Phản ứng của đậu tương DT 2008 nảy mầm trong điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
***********

KIM THỊ DUYÊN

PHẢN ỨNG CỦA ĐẬU TƯƠNG DT 2008
NẢY MẦM TRONG ĐIỀU KIỆN
ÁP SUẤT THẨM THẤU KHÁC NHAU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học
PGS. TS. NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI – 2011


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính
trọng sâu sắc tới thầy giáo PGS. TS. Nguyễn Văn Mã đã tận tình hướng dẫn
và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Khoa Sinh – KTNN và Trung
tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ - Trường
ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em thực hiện đề tài này.
Lần đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, đề tài của em không
tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến
của các thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn.

Hà Nội, tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Kim Thị Duyên

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi đã thực hiện đề tài: “Phản ứng của đậu tương DT 2008 nảy mầm
trong điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau”.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả
nghiên cứu của đề tài này đảm bảo tính chính xác, khách quan, trung thực,
không trùng lặp với các tác giả khác.

Hà Nội, tháng 5 năm 2011
Sinh viên

Kim Thị Duyên

iii


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

atm

: Atmosphere

ABA

: Axit absisic

cDNA

: Complementary DNA (DNA bổ sung)

ĐC

: Đối chứng

ĐV

: Đơn vị

HSP

: Heat shock protein

Nxb

: Nhà xuất bản

Ptt

: Áp suất thẩm thấu

P5CS

: Pyrolin - 5 - cacboxylate – synthetase

STT

: Số thứ tự

TN

: Thí nghiệm

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tỉ lệ nảy mầm của đậu tương
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khối lượng tươi
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khối lượng khô
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng thân mầm
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng rễ mầm
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim proteaza
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim α - amilaza
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim lipaza
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hàm lượng axit amin prolin

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tỉ lệ nảy mầm của đậu tương
Hình 3.2: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khối lượng tươi
Hình 3.3: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khối lượng khô
Hình 3.4: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng thân mầm

Hình 3.5: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng rễ mầm
Hình 3.6: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim proteaza
Hình 3.7: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim α - amilaza
Hình 3.8: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim lipaza
Hình 3.9: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ axit amin prolin

v


MỤC LỤC

Trang

Mở đầu

1. Lí do chọn đề tài ...................................................................................... 1
2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu............................................................. 2
2.1. Mục tiêu ............................................................................................... 2
2.2. Nhiệm vụ.............................................................................................. 2
3. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn....................................................................... 3
CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÍ LUẬN CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1 Sự nảy mầm của hạt đậu tương............................................................. 4
1.2 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu và sự thiếu nước đến đậu tương
trong giai đoạn nảy mầm .............................................................................. 6
1.3 Đặc điểm một số enzim và axit amin prolin trong hạt đậu tương
nảy mầm....................................................................................................... 7
1.4 Tình hình nghiên cứu về ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu môi
trường đối với thực vật nói chung và đậu tương nói riêng ............................ 9
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................... 12

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 12
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương và sự sinh trưởng mầm của
đậu tương ................................................................................................... 18
3.2 . Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ một số enzim và
hàm lượng prolin của mầm đậu tương ........................................................ 24
KẾT LUẬN............................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 33

vi


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài.
Trải qua suốt quá trình lịch sử, loài người đã sử dụng khoảng 3000 loài
thực vật để làm lương thực và tối thiểu cũng tới 150 loài thực vật đã trở thành
hàng hóa trong đó tập trung vào 30 loại cây trồng. Những loài này được xem
là “bức tường ngăn cách” loài người với sự nghèo đói. Trong đó không thể
không kể đến đậu tương.
Cây đậu tương (Glycine max L.Merrill) là loài cây thuộc họ Đậu
(Fabaceae). Cây đậu tương có nguồn gốc Châu Á và được trồng cách đây
5000 năm. Trong hạt đậu tương hàm lượng protein chiếm 40% đây là nguồn
protein thực vật vô cùng quan trọng; hàm lượng lipit 12 – 25%, hàm lượng
gluxit 10 - 15%; các muối khoáng Ca, Mg, Fe, P, K, Na, S; các loại vitamin
A, B, D, E, F; các enzim, sáp, nhựa. Trong đậu tương có đủ các loại axit
amin cơ bản: xistin, metionin, lizin, tryptophan, valin … [6], [10].
Đậu tương là nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành sản xuất
công nghiệp nhất là công nghiệp thực phẩm phục vụ trực tiếp cho nhu cầu
của con người. Hạt đậu tương là sự kết hợp độc đáo các đặc tính làm cho
chúng trở thành loại thực phẩm đa năng nhất trong các loại thực phẩm. Sản

phẩm hạt đậu tương được sử dụng trực tiếp dạng hạt thô hay dùng để chế
biến thành các sản phẩm khác như: sữa đậu nành, bánh kẹo, đậu phụ. Ngoài
ra, đậu tương còn được dùng trong sản xuất dược liệu với nhiều vị thuốc có
giá trị ở nước ta.
Một trong những yếu tố ngoại cảnh gây ra sự thiếu hụt nước trong cây
là do sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối cao. Việc tích lũy và
duy trì hàm lượng cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sức cạnh
tranh nước với môi trường nhiễm muối, chống lại hiện tượng hạn sinh lí là
một dạng phản ứng thích nghi của thực vật [3].

