Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn streptomyces orientalis

Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp
vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces
orientalis

Chu Thanh Bình

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Phương Nhuệ
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Trình bày Chất kháng sinh vancomyxin; Streptomyces orientalis và các yếu
tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp vancomyxin; nghiên cứu duy trì và nâng cao hiệu suất
chủng giống sản xuất vancomyxin; tình hình nghiên cứu và sản xuất vancomyxin. Vật
liệu nghiên cứu; phương pháp nghiên cứu: Bảo quản giống; Xác định đặc điểm sinh
học; Xác định sinh khối; Xác định hoạt tính kháng sinh, … Nghiên cứu đặc điểm sinh
học của chủng Streptomyces orientalis 4912; khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của
chủng S. orientalis 4912; nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912;
một số đặc điểm sinh học của biến chủng Streptomyces orientalis 4912- 81- 61; tối ưu
hóa quy trình lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61.

Keywords: Vi sinh vật học; Xạ khuẩn; Tổng hợp vancomyxin; Chất kháng sinh

Content
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CHẤT KHÁNG SINH VANCOMYXIN
1.1.1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin
Vancomyxin là CKS tiêu biểu nhất trong nhóm KS glycopeptit, được Eli Lilly và cộng sự mô
tả lần đầu tiên vào năm 1956, do xạ khuẩn S. orientalis phân lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ

sinh ra [45]. Ban đầu CKS này được gọi là hợp chất 05865, nhưng sau đó đã được đặt tên là
vancomyxin (do bắt nguồn từ “Vanquyshed” có nghĩa là “đánh bại”). Năm 1958, CKS này
được đưa vào điều trị thử nghiệm trên người. Năm 1964, Bộ Y tế Mỹ chấp thuận đưa
vancomyxin vào sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện. Khi CKS bán tổng hợp nhóm penixilin
là metixilin được đưa vào dùng trong chữa bệnh thì nhu cầu về vancomyxin đã giảm xuống
trong một thời gian. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn S. auureus kháng
metixilin vào 2 thập kỷ cuối thế kỷ XX đã làm kháng sinh glycopeptit được lựa chọn trong

2
phác đồ điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng nhiều loại KS thông dụng gây ra.
Lúc đó vancomyxin được ví như một loại thần dược hay phương thuốc cuối cùng vì có khả
năng điều trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng metixilin
gây nên. Vancomyxin đã mở ra liệu pháp điều trị đầu tiên khi có sự nghi ngờ về khả năng
kháng penixilin của các chủng Staphylococcus. Sau khi những nghi ngờ này được dẫn chứng
bằng những số liệu cụ thể thì liệu pháp này được điều chỉnh cho phù hợp [18], [20], [22],
[28], [36], [56].
1.1.2. Đặc tính của vancomyxin
Vancomyxin có công thức tổng quát C
66
H
75
Cl
2
N
9
O
24
. Trong phân tử có chứa một
disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, cấu trúc hóa học được thể hiện ở hình 1.1 [9], [16].
Vancomyxin có tổng số 18 trung tâm lập thể, với 9 trung tâm lập thể nằm trên lõi glycol và

