Nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp cellulose của chủng a xylinum BHN2 bằng tia UV

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo ThS.
Nguyễn Thị Thùy Vân và PGS. TS Đinh Thị Kim Nhung, người đã tận tình
chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu luận văn này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo trong tổ bộ môn
Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt
tình giảng dạy và khuyến khích em trong thời gian học tập.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã giúp
đỡ, động viên em.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2011
Sinh viên

Vũ Văn Khoan

Vũ Văn Khoan

i

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây
là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ
thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả đã công bố.

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2011

Sinh viên

Vũ Văn Khoan

Vũ Văn Khoan

ii

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Danh mục hình và bảng biểu

Danh mục các từ viết tắt
Mở đầu................................................................................................. 1
Nội dung .............................................................................................. 3
Chương 1: Tổng quan tài liệu ............................................................ 3
1.1. Vi khuẩn Acetobacter xylinum .............................................................. 3
1.1.1. Lược sử nghiên cứu ....................................................................... 3
1.1.2. Các đặc điểm phân loại của vi khuẩn Acetobacter xylinum ........... 5
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter xylinum ............... 8
1.2. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose ...................... 10
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose............................ 10
1.2.2. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose. .............................................. 11
1.3. Đột biến ở vi sinh vật ............................................................................ 12

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu................................................. 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất ........................................................ 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp vi sinh ...................................................................... 15
2.2.2. Phương pháp đột biến vi sinh vật................................................... 17
2.2.3. Phương pháp tuyển chọn sơ bộ các chủng sau đột biến.................. 17
2.2.4. Phương pháp toán học ................................................................... 18

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận................................ 19
3.1. Chọn chủng đầu dòng ........................................................................... 19
3.2. Xác định sơ bộ thời gian đột biến và phương pháp đột biến phù hợp..... 20

Vũ Văn Khoan

iii

K33B Khoa Sinh – KTNN

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

3.2.1. Xác định sơ bộ thời gian đột biến ................................................. 20
3.2.2. Xác định phương pháp đột biến phù hợp ....................................... 22
3.3. Tuyển chọn và kiểm tra khả năng tạo màng của các chủng sau
đột biến ........................................................................................................ 23
3.3.1. Đột biến và tuyển chọn .................................................................. 23
3.3.2. Kiểm tra khả năng tạo màng BC của các chủng sau đột biến ......... 25
3.4. Xác định sự biến đổi hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc của chủng
trước và sau đột biến .................................................................................... 26

Kết luận và kiến nghị.......................................................................... 30
Tài liệu tham khảo .............................................................................. 31

Vũ Văn Khoan

iv

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG BIỂU

HÌNH
Hình 1.1. Vi khuẩn A.xylinum ...................................................................... 6
Hình 1.2. Cấu trúc cellulose ......................................................................... 10
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum ........................... 12
Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn A.xylinum BHN2 ........................................... 19
Hình 3.2. Sơ đồ đột biến phù hợp với vi khuẩn A.xylinum bằng tia UV........ 22
Hình 3.3. Khuẩn lạc sau đột biến của chủng D7BHN2.3 .............................. 24
Hình 3.4. Chủng sau đột biến được nhân trong các ống nghiệm ................... 24
Hình 3.5. Khả năng tạo màng của chủng D7BHN2.3 ................................... 25
Hình 3.6. Màng BC của chủng D7BHN2.3................................................... 26
Hình 3.7. Hình thái tế bào của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trước
đột biến (A) và sau đột biến (B) .................................................................. 28
Hình 3.8. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trước
đột biến (A) và sau đột biến (B) .................................................................. 28

BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum
theo Frateur (1950)....................................................................................... 8
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 sau khi được
tuyển chọn.................................................................................................... 20
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian tác động tia UV đến khả năng
sinh trưởng của vi khuẩn A.xylinum BHN2 .................................................. 21
Bảng 3.3. Khả năng tạo màng của các chủng sau đột biến............................ 23
Bảng 3.4. So sánh khả năng tạo màng của các chủng đột biến...................... 25
Bảng 3.5. Điểm sai khác giữa chủng ban đầu và chủng sau đột biến
của A.xylinum BHN2.................................................................................... 27