1


Việc phát triển cây đậu tương là việc làm có ý nghĩa trên các mặt kinh tế,
nhân văn, môi trường đồng thời là yếu tố đảm bảo an ninh lương thực và góp
phần phát triển bền vững đất nước. Để tăng năng suất đậu tương một trong
các biện pháp là làm tăng khả năng chống chịu của chúng với ngoại cảnh
bằng cải tiến kĩ thuật, chọn giống mới hoặc lựa chọn những nơi trồng có điều
kiện ngoại cảnh thích hợp. Vì vậy cần tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu
phản ứng của đậu tương nảy mầm trong các điều kiện áp suất thẩm thấu khác
nhau để tìm được giới hạn của đậu tương và điều kiện mà cây sinh trưởng tốt
nhất. Cây ở những giai đoạn khác nhau cũng có những phản ứng với sự thiếu
nước khác nhau, đặc biệt giai đoạn nảy mầm rất mẫn cảm với sự thiếu nước.
Giai đoạn nảy mầm là thời điểm quan trọng trong chu trình sống của thực vật
nói chung và của đậu tương nói riêng. Những biến đổi của giai đoạn này sẽ
ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây về sau, xuất
phát từ vấn đề này tôi nghiên cứu đề tài: “Phản ứng của đậu tương DT
2008 nảy mầm trong điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau”.
2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1. Mục tiêu

Xác định chỉ tiêu sinh trưởng, hoạt độ một số enzim, hàm lượng prolin
của hạt đậu tương nảy mầm ở các áp suất thẩm thấu khác nhau.
2.2. Nhiệm vụ
- Xác định một số chỉ tiêu sinh trưởng như: tỉ lệ nảy mầm, khối lượng
tươi, khối lượng khô, chiều dài thân mầm, rễ mầm trong các điều kiện áp
suất thẩm thấu khác nhau.
- Xác định hoạt độ của các enzim: proteaza, lipaza, α - amilaza; hàm
lượng prolin trong mầm đậu tương ở các điều kiện áp suất thẩm thấu khác
nhau.

2


3. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn
Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung nguồn tài liệu cho việc nghiên
cứu khả năng chống chịu của đậu tương đối với các điều kiện môi trường bất
lợi và áp dụng cho việc trồng đậu tương trên đất nhiễm mặn. Trên cơ sở đó
lựa chọn và định hướng gieo trồng trong những vùng sinh thái thích hợp.

3


CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÍ LUẬN CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Sự nảy mầm của hạt đậu tương
Khả năng nảy mầm của hạt giống là một trong những chỉ tiêu quan
trọng để đánh giá tiêu chuẩn của một giống tốt. Đối với các loại cây trồng
nói chung và cây đậu tương nói riêng, nảy mầm là giai đoạn khởi đầu của
quá trình sinh trưởng, thời kì nảy mầm được tính từ khi gieo hạt đến khi xuất
hiện mầm trên mặt đất. Khi nảy mầm trong hạt xảy ra hàng loạt các quá trình

biến đổi sinh lý, sinh hóa một cách phức tạp.
Tỉ lệ nảy mầm cao hay thấp, thời gian nảy mầm nhanh hay chậm đều
có liên quan tới tốc độ sinh trưởng của giống và sự đồng đều của các giống
cây trong quần thể. Do vậy, giống nào có tỉ lệ nảy mầm cao, thời gian nảy
mầm nhanh sẽ rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của cây sau này.
Những giống có tỉ lệ nảy mầm thấp sẽ không đảm bảo mật độ, thời gian nảy
kéo dài sẽ làm cho cây sinh trưởng kém ngay từ đầu, từ đó ảnh hưởng
nghiêm trọng đến năng suất. Tỉ lệ và thời gian nảy mầm không chỉ do bản
chất di truyền của giống mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm. Đối với đậu
tương ở nhiệt độ 27 – 28oC, hạt đậu tương nảy mầm thuận lợi hơn, tốc độ
nảy mầm cũng nhanh hơn.
Đậu tương là một loại cây trồng rất đa dạng. Để giám định giống đậu
tương các nhà chọn tạo giống căn cứ vào đặc tính sinh vật học và nhiều đặc
điểm về hình thái để phân loại các giống đậu tương khác nhau. Dựa vào đặc
điểm thực vật học, các nhà khoa học có thể xác định được khả năng chống
chịu sâu bệnh, điều kiện ngoại cảnh bất lợi cho năng suất của các giống đậu
tương.
Quá trình nảy mầm diễn ra nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa trong hạt
với tốc độ cao để chuẩn bị cho sự hình thành một cây non mới. Đậu tương

