây trồng (cây lạc, lúa, một số loài hoa
lan…) [13, 14, 23] cây rừng (họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh, Giổi…) [8, 22]...
nhưng các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền
quần thể phục vụ cho nghiên cứu bảo tồn, tiến hóa và tái tạo nguồn gen.
Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng
di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được
nhiều kết quả có giá trị. Nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải đã thực hiện
trên gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định ADN một số
loài lan Hài, đã phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng [14]. Hay nhóm tác
giả của đặng Tất Thế (2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân
tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của một số loài thú, bó sát
quý hiếm của Việt Nam [27]. Nguyễn Thúy Hạnh (2006) [13]. Hay nhóm tác
giả của Nguyễn Minh Tâm đã dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng
nguồn gen cây vạn tuế của Việt Nam làm cơ sở cho công tác di truyền [22].
Tuy nhiên, nghiên cứu các ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp
phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn ít.
1.4.2. Các bước trong phương pháp phân loại hiện đại
1.4.2.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Retion) được Karry Mullis và cộng
sự mô tả lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách mạng
trong sinh học phân tử. Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một
đoạn ADN nào đó mà chỉ cần lượng mẫu ban đầu rất hạn chế (cỡ 10 -3μg). Kỹ
thuật này có độ nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh

học phân tử, chuẩn đoán bệnh, trong di truyền quần thể và phân tích pháp lý
[29].
Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR rất hữu hiệu cho việc nhân
bản số lượng lớn các đoạn ADN, có thể sử dụng PCR để tách dòng đặc hiệu,

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

19

Khóa luận tốt nghiệp

giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích gen từ các tế bào riêng lẻ, giúp
nghiên cứu quá trình tiến hóa ở mức độ phân tử. Thậm chí giúp phục hồi
những gen đã tồn tại cách đây hành chục triệu năm [30].
1.4.2.2. Đọc trình tự nucleotide
Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương pháp
Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain - determination
method) là một phương pháp xác định trình tự ADN được Fredermination
Sanger phát triển vào năm 1975 [39].
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của
enzyme ADN - polymerase trong quá trình tổng hợp ADN. Enzim ADN polymerase xúc tác quá trình gắn các nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng
hợp ở vị trí 3’có chứa nhóm-OH tự do, khi gặp nucleotit không có nhóm -OH
ở vị trí 3’thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp là sử
dụng các loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN một
các ngẫu nhiên. Trong phản ứng sử dụng mồi tổng hợp là đoạn ADN mạch

đơn có kích thước khoảng 20 nucleotit.
1.4.2.3. Phân tích mối quan hệ di truyền
Mỗi quan hệ di truyền của các loài được thể hiện bằng cây phát sinh
chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, được xây
dựng dựa trên sự giống và khác nhau các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ
thể. Trong các nghiên cứu phân tử là sự giống và khác nhau về cấu trúc ADN
giữa các loài. Các taxon được nối với nhau trên cây thể hiện mối quan hệ di
truyền. Trên cây có rễ mỗi nút bên trong cây đại diện cho một loài tổ tiên
chung. Giả định nút gần nhất với rễ là loài khởi điểm, các nút còn lại được tỏa
ra từ nút này được gọi là con cháu. Mỗi một nút được gọi là đơn vị phân loại,
các nút trong cây được gọi là các đơn vị phân loại giả thiết. Độ dài của cành
cây mô phỏng thời gian tiến hóa. Cây không rễ là cây không có điểm khởi

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

20

Khóa luận tốt nghiệp

đầu, do đó nó không tái dựng lịch sử tiến hóa của các loài. Cây không rễ chỉ
cho biết mối quan hệ họ hàng giữa các loài hiện tại. Có 4 phương pháp tạo
cây bao gồm: (1) phương pháp Neighbor - Joining (NJ), (2) phương pháp
Minimum Evolution, (3) phương pháp Maximum Parsimony . Khoảng cách di
truyền giữa các loài cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây [37,
38].

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

21

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
- Mẫu lá và củ của Sâm thu được ở Lào (tạm gọi là Sâm lào – Panax sp.)
(Mẫu Sâm lào do viện Dược liệu trung ương cung cấp. (hình 3).
- Mẫu Sâm ngọc linh thu tại vườn trồng sâm Đak-Tô, huyện Nam Trà My, Tỉnh
Quảng Nam

Hình 3. Lá và củ Sâm lào (Mẫu do Viện dƣợc liệu TW cung cấp)

Hình 4. Mẫu Sâm ngọc linh (vƣờn Sâm Đăk-tô, Nam Trà My, Quảng Nam)

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

22

Khóa luận tốt nghiệp

2.2 Nơi thực hiện nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Di
truyền bảo tồn, viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam
2.3 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 6/2011- 5/2013
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Tách ADN tổng số
Mẫu lá (củ) củ tươi được nghiền trong nitơ lỏng (-196oC) thành dạng bột
mịn. Khoảng 100mg bột nghiền được dùng để tách ADN, sử dụng Dneasy
plant mini kit (Qiagen, Đức).
Phương pháp chiết tách ADN gồm ba bước chính:
 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng các tác nhân vật lý hay hoá học
hoặc kết hợp nhiều tác nhân, giải phóng ADN ra môi trường.
 Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipid,
polysaccharide…). Thường dùng hỗn hợp phenol – chloroform - isoamyl
alcohol (25:24:1) làm biến tính protein, sau đó ly tâm: protein biến tính sẽ tủa
thành một lớp nằm giữa pha nước chứa axit nucleic và pha phenol chloroform, thu nhận lại pha nước chứa axit nucleic.
 Bước 3: Kết tủa axit nucleic. Thường dùng cồn ethanol thể tích 2.5:1 và trong
môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao) hoặc dùng isopropanol thể tích
1:1. Thu ADN bằng li tâm, sau đó hoà trong nước khử ion hoặc dung dịch
đệm.
2.4.2 Phát hiện ADN bằng phương pháp điện di trên gel agarose
Phương pháp này được áp dụng cả trong phân tích định tính lẫn trong
việc thu nhận mẫu axit nucleic.