Vũ Văn Khoan

v

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
A.xylinum

: Acetobacter xylinum

BC

: Bacterial cellulose

PMG

: Phosphoglucomutase

UGP

: Glucose-1-phosphate uridylytransferase

1PFK

: Fructose-1-phosphate kinase

Fru-6-P

: Fructose-6-phosphate

Glc-1-P

: Glucose-1-phosphate

UDPGlc

: Uridine diphosphoglucose

GK

: Glucokinase

FBP

: Fructose-1,6-biphosphate phophatase

G6PDH

: Glucose-6-phosphate dehydrogenase

PGI

: Phosphoglucoisomerase

PTS

: Hệ thống phosphotransferase

Fru-bi-P

: Fructose-1,6-bi-phosphate

Glc-6-P

: Glucose-6-phosphate

PGA

: Phosphogluconic acid

FK

: Fructokinase

CS

: Cellulose synthase

CFU

: Colony Forming Unit

UV

: Ultra Violet

VSV

: Vi sinh vật

cs

: Cộng sự

Vũ Văn Khoan

vi

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc,
hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn A.xylinum
tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn này
trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng
Bacterial cellulose (màng BC), đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với
phân tử cellulose. Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer--1,4
glucopyranose không phân nhánh được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn khi
nuôi cấy chúng trên môi trường dịch lỏng. Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra
rằng A.xylinum là loài vi khuẩn tổng hợp màng BC có hiệu quả cao nhất [23].
Màng BC do A.xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học

giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc
biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn,
khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vậy BC
được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ. Một
trong các ứng dụng đã và đang được quan tâm hiện nay là sản xuất màng BC
điều trị bỏng và tổn thương da [6].
Màng BC hoàn toàn có thể sản xuất trong nước bằng phương pháp lên
men tĩnh của vi khuẩn A.xylinum trong môi trường lỏng. Tuy nhiên một vấn
đề gặp phải là chủng A.xylinum dễ bị thoái hóa, vì thế việc không ngừng nâng
cao hoạt tính sinh tổng hợp cellulose là rất cần thiết. Chính vì lý do đó mà
chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp
cellulose của chủng A.xylinum BHN2 bằng tia UV”.

Vũ Văn Khoan

1

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2. Mục tiêu của đề tài
Tuyển chọn được các chủng đột biến từ chủng A.xylinum BHN2 có khả
năng sinh tổng hợp cellulose hơn chủng gốc.

3. Nội dung của đề tài
+ Chọn chủng đầu dòng.

+ Xác định thời gian đột biến và phương pháp đột biến thích hợp.
+ Đột biến và tuyển chọn chủng đột biến.
+ Xác định sự thay đổi hình dạng tế bào, hình thái khuẩn lạc của chủng
trước và sau đột biến.

4. Ý nghĩa của đề tài
Tạo ra các chủng đột biến tạo màng BC có chất lượng tốt nhất rút ngắn
thời gian, hạ giá thành so với các chủng bình thường. Từ đó có thể sản xuất
màng BC với số lượng nhiều đáp ứng nhu cầu.

Vũ Văn Khoan

2

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.1.1. Lược sử nghiên cứu
1.1.1.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới
Hiện nay, vi khuẩn A.xylinum và ứng dụng của nó đang được sự quan
tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Tập trung theo hai hướng cơ bản:
 Hướng thứ nhất: Chủ yếu là phân lập tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính
sinh học của A.xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng trong sinh