4


thuộc cây hai lá mầm nên sự nảy mầm của đậu tương cũng gồm các pha như
sự nảy mầm của cây hai lá mầm. Pha trương hạt: khi bắt đầu nảy mầm hạt
hút nước rất mạnh làm trương hạt. Pha hình thành và hoạt hóa enzim: trong
hạt có một lượng enzim nhất định nhưng chủ yếu ở dạng liên kết. Khi hạt hút
nước enzim mới được giải phóng ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh.
Pha tích lũy chất dinh dưỡng: ngay trong những phút ngâm trong nước đầu
tiên độ hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt chu trình hexozomonophotphat

tăng lên nhiều lần do vậy lượng ATP tích lũy nhiều. Pha động viên các chất
dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc biệt cho cơ thể ở giai đoạn nảy
mầm: các chất dinh dưỡng trong hạt chúng thuộc 3 nhóm chất hữu cơ là:
gluxit, protein, lipit. Trong quá trình này enzim α - amilaza tác động vào liên
kết 1,4 - glucozit phân giải tinh bột trong các dextrin tham gia vào quá trình
hô hấp ở các dạng sacacrozo tích lũy ở các tế bào trụ phôi. Protein được phân
giải bởi enzim proteaza thành các amit. Phần lớn các axit amin tạo thành được
vận chuyển vào để tổng hợp các phân tử protein đặc trưng cho cơ thể [5].
Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thụ nước nhờ cơ chế hút trương của hạt
làm hạt trương lên. Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ hạt bắt đầu tăng tính thủy
hóa của keo nguyên sinh chất, giảm tính ưa mỡ và độ nhớt của keo dẫn đến
biến đổi sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đổi chất của hạt liên quan
đến sự nảy mầm. Đặc trưng nhất là tăng mạnh mẽ hoạt tính enzim thủy phân
phân hủy polisaccarit, protein và các chất phức tạp khác thành các chất đơn
giản dẫn đến sự thay đổi hoạt động thẩm thấu. Các sản phẩm thủy phân này
làm nguyên liệu cho quá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ ở phôi hạt, vừa làm
tăng áp suất thẩm thấu trong hạt giúp cho quá trình hút nước vào hạt nhanh
chóng.
Sự tăng hoạt tính enzim dẫn đến sự biến đổi các chất dự trữ và mức độ
hoạt hóa các enzim riêng biệt phụ thuộc vào tính chất đặc trưng và thành

5


phần hóa học của hạt. Đối với đậu tương, hạt dự trữ chủ yếu là protein thì
hoạt tính enzim proteaza tăng lên mạnh mẽ hơn các enzim khác.
1.2. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng của thực vật.
Nước là điều kiện quan trọng cho sự nảy mầm. Nước tham gia vào quá
trình trao đổi chất, các phản ứng sinh hóa trong tế bào, là nguồn nguyên liệu
của nhiều phản ứng. Nước đảm bảo cho cây sinh trưởng và phát triển.

Áp suất thẩm thấu là lực gây ra sự chuyển dịch của dung môi vào tế
bào qua màng sinh chất. Áp suất thẩm thấu không phụ thuộc vào bản chất
của chất tan mà phụ thuộc vào nồng độ phân tử chất tan, nhiệt độ, sự phân li
của dung dịch. Áp suất thẩm thấu bao gồm áp suất thẩm thấu bên trong (áp
suất thẩm thấu nội bào) và áp suất thẩm thấu bên ngoài (áp suất thẩm thấu
môi trường).
Áp suất thẩm thấu bên trong: dịch tế bào có chứa hàm lượng lớn các
chất hữu cơ là sản phẩm của quá trình trao đổi chất. Các chất này trong dịch
tế bào đã tạo nên áp suất thẩm thấu cao giúp cho quá trình xâm nhập của
nước và trong tế bào bằng con đường thẩm thấu.
Áp suất thẩm thấu bên ngoài: chủ yếu do các muối của môi trường
gây nên. Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lượng muối cao đặc biệt là NaCl, điều
đó hạn chế khả năng hút nước dẫn đến khó khăn trong việc hút chất dinh
dưỡng của cây. Nếu cây sinh trưởng trong môi trường không có muối thì
nước sẽ dễ dàng thấm qua màng bán thấm để đi vào tế bào chất nhờ hiện
tượng thẩm thấu của màng. Đất bị nhiễm mặn sẽ gây nên hai tác hại đối với
thực vật. Tác hại thứ nhất gây ra hiện tượng hạn sinh lí, hàm lượng muối
trong đất làm cho áp suất thẩm thấu môi trường lớn. Nếu áp suất tế bào
không thắng nổi áp suất của môi trường cây sẽ bị khô héo do tế bào không
hút được nước. Thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo chất
nguyên sinh làm tăng sự già hóa của tế bào. Tác hại thứ hai, liên quan đến

6


tính gây độc của các ion đối với thực vật. Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lượng
cao các ion, đặc biệt Na+ và Cl-, ngoài ra còn có các ion khác: SO42-, Li+, hàm
lượng cao ion này đều gây hại cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Thực vật nói chung và đậu tương nói riêng sống trong điều kiện thiếu
nước đều có khả năng chống lại hoặc hạn chế sự mất nước bằng những biến