các trung tâm còn lại nằm tại các nhóm cacbonhydrat [58]. Cấu trúc hóa học lập thể quyết
định cơ chế hoạt động của vancomyxin. Vancomyxin có một chuỗi hexapeptit đã glycozyl
hóa, chứa 7 aminoaxit gồm các loại như chloro-β-hydroxytyrozin, p-hydroxylphenylglyxin,
N-metylleuxin và axit aspartic tạo thành bộ khung phân tử vững chắc [13], [43], [53], [64].
1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin
Vancomyxin và các kháng sinh nhóm glycopeptit có hoạt tính kháng vi sinh vật thông
qua việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào. Vị trí mà các tác nhân tấn công vào thành tế bào là
lớp peptidoglycan. Đây là lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi
trường. Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó mà lớp peptidoglycan bị phá hủy thì
tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh động, kết qủa tế bào bị chết [33]. Vancomyxin
ức chế giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan qua 3 giai đoạn [58]:
- Giai đoạn 1: Vancomyxin không xâm nhập vào tế bào chất để ức chế các bước sinh
tổng hợp thành tế bào tiếp theo mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế bào chất. Sự ức chế các
chất màng trên đã ngăn cản chu trình lặp lại các chất mang C55 lipit làm gia tăng sự tích lũy
tiền chất của tế bào chất. Đây là một cơ chế không thường xuyên xảy ra đối với một tác nhân
kháng vi sinh vật bao gồm việc sử dụng cơ chất thay vì điều khiển hoạt tính của enzyme sinh
tổng hợp.
- Giai đoạn 2: Nhờ cấu tạo hình xoắn của phân tử mà gần đây người ta đã phát hiện ra
khả năng kháng vi sinh vật của vancomyxin tác động ngược lại với sự mẫn cảm penixilin. Ở
màng ngoài tế bào vi khuẩn, enzyme transglycosylaza bổ sung các mảnh disacaryl pentapeptit
để hình thành lớp peptidoglycan của tế bào. Sau đó, enzyme transpeptidaza nối các peptit ở
bên trong với các sợi của lớp peptidoglycan ở bên ngoài bề mặt của màng tế bào. Đích tác
dụng của vancomyxin là gắn với các peptit cơ chất, ngăn cản chúng liên kết với vị trí hoạt

3
động của enzyme. Khi đó, phân tử vancomyxin có dạng hình chiếc cốc liên kết với ái lực cao
nhờ bề mặt lõm của nó tạo năm liên kết hydro với đoạn cuối N-acyl-D-Alanyl-D-Alanin của
cầu liên kết chéo peptit chưa nối với pentapeptit.
- Giai đoạn 3: Liên kết của vancomyxin với chuỗi lipit-PP-Glc NAC- pentapeptit là
liên kết vật lý tương đối bền vững đã ngăn cản tác động tiếp theo của

transglycosylaza/transpeptidaza. Vancomyxin không tấn công được disacaryl pentapeptit mà
làm giảm các liên kết đồng hóa trị, giảm tính bền cơ học của lớp peptidoglycan và làm cho tế
bào vi khuẩn dễ dàng bị phân giải nhờ những thay đổi xảy ra do áp suất thẩm thấu.
Vancomyxin có hoạt tính mạnh với các cầu khuẩn và vi khuẩn Gram (+) như:
Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Enterococcus và xoắn khuẩn (Bảng 1.2)
[58], [62]. CKS này có khả năng tiêu diệt tốt vi khuẩn đang ở trong giai đoạn sinh sản, pH tối
ưu là 8,0 và hoạt tính giảm mạnh khi pH dưới 6,0. Điều này được giải thích bởi hai nguyên
nhân: một là do sự khác biệt của cấu trúc thành tế bào giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn
Gram (-). Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram (+) gồm có lớp peptidoglycan dầy, axit
teichoic và axit teichoronic, có thể có hoặc không có màng protein hoặc polysaccarit bao
quanh. Trong khi đó thành tế bào vi khuẩn Gram (-) gồm có lớp peptidoglycan mỏng,
lipopolysacarit, lipoprotein, photpholipit và protein. Trong các tế bào vi khuẩn Gram (-), lớp
peptidoglycan và lớp màng bên trong được bao bọc bởi một lớp màng ngoài ngăn chặn sự
khuếch tán vancomyxin đến lớp peptidoglycan. Ngược lại, lớp peptidoglycan của vi khuẩn
Gram (+) được xác định trên bề mặt ngoài của thành tế bào và do đó nó mẫn cảm với kháng
sinh vancomyxin. Hai là có thể do phân tử glycopeptit là những phân tử lớn, chúng không thể
hòa tan lớp lipit của màng tế bào vi khuẩn Gram (-), do đó khó có thể xâm nhập được vào lớp
bên trong của thành tế bào [40], [58], [71]
1.1.4. Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin
Vancomyxin từng được xem như phương thuốc cuối cùng, chỉ sử dụng sau khi việc
điều trị bệnh bằng các kháng sinh khác không có hiệu quả. Không lâu sau khi được phát hiện,
vancomyxin được xếp vào danh mục những loại dược phẩm hàng đầu và được đưa vào dùng
rộng rãi trong bệnh viện để điều trị các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các vi sinh vật kháng
KS nhóm β-lactam gây nên [15], [58]
Vancomyxin đặc biệt có hiệu quả cao khi dùng trong điều trị các bệnh do MRSA gây
nên, vi khuẩn này là mối nguy hiểm với bệnh nhân cao tuổi, bệnh nhân sau phẫu thuật và
những người có hệ miễn dịch suy giảm [30]. Vancomyxin còn được chỉ định để điều trị cho
các bệnh nhân dị ứng với penixilin, các bệnh nhân không thể sử dụng các loại thuốc như
penixilin hoặc cephalosporin và sử dụng khi những chủng vi sinh vật mẫn cảm với