giới.
Tiêu biểu là các nghiên cứu của Beijerinck, Frateur [19]. Trên cơ sở
nghiên cứu các đặc tính hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa các tác giả xác
định nguồn gốc, đặc điểm phân loại của A.xylinum. Các nghiên cứu của một
số nhà khoa học Nhật Bản như Kumiko Nanda và cs, P. M. Kutima; T.T.
Kadere và cs [24]. Các tác giả phân lập tuyển chọn và nghiên cứu đặc tính
sinh học của A.xylinum. Và một số chủng vi khuẩn acetic khác phân lập từ các
sản phẩm lên men truyền thống của Nhật như Mnazi, Komesu, Kurosu.
 Hướng thứ hai: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm và ứng
dụng của BC vi khuẩn A.xylinum.
Đó là các nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của các chủng
A.xylinum; ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến
quá trình sinh tổng hợp cellulose. Mở đầu là S. Hestrin; M. Scharmn và cs
[21], [26], [25], sau là một loạt các nghiên cứu tương tự, [18], [20], [22].
Tiếp đến là nghiên cứu cơ chế tổng hợp màng BC, con đường chuyển
hóa cacbon trong vi khuẩn A.xylinum. Mở đầu là nghiên cứu của R.M. Brown
và cs, K.Zaar [17]. Gần đây cơ chế sinh tổng hợp cenllulose, các hệ enzyme

Vũ Văn Khoan

3

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

tham gia và con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn A.xylinum mới dần

được sáng tỏ [26].
Từ nửa sau thế kỷ XIX đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu
về ứng dụng của màng BC trong các lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt là màng trị
bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã thu được kết
quả tốt như Wan và Millon đã được đăng ký bản quyền về làm màng BC từ
A.xylinum dùng trị bỏng [27]. Về sau có nhiều tác giả khác cũng nghiên cứu
về hướng này.
1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt nam
Trong điều trị bỏng, để giảm đau cho bệnh nhân, hạn chế mất dịch, máu
qua vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mô hoá ở
bỏng nông hay kích thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các
loại vật liệu che phủ tạm thời. Việc sử dụng các vật liệu che phủ tạm thời có
nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết thương phần mềm, vết bỏng đã được
sử dụng từ rất lâu. Tuy nhiên, việc sử dụng những loại da này cũng mới chỉ
dừng lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi. Mặc dù da dị loại tươi có
những ưu điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những
nhược điểm nhất định. Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và
xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Vật liệu từ da đồng
loại là lý tưởng nhất cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhưng trong nhiều
trường hợp rất khan hiếm; không đủ đáp ứng được. Chính vì vậy vật liệu che
phủ tạm thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan
trọng trong điều trị bỏng. Một trong các loại màng sinh học đã và đang được
quan tâm ngày nay là màng cellulose vi khuẩn.
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn
A.xylinum ngày càng được quan tâm . Có một số các nghiên cứu, công bố liên
quan đến A.xylinum sự hình thành màng BC và ứng dụng màng BC. Các công

Vũ Văn Khoan

4

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc
màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng [9]; sản xuất thạch dừa [7]. Gần đây
nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế
bào vi khuẩn của Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thành Hổ [28].
Theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ Vi sinh – Ký sinh, Đại học
Y Dược, Thành phố Hồ Chí Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ông chế tạo
thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên
men. Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên
nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời [29].
Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan,
nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của A.xylinum và hoạt
chất tái sinh mô của dầu mù u. Ngoài ra, có nghiên cứu về hiệu ứng làm lành
vết thương của hỗn hợp Chistosan tan trong nước – Bacterial cellulose – Nano
bạc của nhóm tác giả Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị
Mỹ Phước và Nguyễn Quốc Hiển [10].
Và tại phòng Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs đang tiến
hành nghiên cứu quy trình sản xuất màng BC với chất lượng tốt và ứng dụng
vào trị bỏng bước đầu đã đạt được thành công [14].
1.1.2. Các đặc điểm phân loại của vi khuẩn Acetobacter xylinum
* Đặc điểm hình thái - tế bào học
A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng

2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng
nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm
iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ

Vũ Văn Khoan

5

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá
giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [13].
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,
hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước
ép hoa quả, trong đất.

Hình 1.1. Vi khuẩn A.xylinum BHN2
* Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc
trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Vi
khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng
sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC.
Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với

kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra
những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh.