đổi hình thái hoặc những phản ứng hóa sinh phù hợp.
Sự thiếu nước ở thực vật chủ yếu do hạn hán và áp suất thẩm thấu môi
trường gây nên. Khi thiếu nước thường làm cho tế bào mất sức căng, đỉnh
sinh trưởng bị héo và các quá trình sinh lí diễn ra không bình thường, hoạt
động của enzim thủy phân thường diễn ra nhanh hơn là enzim tổng hợp dẫn
đến tế bào mất chất dinh dưỡng, đồng thời cũng gây ảnh hưởng trầm trọng
đến quá trình hô hấp. Khi thiếu nước cường độ hô hấp tăng nhưng hiệu quả
năng lượng bị giảm sút. Thiếu nước gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và
phát triển của cây, cuối cùng ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất của
chúng.
Về khả năng chịu mặn của thực vật, trước hết phải nói đến cơ chế tích
lũy và duy trì nồng độ cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sự
cạnh tranh nước với môi trường nhiễm muối và chống lại hiện tượng hạn
sinh lý. Hàm lượng NaCl cao trong đất nhiễm mặn làm các loài thực vật sống
thường xuyên trên đất này phải có khả năng thu nhận và tích trữ Na+, Cl- cao
hơn nhiều thực vật vốn có khả năng chịu mặn, đồng thời phải có những thay
đổi về hoạt động sinh lí như: hô hấp, quang hợp, thoát hơi nước của lá cho
phù hợp với điều kiện thiếu nước của cây.
1.3. Đặc điểm một số enzim và axit amin prolin trong hạt nảy mầm
1.3.1. Đặc điểm một số enzim
Trong hạt đậu tương đang nảy mầm diễn ra quá trình phân giải các
chất hữu cơ cung cấp năng lượng và nguyên liệu cho cây sinh trưởng và phát

7


triển. Enzim hoạt động chủ yếu trong giai đoạn này là enzim xúc tác cho các
phản ứng thủy phân như: proteaza, lipaza, α – amilaza …
Proteaza: xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptit. Khi hạt nảy mầm
protein bắt đầu được phân giải thành axit amin dưới tác dụng enzim

proteaza. Các axit amin là nguồn nguyên liệu cho quá trình tổng hợp các chất
đồng thời góp phần tăng áp suất thẩm thấu tế bào thực vật. Proteaza tham gia
trong nhiều hoạt động sống quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong y học
và nhiều ngành công ngiệp khác.
Lipaza: xúc tác phản ứng thủy phân triaxilglixerol tạo thành các axit
béo tự do và glixerol. Lipaza xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên
kết este trong phân tử chứ không cắt đứt cả 3 liên kết este cùng 1 lúc. Axit
béo và glixerol là nguyên liệu cho hô hấp giải phóng năng lượng và kiến tạo
thành phần của tế bào.
α - amilaza: phân giải liên kết 1,4 - glucozit ở giữa chuỗi mạch
polisaccarit tạo các dextrin phân tử thấp. Dưới tác dụng của enzim này dung
dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với dung dịch iot và bị
giảm độ nhớt mạnh. Do đó để xác định hoạt độ của enzim α - amilaza người ta
thường dựa vào sự biến đổi màu của iot khi cho tác dụng với enzim này [9].
1.3.2. Đặc điểm axit amin prolin
Sống trong điều kiện hạn do stress muối gây ra, thực vật có khả năng
chịu hạn nhờ hai cơ chế : tránh mất nước và chịu mất nước. Cơ chế tránh mất
nước biểu hiện qua sự thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi
nhằm giảm sự mất nước hoặc việc tích lũy các chất hòa tan như protein, axit
amin…để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào. Cơ chế chịu mất nước thể
hiện qua việc nhanh chóng sinh tổng hợp các chất để bảo vệ, điều chỉnh áp
suất thẩm thấu trong tế bào như ABA (axit absisic), axit amin prolin …

8


Prolin là axit amin ưa nước trong cơ thể thực vật, được tổng hợp từ
glutamin bởi enzim cảm ứng stress P5CS. Prolin là thành phần chủ yếu trong
cấu trúc của nhóm các chất amoni bậc 4 và có vai trò quan trọng trong việc
điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào thực vật. Vì thế, việc nghiên cứu