4
vancomyxin. Dưới tác dụng của vancomyxin tính bền vững vốn có của các cầu khuẩn Gram
(+) đối với penixilin không phát hiện thấy [58]. Mặc dù có nhiều CKS chữa trị các bệnh do vi
khuẩn Gram (+) gây ra đã được công bố trong những năm gần đây, nhưng vancomyxin vẫn là
kháng sinh không thể thay thế trong việc chữa trị những bệnh do Staphyloccus, Enterococcus
và các chủng vi sinh vật kháng nhiều loại kháng sinh thông dụng gây nên [5], [30].
1.2. Streptomyces orientalis VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI SINH TỔNG HỢP
VANCOMYXIN
1.2.1. Streptomyces orientalis
Streptomyces orientalis có khả năng sinh CKS vancomyxin. Lúc đầu, khi mới phát
hiện, xạ khuẩn này có tên là Amycolatopsis orientalis, được xếp vào chi Nocardia, sau đó loài
này được phân loại lại và xếp vào chi Streptomyces, đặt tên là S. orientalis, tuy nhiên, nhiều
tài liệu vẫn gọi tên truyền thống là Amycolatopsis orientalis. Cho đến nay, vẫn chỉ phát hiện
thấy kháng sinh vancomyxin từ loài xạ khuẩn này [23], [26], [31], [35], [51]. S. orientalis
được phân biệt với các loài khác thuộc chi Streptomyces bởi các đặc điểm nuôi cấy, hình thái,
sinh lý, sinh hóa… [23].
1.2.2. Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn
Cũng giống như con đường sinh tổng hợp KS nhóm glycopeptit, vancomyxin được
tổng hợp bằng cách ngưng tụ các đơn vị nhỏ mà mỗi đơn vị này lại được tạo thành từ các con
đường sinh tổng hợp riêng (Hình 1.3).

5
Hình 1.3. Quá trình tổng hợp vancomyxin trong tế bào xạ khuẩn [71]
1.2.3. Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất vancomyxin
1.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy
Theo các tài liệu đã công bố [30], [33], [41], [42], [44], [59], xạ khuẩn S. orientalis sử
dụng trong sản xuất vancomyxin thường phát triển tốt ở nhiệt độ 20-35
o
C, nhiệt độ tối ưu cho
quá trình sinh vancomyxin là 28

o
C, ở nhiệt độ 20
o
C và 35
o
C chủng này sinh trưởng yếu, sinh
khối tích lũy và lượng kháng sinh tạo ra thấp.
Độ pH thích hợp cho tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn thường là trung tính. Tuy nhiên
dải pH cho phép chủng sinh trưởng thường lớn hơn so với pH tối ưu cho hoạt tính sinh tổng
hợp kháng sinh. Đối với xạ khuẩn S. orientalis thì pH thích hợp cho sinh trưởng là 6-8, còn
pH thích hợp cho sinh vancomyxin chỉ từ 6,5-7,5. Môi trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng
trực tiếp đến quá trình sinh kháng sinh [25].
1.3. NGHIÊN CỨU DUY TRÌ VÀ NÂNG CAO HIỆU SUẤT CHỦNG GIỐNG SẢN
XUẤT VANCOMYXIN
Một yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp hoạt chất
sinh học là chủng giống vi sinh vật. Do các chủng VSV dễ bị biến dị và hoạt tính bị thoái hóa
trong quá trình nuôi cấy nhiều lần bởi tác động của môi trường sống của chúng, nên phải tiến
hành chọn lọc thường xuyên chủng giống cho lên men. Phần lớn các chủng sản sinh KS phân