Vũ Văn Khoan

6

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

* Đặc điểm sinh lý – sinh hoá
+ Đặc điểm sinh lý:
Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH = 4 - 6. Nhiệt độ
và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và
nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn
A.xylinum sinh trưởng và tạo màng.
A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm
acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
+ Đặc điểm sinh hoá:
Năm 1950, Frateur [19] đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới
căn cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O;
hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [19]…Theo
quan

điểm

này

A.xylinum

là

chủng

thuộc

chi

Acetobacter,

họ

Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân
biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây:

Vũ Văn Khoan

7

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum
theo Frateur (1950) [19]
STT
1
2
3

Đặc điểm
Oxy

hoá

Hiện tượng

ethanol Chuyển hoá môi trường chứa Bromphenol
Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng

Hoạt tính catalase

Hiện tượng sủi bọt khí

+

Sinh khối không phát triển

_

Sinh

trưởng

trên

môi trường Hoyer

glycerol

thành

dihydroxyaceton
5

6

7

+

thành acid acetic

Chuyển hoá
4

Kết quả

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên
men

Chuyển hoá glucose Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn

thành acid
Kiểm tra khả năng
sinh sắc tố nâu
Kiểm tra khả năng
tổng hợp cellulose

lạc trên môi trường chứa CaCO3

+

+

Không hình thành sắc tố nâu

_

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.

Vũ Văn Khoan

8

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật
dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất
có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ
bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử
trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở
1100 trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp
hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác
người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường
dùng 0,5-0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các loại
đường ở dạng đồng phân D [1].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [1].
1.1.3.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH4+ thì sau
khi chúng đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ ( SO42-,
Cl- …) làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trường. Muối anion của các
axit hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn
(mặc dù đắt hơn).
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,

xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết
NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [1].
Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu
cơ. Các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi
sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân

Vũ Văn Khoan

9

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di
chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [1].
1.1.3.3. Hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men
Ethanol được sử dụng như một cơ chất. Hàm lượng ethanol có thể thay
đổi từ 2-10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo
Hong Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2-1% tốt
nhất ở 0,6% . Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở
3-3,5% . Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7-10% V.
Để tránh hiện tượng oxy hoá hoàn toàn acid acetic cần có một lượng ethanol
sót trong sản phẩm từ 0,2-0,5% để ức chế tự tổng hợp enzyme oxy hoá acid
acetic và muối acetate [1], [22].
Ngoài việc oxy hoá ethanol, vi khuẩn acetic còn có khả năng oxy hoá
các rượu khác thành các acid tương ứng.

1.2. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mạch
thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau.

Sợi cellulose của màng BC
Sợi cellulose của thực vật
Hình 1.2. Cấu trúc cellulose

Vũ Văn Khoan

10

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với
với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc Van Der Waals tạo
thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng
lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể
xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng.

1.2.2. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [16].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc
tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.xylinum:
Glucokinase (GK): Phosphoryl hóa C6 của glucose.
Phosphoglucomutase (PGM): Xúc tác quá trình chuyển hóa Glucose – 6
phosphat thành glucose – 1 phosphat.
Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay
UGP): Xúc tác tổng hợp UDP – Glucose.
Cellulose synthase (CS): Xúc tác tổng hợp cellulose từ UDP – glucose.
Con đường sinh tổng hợp cellulose được thể hiện rõ ở hình 1.3:

Vũ Văn Khoan

11

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum

1.3. Đột biến ở vi sinh vật
Vi sinh vật bao gồm những sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn có cấu tạo
đơn giản. Đặc biệt do cấu tạo hết sức đơn giản của vật chất di truyền nên hệ

gen của vi khuẩn rất dễ bị biến đổi bởi các tác nhân lý, hóa của môi trường.
Lợi dụng khả năng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng đột biến
trong nhiều lĩnh vực phục vụ nhu cầu con người và sản xuất.