hàm lượng prolin trong quá trình sinh trưởng của hạt đậu tương khi nảy mầm
có thể giúp chúng ta tìm hiểu sâu hơn sự điều tiết quá trình trao đổi nước
trong tế bào thực vật và khả năng của chúng chống lại sự thiếu hụt nước.
Axit amin prolin được tổng hợp từ glutamin bởi enzim chìa khóa
pyrolin - 5 - cacboxylate - synthetase (P5CS). Prolin hay α - pirolidin
cacboxylic có công thức trong phân tử một mạch bên chính là một hydro cacbua, một vòng pirolidin được tạo thành do sự kết hợp giữa nhóm amin
bậc một và Cα. Do đó, prolin có chứa nhóm amin bậc hai và được gọi là
imino axit [9].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng prolin đóng vai trò là nhân tố chính
bảo vệ màng tế bào, chống lại các tác động có hại của nồng độ muối cao, làm
tăng thế năng thẩm thấu của tế bào. Sự tập trung prolin để phản ứng lại stress
muối diễn ra chủ yếu trong dịch bào. Prolin cũng có thể có chức năng như
protein thẩm thấu ưa nước và như một gốc hydroxyl. Do đó, sự tích lũy
prolin được coi là một phản ứng thích nghi thông thường của thực vật bậc
cao trong điều kiện khô hạn. Prolin được xem như một chất chỉ thị về khả
năng chịu hạn của thực vật và còn là chỉ số tốt của thực vật có khả năng chịu
mặn [3].
1.4. Tình hình nghiên cứu về ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu môi
trường đối với thực vật nói chung và đậu tương nói riêng
1.4.1. Trên thế giới
Trên thế giới với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật, đã có
nhiều công trình nghiên cứu về tính chống chịu của thực vật như các nghiên

9


cứu của các tác giả: Bates L.S (1973) [14], Bamet N.M, Naylor A.W (1996)
[17], Goyal K, LJ Walton (2005) [19], Ingram J, D. Bartel (1996) [21],
Thomashow MI (1998) [27], Xiao B, Y Huang, N Tang (2007) [30], Zhao và
cộng sự (2000) [31]… nghiên cứu về tính chịu hạn, chịu mặn và chịu lạnh ở

lúa, lúa mì và thực vật nói chung.
Đã có nhiều công trình nghiên ở nước ngoài trên các đối tượng thực
vật và cây trồng khác nhau, nhằm tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyển hóa
prolin,….liên quan đến vai trò của prolin đối với tính chịu hạn của thực vật.
Trong dòng tế bào thuốc lá được nuôi cấy thích nghi với nồng độ 428 mM
NaCl, prolin chiếm 80 % axit amin tự do (Rhodes và Handa, 1989) [25].
Người ta thừa nhận rằng có sự phân bố đồng đều prolin trong toàn bộ thể tích
nước của nội bào, kết quả được xác định axit amin tại thời điểm này vượt
quá 129 mM. Sự tích lũy prolin nội bào ở các tế bào Distichlis spicata trong
điều kiện stress muối (xử lí ở nồng độ 200 mM NaCl) ước tính trên 230 mM
(Ketchum et al, 1991) [22]. Cũng trên đối tượng cay thuốc lá, tác giả Kishor
P.B.K và cộng sự (1995) [23] nghiên cứu cây thuốc lá được chuyển gen (gen
liên quan đến sinh tổng hợp prolin – P5CS) trong điều kiện hạn nước, hạn
muối. Kết quả cho thấy hàm lượng prolin gấp khoảng từ 10 - 18 lần so với
đối chứng. Thực vật được chuyển gen (gen P5CS) cũng được nghiên cứu
trên đối tượng là cây đậu tương (J.A.de Ronde; R.N. Laurie ; T.Caetano;
M.M Greyling; I.Kerepesi 2004) [16]. Các tác giả tiến hành so sánh giữa
dòng đậu tương chuyển gen P5CS và dòng đậu tương không được chuyển
gen cho thấy: dòng đậu tương chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn.
Về đậu tương có một số tác giả nghiên cứu như: Whitsitt và cộng sự
(1997) [29] đã cho thấy lượng nước mất trên 60% thì đậu tương không thể
phục hồi được. Những nghiên cứu của Matra N, Cushman J, C (1994) [24]…
đã nhận thấy rằng cDNA (complementary DNA) của dehidrin từ lá đậu

10


tương mất nước bị phân lập, dehidrin là một trong những LEA với chức năng
bảo vệ tế bào khi mất nước. Sheila A.Blackman và cộng sự (1992) [26] đã
nghiên cứu protein sốc nhiệt (HSP – heat shock protein) trong phôi mầm hạt

đậu tương đang chín ở điều kiện bình thường và dưới áp suất thẩm thấu cao.
Kết quả nghiên cứu đã khẳng định HSP tăng lên trong quá trình hình thành
hạt và giảm khi hạt nảy mầm. HSP hỗ trợ bảo vệ tế bào vào thời điểm
oligosacarit chưa được tổng hợp để hỗ trợ tế bào thực hiện chức năng.
1.4.2. Ở Việt Nam
Nghiên cứu tính chống chịu của cây trồng ở Việt Nam được trồng trên
diện rộng ở các đối tượng lúa, đậu tương, lạc, thuốc lá…trong đó đậu tương
là cây trồng được chú trọng khá lớn về đặc điểm di truyền và khả năng chịu
hạn ở cây, khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương (Nguyễn Văn Mã,
Nguyễn Văn Đính, Hoàng Thị Thùy Dương, Nguyễn Thị Hồng Thắm) [7],
sự biến đổi của hoạt độ enzim proteaza, amilaza và hàm lượng prolin của cây
đậu tương khi gặp hạn ở thời kì ra hoa (Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn
Văn Mã) [12] … Các kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất
và chọn tạo được nghiều giống đậu tương mới có năng suất cao, phẩm chất
tốt phù hợp với điều kiện khí hậu và canh tác của Việt Nam.
Tại Trung tâm Nghiên cứu và thực nghiệm đậu đỗ, Viện Khoa học kĩ
thuật Nông nghiệp Việt Nam, nhiều giống đậu tương nhập nội và giống địa
phương đã được đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng bằng một số biện
pháp hạt nảy mầm trong dung dịch đường sacarozo, phương pháp dùng nhiệt
cao… Kết quả trên 1000 mẫu giống nhập nội đã phân lập được 185 mẫu có
khả năng chịu hạn trồng vụ đông, 68 mẫu giống chịu hạn tổng hợp, 14 mẫu
giống vừa chịu nóng chịu hạn tốt và có nhiều đặc tính kinh tế quan trọng
khác [4].