6
lập từ tự nhiên thường có hiệu suất thấp vì thế không thể dùng ngay cho sản xuất [6], [7],
[12], [26]. Để thu được các chủng có khả năng siêu tổng hợp KS, có giá trị trong công nghiệp
cần phải áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo (đột biến cảm ứng). Các phương pháp
hiện đại về sinh tổng hợp, kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, siêu tổng hợp, điều khiển hoạt
động của gen, gây đột biến định hướng, tạo và dung hợp tế bào trần (protoplas)… không
những nâng cao hiệu suất chủng giống trong thời gian ngắn mà còn mở ra phương hướng đầy
triển vọng trong sản xuất các CKS [58].
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT VANCOMYXIN
Người ta phát hiện thấy CKS vancomyxin thường được tổng hợp bởi xạ khuẩn S.
orientalis (trước đây có tên Nocardia orientalis và Amycolatopsis orientalis). Việc phát hiện

ra vancomyxin được coi như cứu cánh cho nhân loại, do có đặc tính chữa bệnh rất cao, phần
nào khắc phục được hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh [58]. Vancomyxin được
đưa vào thử nghiệm chữa bệnh từ năm 1958, và Bộ Y tế Mỹ cho phép sử dụng năm 1964
[71], [72]. Dạng vancomyxin thương phẩm được đóng 500 mg vancomyxin.HCl/lọ, tương
đương 0,34 mmol. VANCOCIN. HCl (Vancomyxin dạng tiêm, USP) của hãng Galaxy được
đóng trong lọ plastic (PL 2040) chỉ sử dụng tiêm tĩnh mạch, làm giảm sự phát triển của vi
khuẩn kháng kháng sinh, bảo vệ hiệu lực của vancomyxin và các thuốc kháng khuẩn khác.
Vancomyxin chỉ nên dùng để chữa hoặc chống nhiễm trùng do vi khuẩn nghi ngờ đã nhờn
thuốc gây nên. Khi dùng vancomyxin trong thời gian dài hoặc quá liều có thể bị giảm thính
giác, gây điếc, tổn thương thận. Ngoài ra vancomyxin chỉ có tác dụng khi tiêm qua đường tĩnh
mạch và không được hấp thụ qua đường tiêu hóa [21], [22]. Vancoxyn, VancoxynD,
VancoxynD IV, “Vancomycin by Abbott | VANCOCIN HCL | VANCOCIN HCL IN” (tên
thương phẩm của vancomyxin) đang được bán trên thị trường thế giới với giá 18,25 USD/ 500
mg vancomyxin dùng để tiêm [72]. Hiện nay, vancomyxin vẫn đang được nghiên cứu hoàn
thiện sản xuất, tăng độ tinh khiết và giảm độ độc của nó [5], [30], [33].










7

CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật
- Chủng S. orientalis 4912 là chủng xạ khuẩn dại, được phòng Công nghệ lên men
mua từ Công ty TG Biotech thuộc Trường Đại học Kyungpook Hàn Quốc (Kyungpook
National University - gọi tắt là KNU).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Bảo quản giống
Chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912 được giữ trong MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 4
o
C
và cấy chuyền lại hàng tháng. Giống sử dụng trong các nghiên cứu được hoạt hoá bằng cách
nuôi trên MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 28
o
C, kéo dài 5-7 ngày. Để bảo quản chủng lâu

dài, giữ giống trong glyxerin ở -20
o
C hoặc -70 đến -80
o
C [2].