Vũ Văn Khoan

12

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Đột biến được bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mutatio nghĩa là biến đổi,
được nhiều nhà nghiên cứu khai thác ở các khía cạnh khác nhau. Theo quan
điểm hiện đại, đột biến là những biến đổi trong vật chất di truyền xảy ra đột
ngột [12].
Tùy các hướng tiếp cận khác nhau, các nhà khoa học phân loại đột
biến thành nhiều dạng [8], [12]. Tuy nhiên đối với VSV, các nhà nghiên cứu
quan tâm phân loại đột biến theo hai hướng: tác nhân gây đột biến và tính
trạng biến đổi do đột biến.
Tia tử ngoại (UV – Ultra Violet) nằm trong vùng quang phổ không
nhìn thấy của mặt trời, hình thành từ các lượng tử của ánh sáng, bước sóng λ
= 136 – 4000 A0, có mức năng lượng thấp nên không có khả năng xuyên sâu
bởi vậy thường được sử dụng để gây đột biến với VSV và hạt phấn.
Cơ chế gây đột biến của tia UV đối với VSV còn nhiều tranh cãi, tuy
nhiên nhiều nghiên cứu đưa ra một giả thuyết chung như sau: Ở bước sóng
2600A0 ADN của vi khuẩn hấp thụ mạnh nhất. Dưới tác động của tia UV,

bazo cystein gắn thêm phân tử H2O vào liên kết C = C của mạch vòng và
thymin bị đứt liên kết C = C mạch vòng nối hai phân tử dime thymin. Do đó
các nhánh thymin gần nhau trong chuỗi ADN xuất hiện các liên kết cộng hóa
trị, ức chế sự nhân đôi của ADN [3].

Vũ Văn Khoan

13

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 được phân lập từ màng của các
nguồn nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên
men theo phương pháp cổ truyền, chủng giống nhận từ phòng Vi sinh vật,
khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Hóa chất
- Nguồn đường: glucose (sản xuất tại cty Dược T.W MEDIPLANTEX
Hà Nội, Việt Nam)
- Nguồn nitơ:
+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4 (sản xuất tại Trung Quốc)
+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton (sản xuất tại Trung Quốc)

- Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH (sản xuất tại
Trung Quốc)
- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch
lugol
- Agar (sản xuất tại cty TNHH Hải Long, Hải Phòng, Việt Nam)
- Acid acetic (sản xuất tại cty hóa chất Đức Giang, Hà Nội, Việt Nam)
(được cung cấp bởi phòng Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2)
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng những dụng
cụ thiết bị như:
Nồi hấp khử trùng, tủ sấy (Haraeus, Đức).
Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức).

Vũ Văn Khoan

14

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ)
Micropipep (Gilson, Pháp).
Tủ lạnh (Tawasi, Nhật).
Kính hiển vi quang học (Olympus CX41 , Nhật).
Hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác, lam

kính, la men, đèn cồn,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
(được cung cấp bởi phòng Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2)
2.1.4. Môi trường nghiên cứu
2.1.4.1. Môi trường giữ giống (môi trường cơ bản):
Glucose: 20g/l;

MgSO4.7H2O: 2g/l

Pepton: 5g/l

Nước máy: 1000 ml

(NH4)2SO4: 3g/l

Agar: 20g/l.

KH2PO4: 2g/l
2.1.4.2. Môi trường nhân giống:
Glucose: 20g/l

MgSO4.7H2O: 2g/l

Pepton: 5g/l

Nước máy: 1000 ml

KH2PO4: 2g/l
(NH4)2SO4: 3g/l

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc

Vũ Văn Khoan

15

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng
theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha
loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 30oC trong 5 ngày đếm
khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa Petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi
khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.

N  Ai .

1000 1
.
Vi 10n

Trong đó N : Tổng số CFU trong 1ml mẫu ban đầu.
Ai: Số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giải
CaCO3 trên đĩa phân lập có độ pha loãng 10-n.