11


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây đậu tương thuộc giống DT 2008 do Viện
Di truyền Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.
Theo PGS. TS. Mai Quang Vinh cho biết: DT 2008 là kết quả chọn tạo
bằng phương pháp lai + đột biến phóng xạ từ năm 2002 của đề tài “Chọn tạo
giống đậu tương đột biến chịu hạn” mà Viện Di truyền Nông nghiệp là cơ
quan đại diện cho Việt Nam tham gia phối hợp trong khuôn khổ Diễn đàn
Hợp tác Hạt nhân châu Á về chương trình Chọn giống đột biến phóng xạ.
Thời gian sinh trưởng 95 – 110 ngày. Giống được trồng vụ xuân, hè thu và
đông. DT 2008 có nhiều ưu điểm vượt trội so với các giống khác: năng suất
cao (18-35 tạ/ha, trong điều kiện khó khăn có thể cho năng suất cao gấp 1,5 2 lần các giống thông thường [13].
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm.
Địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu
Khoa học và Chuyển giao Công nghệ - Trường ĐHSP Hà Nội 2.
Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, tiến hành thí nghiệm gieo hạt
trong dung dịch muối theo phương pháp của Volcova có cải tiến [28].
Chọn hạt giống đều, khỏe, có phôi sáng, không nấm mốc. Khử trùng
khay, bình, dụng cụ … bằng cồn. Giấy lọc được sấy 130oC trong vòng 1 giờ,
hạt được khử trùng bằng dung dịch KMnO4 5% trong 5 phút.
Gieo trên khay có giấy thấm, chia thành 2 phần:
Phần 1: Lô đối chứng (ĐC) cho hạt nảy mầm trong nước cất.

12


Phần 2: Lô thí nghiệm (TN) cho hạt nảy mầm trong dung dịch muối
NaCl với áp suất thẩm thấu 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 (atm) và đặt tên tương ứng là
các mẫu thí nghiệm P1, P3, P5, P7, P9, P11, P13.
Hạt nảy mầm trong dung dịch muối NaCl và trong nước cất phải
thường xuyên bổ sung lượng nước hoặc lượng dung dịch muối với nồng độ

tương ứng ở các lô như nhau.
2.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
2.2.2.1. Xác định các chỉ tiêu sinh lí
* Dung dịch pha là dung dịch muối NaCl
Ptt = c.R.T.i
Ptt: áp suất thẩm thấu; c: nồng độ muối; R: 0,082; T: nhiệt độ tuyệt đối
(K) (=273 + toC)

i = 1+  (n-1)

i = 1,5 [20].

* Xác định tỷ lệ nảy mầm
Tỷ lệ nảy mầm được xác định theo phương pháp của Volcova (1984) [28].
Đếm số hạt nảy mầm trong các mẫu từ khi hạt đầu tiên nảy mầm cho
tới khi không còn có thêm hạt nào nảy mầm mới. Những hạt nảy mầm là
những hạt có chiều dài rễ mầm đạt 3 mm trở lên. Tỷ lệ nảy mầm (N) trong
dung dịch muối NaCl được tính theo công thức:
a
N  .100%
b

N: Khả năng nảy mầm của hạt; a: Số hạt nảy mầm trong lô TN;
b: Số hạt nảy mầm trong lô ĐC.
* Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng của mầm
Chúng tôi tiến hành đo chiều dài thân mầm, rễ mầm vào các ngày 1, 3,
5, 7 và khối lượng tươi, khô vào ngày 1 và ngày 7 sau khi hạt nảy mầm.
- Chiều dài thân, rễ mầm (mm/mầm): sử dụng thước chia đơn vị đến
mm để đo chiều dài của thân mầm, rễ mầm.