8













CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG Streptomyces orientalis 4912
3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy
Chủng S. orientalis 4912 được nuôi trên các môi trường (MT) thạch có thành phần dinh
dưỡng khác nhau. Đây là các MT nuôi cấy đặc trưng để phân loại các chủng xạ khuẩn. Đặc
điểm nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 trên các MT được trình bày ở bảng 3.1. Kết quả

cho thấy, sau 14 ngày nuôi, KTKS của chủng S. orientalis 4912 trên các MT khác nhau đều là
màu trắng. Sau đó xạ khuẩn hình thành bào tử nên bắt đầu có sự thay đổi màu sắc, trên MT
Gauze 1 và ISP-6, KTKS chuyển sang màu đỏ, trên MT Gauze 2 và ISP-4, KTKS chuyển
sang màu vàng nhạt, trong khi vẫn giữ nguyên màu trắng trên MT 48 và MT khoai tây. Chủng
4912 phát triển tốt trên MT Gauze 1 và Gauze 2. Trên các MT, chủng S. orientalis 4912
không sinh sắc tố tan.
3.2. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG Streptomyces
orientalis 4912
Thử nghiệm lên men chủng 4912 với 6 loại MT cơ sở có các nguồn dinh dưỡng khác
nhau là A-4, A-4H, A-9, A-12, Gauze 1 và 48. Kết quả kiểm tra HTKS của chủng S.
orientalis 4912 cho thấy, chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Phổ kháng khuẩn của xạ
khuẩn cũng là một trong những chỉ tiêu phân loại cần được nghiên cứu. Hoạt tính kháng
khuẩn của chủng 4912 được kiểm tra với 5 loại vi khuẩn kiểm định là Bacillus subtilis ATCC

9
6633, Bacillus cereus ATCC 21778, Sarcina lutea M5 và Staphylococcus aureus 209P thuộc
nhóm vi khuẩn Gram dương và Escherichia coli PA2 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm.
3.3. NÂNG CAO HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CHỦNG S. orientalis 4912
Yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp hoạt chất sinh học
là chủng giống vi sinh vật. Để đảm bảo chủng giống luôn có hoạt tính cao, ngoài việc bảo
quản tốt chủng giống bằng các phương pháp giữ giống, người ta còn thường xuyên tuyển
chọn nâng cao hiệu suất bằng các kĩ thuật di truyền.

3.3.1. Thu nhận bào tử và tế bào trần từ chủng S. orientalis 4912

Để thu được bào tử cho xử lý đột biến, chủng S. orientalis 4912 được nuôi trong ống
thạch nghiêng chứa MT 48 từ 8-10 ngày. Nhỏ nước cất vô trùng theo mặt thạch, cạo nhẹ trên
bề mặt để gạt bào tử vào nước và đổ qua dụng cụ lọc để lấy bào tử. Để thu được TBT, chủng
4912 được nuôi trong MT YEME dịch thể, sau đó sinh khối được xử lý với lysozym . Tuy
nhiên, việc tạo TBT phụ thuộc chủ yếu vào thời gian nuôi cấy chủng giống, nồng độ và thời

gian xử lý với lysozym, nồng độ glyxin trong MT nuôi cấy. Cần xác định giá trị các yếu tố
này để thu được kết quả tốt nhất.
3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S.
orientalis 4912
Thời gian nuôi cấy giống có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình hình thành tế bào trần.
Kiểm tra sự tạo thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912 tại các thời điểm sinh trưởng
khác nhau 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Sau 60 phút xử lý sinh khối với lysozym (1 mg/ml), làm
tiêu bản soi kính hiển vi thấy các khuẩn ty bị cắt nhỏ và hình thành tế bào trần. Sử dụng
buồng đếm hồng cầu, đếm số lượng TBT tạo thành, kết quả thể hiện trên hình 3.6 cho thấy,
quá trình tạo tế bào trần từ khuẩn ty ở 48 giờ nuôi cấy diễn ra khá nhanh và có hiệu quả nhất.
3.3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lysozym tới khả năng hình thành tế bào trần của
chủng S. orientalis 4912
Giống nuôi 48 giờ, sau đó xử lý bằng lysozym với nồng độ 1 mg/ml từ 30 đến 120 phút.
Trong quá trình thí nghiệm, làm tiêu bản soi kính hiển vi thấy sau 30 phút các đoạn khuẩn ty
bị cắt, tế bào trần cũng được tạo thành, sau 60 phút lượng tế bào trần tạo thành rất nhiều, sau
90 phút số lượng tế bào trần ít đi, có thể một số tế bào trần đã bắt đầu bị phá hủy. Kết quả trên
cho thấy khả năng tạo tế bào trần và khả năng bền vững của tế bào trần phụ thuộc nhiều vào
thời gian xử lý lysozym. Tại thời điểm trước 60 phút lượng tế bào trần tạo ra là chưa đáng kể,
sau 90 phút thì các tế bào trần tạo ra bắt đầu bị phá huỷ, do đó thời gian xử lý thích hợp nhất
là từ 60-70 phút, lượng tế bào trần tạo ra nhiều nhất và ổn định nhất. Nếu kéo dài thời gian xử