Nguyên tắc phương pháp dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic.

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

23

Khóa luận tốt nghiệp

Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác
động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về hướng cực dương. Sự di
chuyển nhanh hay chậm tuỳ thuộc vào hình dạng và tỉ số điện tích - khối
lượng, nhờ đó các chất khác nhau sẽ được tách ra thành từng vết riêng và
được phát hiện bằng nhiều cách khác nhau .
Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%:
- Cân 0,4g Agarose, pha với 40ml với đệm TAE 1 lần, đun trong lò vi sóng
khoảng 1 phút cho tới khi agarose hoàn toàn tan trong đệm
- Để dung dịch gel Agarose nguội đến 60oC, bổ sung 4μl Ethydium Bromide
(EB). Đổ dung dịch gel agarose vào bể điện di, cài lược tạo giếng, để khoảng

30 phút cho gel đông.
- Dùng pipet hút trộn mẫu với giọt loading dye (màu chạy điện di) rồi cho vào
các giếng tương ứng.
- Bật máy điện di cài đặt thời gian 20 phút, 120 V.
- Đặt gel lên đèn UV, quan sát vạch sáng.
2.4.3 Kỹ thuật PCR

Nhân bản vùng gen ITS - rADN bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc
hiệu (thiết kế trên cơ sở trình tự ITS - rADN của các loài trong chi Panax trên
Genbank).
- Mồi xuôi PaITS-F: 5’- CAC TGA ACC TTA TAC TTT TGAG - 3’.
- Mồi ngược: PaITS-R: 5’- CTT ATT GAT ATG CTT AAA CTC AG - 3’.
Chu trình phản ứng PCR được chạy trong tổng thể tích 50µl gồm 32µl
H2O, 5 µl đệm, 5 µl dNTP, 3 µl mồi xuôi F (30 pM), 3 µl mồi ngược R (30
pM), 1 µl ADN tổng số, 1 µl enzyme Tag polymerase.
Chương trình chạy PCR được tiến hành theo chu kỳ nhiệt: 3 phút ở
950C, 30 chu kỳ (50 giây 95 0C, 1 phút 55 0C, 1 phút 72 0C) và sau đó là 1 chu
kỳ ở 72 0C trong 5 phút.

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

24

Khóa luận tốt nghiệp

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agrarose 1% và tinh sạch
bằng Qiaquick gel extranction kit (Qiagen,Đức).
2.4.4. Đọc trình tự
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản
ứng giải trình tự trực tiếp với mồi PaITS - F, sử dụng Bigdye terminator
cycler và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer
(Applied Biosystems.Mỹ).

2.4.5. Phân tích số liệu
Trình tự ADN của 2 loài Sâm lào và Sâm ngọc linh được so sánh, phân
tích với 7 loài khác thuộc chi Panax và 1 loài ngoài nhóm (Aralia foliolosa)
được dùng làm tham chiếu (Bảng 3) sử dụng phần mềm Clustal W và MEGA
5.1
Bảng 1. Danh sách các trình tự sử dụng trong nghiên cứu
Tên khoa học

Mã hiệu Genbank

1

Panax quinquefolius

AY233328

2

Panax japonicus

FJ980423

3

Panax japonicus var bipinnatifidus

AY271921

4

Panax notoginseng

JX680329

5

Panax pseudoginseng var bipinnatifidus

AY271923

6

Panax stipuleanatus

U41690

7

Panax variabilis

AY233329

8

Aralia foliolosa

DQ007383

Lưu Thị Như

K35C - Sinh


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

25

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Chúng tôi đã tiến hành giải mã 1 đoạn gen ITS của Sâm lào và Sâm
ngọc linh, so sánh một số loài khác trong chi Panax để làm rõ vị trí phân loại
của Sâm lào nói riêng cũng như mối quan hệ di truyền Sâm lào với Sâm ngọc
linh.
3.1 Kết quả tách ADN tổng số
Mẫu lá và củ của Sâm lào và Sâm ngọc linh được nghiền trong nitơ lỏng
(-196oC) thành dạng bột mịn. Khoảng 100mg bột nghiền được dùng để tách
ADN tổng số, sử dụng Dneasy plant mini kit (Qiagen, Đức). Kết quả sau đó
được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1% (Hình 5)

1

2

3

4

Hình 5 Điện di tổng số ADN trên gel Agarose 1%
Giếng 1

ADN tổng số từ Lá Sâm ngọc linh

Giếng 2

ADN tổng số từ Củ Sâm ngọc linh

Giếng 3

ADN tổng số từ Lá Sâm lào

Giếng 4

ADN tổng số từ củ Sâm lào

Ảnh điện di cho thấy đều có ADN xuất hiện ở tất cả các mẫu, tuy nhiên
ở các giếng số 1 (mẫu lá Sâm ngọc linh), 2 (củ Sâm ngọc linh), 3 (lá Sâm lào)
thì có vạch sang rõ nét hơn, giếng số 4 (mẫu củ Sâm lào) vạch mờ, chứng tỏ
ADN tách từ củ Sâm lào có chất lượng không tốt bằng 3 mẫu còn lại.

Lưu Thị Như

K35C - Sinh