Vi : Thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập.
10-n : Là độ pha loãng của mẫu phân lập.
2.2.1.2. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum bằng
phương pháp nhuộm Gram
Vi khuẩn A.xylinum là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân biệt
với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép).
Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn A.xylinum đem nhuộm tiêu bản theo
phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi
quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần [2], [4], [5].
2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ bộ xác định là A.xylinum
được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm ở 300C. Sau đó
giữ lạnh trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền và
giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một lần [4], [5].
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hoá giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử
dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật

Vũ Văn Khoan

16

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu

chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng. Sau đó đem xử lý trong đèn
tím 15 phút, cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135
vòng/phút trong 24giờ [4], [5].
2.2.1.5. Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng. Sau đó
khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trường 5% giống
hoạt hoá.
Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh trong 3 - 4 ngày.
2.2.2. Phương pháp đột biến vi sinh vật
Nguyên tắc đột biến: lấy chủng có khả năng tạo màng chất lượng cao
nhân thuần, ổn định hoạt tính [8].
Chúng tôi tiến hành đột biến vi sinh vật dưới tác dụng của đèn UV có
bước sóng 253,7 nm trong các thời gian khác nhau: 3, 5, 8, 10, 15 phút. Với
cách đột biến như sau:
Đột biến qua dịch: Nuôi vi khuẩn A.xylinum trong môi trường lỏng ở
25-300C trong 8-12h (khoảng thời gian quần thể vi sinh vật bắt đầu phân chia
mạnh khi bước vào pha log). Sau đó tiến hành đột biến dưới đèn UV.
Đột biến trên môi trường thạch đĩa: nuôi vi khuẩn A.xylinum trên môi
trường lỏng (môi trường lên men) ở 25-300C trong 8-12h (khoảng thời gian
quần thể vi sinh vật bắt đầu phân chia mạnh khi bước vào pha log). Pha loãng
mẫu, trang đều trên môi trường thạch. Để trong tủ ấm ở 25-300C trong 2-3h
để các tế bào phân chia. Sau đó tiến hành đột biến dưới đèn UV.
2.2.3. Phương pháp tuyển chọn sơ bộ các chủng sau đột biến
Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường thạch, trang vi khuẩn A.xylinum
và đột biến ở thời gian thích hợp. Sau đó các đĩa này được nuôi ở tủ ấm 25300C. Khi các khuẩn lạc mọc, dùng que cấy tách riêng các khuẩn lạc cấy sang

Vũ Văn Khoan

17

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

môi trường thạch nghiêng, sau đó đem nuôi ở tủ ấm. Khi vi khuẩn A.xylinum
trong các ống thạch nghiêng này mọc, tiến hành hoạt hóa và lên men tạo
màng.
2.2.4. Phương pháp toán học
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp
trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” [11], và “Thống kê và ứng
dụng” [15] như:
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
thí nghiệm:

X

1 n
 Xi
n i 1
n

(X
* Trung bình bình phương các sai lệch:  
* Sai số đại diện của trung bình cộng:
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:

i

 X )2

i 1

m 

Cv 

n 1


n
 x100
X

* Tính giá trị trung bình cộng tổng thể:
Theo công thức:
n

M=
Trong đó:


i 1

Xi
n
M:

Giá trị trung bình tổng thể

Xi:

Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm

n:

Vũ Văn Khoan

Số lần thí nghiệm

18

K33B Khoa Sinh – KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chọn chủng đầu dòng
Chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 được nuôi trong môi trường dịch thể,
nhỏ 100l dịch huyền phù chứa A.xylinum BHN2 vào đĩa petri có sẵn môi
trường thạch tiếp đó trang đều. Ủ trong tủ ấm 2 – 3 ngày ở 25 – 300C.

Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn A.xylinum BHN2

Khi khuẩn lạc xuất hiện chúng tôi tiến hành chọn các khuẩn lạc rồi cấy

truyền riêng rẽ sang từng ống nghiệm thạch nghiêng. Chúng tôi đã lựa chọn
được 5 chủng là: BHN2.1, BHN2.2, BHN2.3, BHN2.4, BHN2.5 và đã kiểm
tra khả năng tạo màng của 5 chủng này.

Vũ Văn Khoan

19

K33B Khoa Sinh – KTNN