13


- Khối lượng tươi của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước
cất, lau sạch và thấm khô sau đó cân khối lượng của mầm.
- Khối lượng khô của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước
cất, lau sạch và thấm khô đem sấy khô ở 105oC đến khi khối lượng không
đổi (3h).
2.2.2.2. Xác định các chỉ tiêu sinh hóa
* Hoạt độ của enzym proteaza (mg/g)
Lấy 2 bình nón (V = 100 ml) cho vào mỗi bình 2 g hạt đậu tương đã
nảy mầm đã nghiền nát và 10 ml KH2PO4 0,1 N, lắc nhẹ để tạo môi trường
pH thích hợp với hoạt độ của proteaza có trong hạt đã nảy mầm. Thêm vào
bình 1 (bình đối chứng) 10 ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động
của enzim. Cho vào mỗi bình 2 ml dung dịch protein 5%, đặt 2 bình trong tủ
ấm 37º C thời gian 1 giờ. Sau đó, thêm vào bình 2: 10 ml axit tricloaxetic
10% để kìm hãm hoạt động của enzim, kết thúc quá trình thủy phân protein.
Dùng ống đong đo dung dịch mẫu (V). Lọc dung dịch trong từng bình, đo lại
dung tích lọc, chuyển sang bình tương ứng với thí nghiệm (2) và bình đối
chứng (1). Thêm vào mỗi bình chứa dịch lọc: 10 ml foocmaldehit và 5 giọt
tymophtalein để làm chất chỉ thị màu. Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2 N
đến khi xuất hiện màu xanh mực cửu long là được.
Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu được tính theo công thức:
X 

(V2  V1 ).2,82.V . f
V3 .g

X: Hàm lượng nitơamin trong mẫu nghiên cứu (mg); V1: Số ml NaOH
0,2 N chuẩn độ ở bình ĐC; V2: Số ml NaOH 0,2 N chuẩn độ ở bình TN; V3:

Số ml dung dịch lọc đem chuẩn độ; V: Số ml dung dịch mẫu; g: Khối lượng
mẫu đem phân tích; f: hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,2 N.

14


* Hoạt độ enzym lipaza (Theo Nguyễn Văn Mùi) [10].
Cân 5 g hạt đậu tương nảy mầm đã nghiền nát, chuyển vào bình nón
100 ml, cho thêm 10 ml nước cất, lắc đều. Cho thêm 1 ml dầu lạc làm cơ
chất và 5ml dung dịch đệm axetat pH = 4,7 với vài giọt toluen. Trộn đều hỗn
hợp và cho vào tủ ấm 30oC trong 20 – 24 giờ. Bình kiểm tra phải đun sôi
dịch enzim 3 – 5 phút để làm mất hoạt động của enzim trước khi cho tiếp xúc
với cơ chất. Sau khi ngừng phản ứng, cho vào mỗi bình 25 ml cồn 96% và
15 – 24 ml ete. Lắc đều, để lắng. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N với
0,5 ml chỉ thị tymolphtalein 1%. Đối với dịch chiết nguyên liệu thực vật
không có màu thì dùng chỉ thị phenolphtalein.
Hoạt độ lipaza được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1 N trong 10 g hạt
theo công thức:
X 

( a  b ). f .10
W

X: Hoạt độ của enzim lipaza; a: Số ml NaOH 0,1 N dùng để chuẩn độ
bình thí nghiệm; b: Số ml NaOH dùng để chuẩn độ bình đối chứng. f : Hệ số
chỉnh lí NaoH 0,1 N; w: Khối lượng hạt.
* Hoạt độ enzym α - amilaza
Cho vào 2 bình nón 50 ml, mỗi bình 10 ml dung dịch tinh bột 1% và
đặt vào máy ủ nhiệt ở 30oC, giữ 10 phút. Thêm vào bình 2 (bình TN) 5 ml
dịch chiết enzim. Khuấy đều và giữ 10 phút. Lấy từ mỗi bình hỗn hợp cho

vào 2 bình khác có chứa 50 ml dung dịch iot. Lắc đều. Bình đối chứng có
màu xanh, bình thí nghiệm có màu tím. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 656 nm.
Mật độ quang của bình đối chứng (OD1) là lượng tinh bột ban đầu. Mật độ
quang của bình thí nghiệm (OD2) là lượng tinh bột còn lại sau khi α amilaza thủy phân. Sự khác nhau giữa mật độ quang của bình đối chứng và
bình thí nghiệm là lượng tinh bột bị enzim thủy phân.

15


Lượng tinh bột bị thủy phân (c) tính theo công thức:
OD1  OD2
.0,1
OD1

C

Trong đó:

c: Lượng tinh bột bị thủy phân; OD1: Mật độ quang của dung
dịch đối chứng; OD2: Mật độ quang của dung dịch thí ngiệm;
0,1: Lượng tinh bột phân tích.

Hoạt độ amilaza (tính theo đơn vị UI/gam) của malt (HdAm) theo công thức
X

 6,889 . c

– 0, 029388  . 1000



Trong đó: : lượng chế phẩm enzim đem thí nghiệm; C: lượng tinh
bột thủy phân; 1000: hệ số chuyển mg thành gam; 6,889 và 0,029388: là hệ
số của phương trình tính hoạt độ.
* Hàm lượng axit amin prolin.
Xác định hàm lượng axit amin prolin: theo phương pháp của Bates và
cộng sự (1973) đã được Đinh Thị Phòng cải tiến [11].
Cân 0,5 g/mẫu nghiền kĩ, thêm 10 ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%,
ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút. Lấy 2ml dịch chiết cho vào
bình, thêm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhydrin (thành phần của
dung dịch này là 1,25 g ninhydrin và 30 ml axit axetic) đậy kín, đảo đều.
Ủ trong nước nóng 1000C trong thời gian 1 giờ sau đó ủ trong nước
đá 5 phút. Bổ sung vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch
màu hồng ở trên đem đo mật độ quang học (OD – Optical density) ở bước
sóng λ = 520 nm trên máy UV 2450 do hãng SHIMADZU – Nhật Bản sản
xuất (công thức suy ra từ việc lập đường chuẩn prolin)
Y = 0,0179 . X + 0,095
Trong đó: Y: nồng độ prolin (mg/l); X: giá trị OD đo ở bước sóng
λ = 520 nm