10
lý hơn nữa, lysozym sẽ phá hủy các TBT vừa tạo thành. Làm tiêu bản soi kính hiển vi, dùng
buồng đếm hồng cầu đếm số lượng TBT tạo thành, kết quả được thể hiện ở hình 3.7.
3.3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ lysozym tới khả năng hình thành tế bào trần của
chủng S. orientalis 4912
Giống nuôi 48 giờ, sau đó xử lý lysozym với nồng độ từ 0,5 đến 4 mg/ml trong 60 phút.
Kết thúc thí nghiệm, làm tiêu bản soi kính hiển vi và đếm số lượng TBT. Kết quả trên bảng
3.3 cho thấy, khả năng tạo tế bào trần và khả năng bền vững của tế bào trần tốt nhất khi xử lý
với lysozym ở nồng độ 1 mg/ml. Tại nồng độ 0,5 mg/ml, do ít enzym nên lượng tế bào trần

tạo ra chưa đáng kể. Sau 60 phút xử lý ở nồng độ 2 mg/ml trở lên, do nồng độ lysozym cao
nên các tế bào trần tạo ra bị enzym phá huỷ gần như hoàn toàn.
3.3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glyxin tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S.
orientalis 4912
Khi nuôi xạ khuẩn trong MT có chứa glyxin thì sự sinh trưởng sẽ bị ức chế. Theo Baltz,
sự sinh trưởng của chủng xạ khuẩn S. fradiae trong MT có 0,4% glyxin bị chậm lại, cụ thể là
thời gian nhân đôi của tế bào kéo dài từ 1,6 giờ lên tới 2,7 giờ. Mặc dù vậy nhưng glyxin có
tác dụng làm cho thành tế bào của xạ khuẩn mẫn cảm hơn với lysozym. Đó là do glyxin đã
thay thế D-alanin trong phân tử peptidoglycan của thành tế bào làm cho lysozym dễ tác động
vào mối liên kết glycozit. Vì vậy, khi muốn tạo tế bào trần ở xạ khuẩn, glyxin thường được
lựa chọn để bổ sung vào MT nuôi cấy. Để quá trình tạo tế bào trần diễn ra nhanh và hiệu quả
thì việc tìm ra nồng độ glyxin thích hợp là rất cần thiết. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu thì
thành tế bào của các loài xạ khuẩn mẫn cảm với lysozym khác nhau [24]. Vì thế, nồng độ
glyxin thích hợp cho tạo tế bào trần mà không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của các loài xạ
khuẩn cũng khác nhau.
3.3.2. Nâng cao HTKS của chủng S. orientalis 4912 bằng phƣơng pháp gây đột biến
dùng tia UV và N-metyl-N
’
-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)
3.3.2.1. Xác định tỷ lệ sống sót của chủng S. orientalis 4912 sau khi chiếu tia UV và xử lý
bằng MNNG
Để xây dựng đường cong sống sót khi xử lý với tia UV, dịch bào tử và TBT được xử lý
với khoảng cách 20 cm. Sau thời gian xử lý từ 0 - 80 giây, cấy lên đĩa thạch MT 48 (với bào
tử) và R2YE (với TBT), nuôi trong tủ ấm ở 28-30
o
C trong 5 ngày. Đồ thị sống sót của tế bào
trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi gây đột biến cho thấy (Hình 3.8), thời gian
chiếu UV càng lâu thì tỷ lệ sống sót càng giảm. Thời gian chiếu là 30 giây, tỷ lệ bào tử sống
sót là 26,8% và TBT là 12,6%. Thời gian chiếu là 40 giây tỷ lệ sống sót của bào tử còn
10,10% và tế bào trần là 8,6%; thời gian chiếu 50 và 60 giây tỷ lệ TBT sống sót là 3,2% và