16


Sau đó hàm lượng prolin được đổi ra mg/g theo công thức:
A

Y .V
P.1000

Trong đó: A: hàm lượng prolin (mg/g). P: khối lượng mẫu (g); V: thể

tích dịch prolin chiết được (ml).
2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu.
Kết quả thí nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft
Excel theo các tham số: giá trị trung bình ( ), độ lệch chuẩn (δ), sai số trung
bình (m), Hệ số biến động (Cv), sai số của hiệu các trung bình số học (md),
độ chính xác của thí nghiệm (m%) được tính theo công thức sau:
N

X
X=

i

i=1

Cv=±

n

δ.100
X

δ=

  X -X 

m 00 =

i

n-1

δ
X

2

m=±

δ
n

md =

m  m 
2

2

1

2

Trong đó: Xi: là giá trị đo được qua mỗi lần đo; n: là số lần nhắc lại.

17


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khả năng nảy mầm và sự sinh trưởng của mầm đậu tương

3.1.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương
Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu tương ở 5 ngày đầu được thể hiện qua bảng
3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tỉ lệ nảy mầm của đậu
tương
ĐV: %
Mẫu TN

Ngày1

Ngày2

 Ngày3

Ngày4

Ngày5

ĐC

33,33

80,00

100,00

100,00

100,00

P1

24,44

78,89

100,00

100,00

100,00

P3

7,78

70,00

100,00

100,00

100,00

P5

-

52,22

98,89

100,00

100,00

P7

-

35,56

63,33

76,67

76,67

P9

-

22,22

40,00

62,22

61,11

P11

-

-

20,00

27,78

25,56

P13

-

-

-

-

-

Hạt chỉ nảy mầm mạnh từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 5. Sang ngày thứ 7
hạt chưa nảy mầm có lớp keo bao quanh và bắt đầu có dấu hiệu bị hỏng. Hạt
nảy mầm tới áp suất thẩm thấu 11 atm, ở áp suất thẩm thấu 13 atm hạt có dấu
hiệu trương nhưng không nảy mầm. Ngày đầu tiên, đậu tương chỉ nảy mầm
được ở những áp suất thẩm thấu thấp (1 - 3) atm. Ngày thứ 2, đậu tương nảy
mầm được ở những áp suất thẩm thấu cao hơn (đến 9 atm). Ngày thứ 3, hạt

nảy mầm đến 11 atm. Khi áp suất thẩm thấu > 11 atm thì đậu tương không
nảy mầm.

18


Tỉ lệ (%)

120.0
100.0
80.0
60.0
40.0
20.0
0.0

Ngày 1
Ngày 2
Ngày 3
Ngày 4
ĐC

P1

P3

P5

P7

P9

P11

P13

Ngày 5

Mẫu TN

Hình 3.1: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tỉ lệ nảy mầm của
đậu tương
Ở Ptt = 13 atm thì hạt đậu tương không nảy mầm. Điều này chứng tỏ Ptt
có ảnh hưởng rất lớn tới sự nảy mầm của hạt. Khi áp suất của môi trường
càng cao thì khả năng hút nước của tế bào càng giảm, để đảm bảo cho sự nảy
mầm, tế bào phải tăng cường tích lũy một số chất phản ứng chống lại điều
kiện khắc nghiệt. Do đó, làm chậm tốc độ và giảm tỉ lệ nảy mầm của hạt. Đặc
biệt ở Ptt = 13 atm này hạt không nảy mầm vì hạt không lấy được nước, do đó
enzim không được hoạt hóa, không có năng lượng cho hạt nảy mầm.
3.1.2. Sinh trưởng của mầm đậu tương
3.1.2.1. Khối lượng tươi và khô của mầm đậu tương
Trong quá trình nảy mầm của hạt, nước giữ vai trò đặc biệt quan trọng,
là tác nhân hoạt hóa enzim thủy phân và cũng là môi trường phản ứng tham
gia vào quá trình phân giải chất dự trữ phục vụ cho việc tổng hợp mới chất
hữu cơ cung cấp năng lượng kiến tạo tế bào và mô.
Khối lượng tươi và khô của mầm là kết quả sinh tổng hợp ở giai đoạn
đầu sinh trưởng của mầm đậu tương. Khối lượng tươi biểu hiện khả năng hút
nước đồng thời đồng thời đóng vai trò quyết định khối lượng khô của mầm.
Khối lượng khô của mầm thể hiện hàm lượng các chất mà chúng tích lũy

19