11
0,03%; bào tử là 4,22 và 0,1%. Thời gian chiếu là 70 giây số cá thể sống không tồn tại. Rõ
ràng khả năng tác động của tia UV lên tế bào trần của chủng 4912 mạnh hơn lên bào tử. Điều
này phù hợp với quy luật tự nhiên.
3.4. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BIẾN CHỦNG Streptomyces orientalis
4912-81-61
Chủng 61 có khả năng ức chế các vi sinh vật kiểm định như Bacillus subtilis ATCC 6633, B.
cereus ATCC 21778, Sarcina lutea M5 và Staphylococcus aureus 209P và Escherichia coli
PA2, nhưng ở mức độ mạnh hơn so với chủng 4912 do có HTKS cao hơn chủng gốc. Giống
như chủng 4912, chủng 61 cũng sử dụng tốt các nguồn đường thông dụng như glucoza,
sacaroza, fructoza, lactoza, maltoza… Ngoài ra chủng 61 còn có khả năng sinh ra các enzym
thủy phân tinh bột, cazein, gelatin, pepton hóa sữa nên sẽ thuận lợi cho việc lựa chọn các
nguồn dinh dưỡng khi lên men sản xuất vancomyxin trong điều kiện Việt Nam.
Bảng 3.10. Một số đặc điểm sinh học của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
Các chỉ tiêu
Chủng 61
Chủng 4912
Khuẩn lạc trên MT 48
Tròn, đường kính 6-8mm,
không xẻ thùy, bề mặt
khô, có mấu lồi ở trung
tâm
Tròn, bề mặt xù xì, khô và nhăn
nheo tạo thành các nếp gấp, có
mấu lồi ở trung tâm, có các vết
nứt màu nâu nhạt, đường kính
3-5mm
KTKS
Màu trắng, dạng sợi mảnh

phân nhánh, bện chặt làm
bề mặt khuẩn lạc như
màng dẻo
Màu trắng, dạng sợi mảnh phân
nhánh
KTCC
Màu trắng
Vàng nhạt
Tạo bào tử
Có
Có
Sử dụng glucoza, sacaroza
Có
Có
Phân giải xenluloza
Không
Không
Phân giải cazein
Có
Có
Phân giải gelatin
Có
Có
Khả năng pepton hoá sữa
Có
Có
Thuỷ phân tinh bột
Có
Có
Hình thành melanin

Không
Không
Nhiệt độ tối ưu cho sinh
trưởng (
o
C)
28 - 30
28 - 30
pH tối ưu cho sinh trưởng
6 - 8
6 - 8
Khả năng chịu muối (%)
< 6
< 6


12
3.5. TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH LÊN MEN BIẾN CHỦNG Streptomyces orientalis
4912- 81- 61
Các bước tiến hành như đối với chủng S. orientalis 4912 gốc. Kết quả nhận được như
sau:
3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nhân giống
Nuôi chủng 61 trên một số MT như đã thí nghiệm với chủng 4912: Gauze 1; A-4; A-
4H; TH
4
-47; A-12; A-9 và 48 trong bình tam giác 500 ml trên máy lắc tốc độ 220 vòng/phút,
kéo dài 120 giờ, ở 28
o
C, thể tích MT là 75 ml. Kết quả trên bảng 3.25 cho thấy, chủng 61
cũng phát triển tốt nhất trên MT 48, sinh khối khô đạt 6,0 mg/ml. Thành phần MT 48 đơn

giản chỉ gồm cao nấm men (Việt Nam) và tinh bột tan, hai nguồn này rẻ tiền và rất sẵn có tại
thị trường trong nước, do vậy MT 48 được chọn làm MT nhân giống.
3.5.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men
Trên 11 MT lên men cơ bản cho xạ khuẩn sinh kháng sinh MT 1 - MT 11, chủng S.
orientalis 4912-81-61 đều có khả năng sinh trưởng và sinh CKS, tuy nhiên có sự khác biệt rất
lớn. HTKS được xác định theo phương pháp Dmitrieva, dao động trong khoảng 1609-1889
mcg/ml. Căn cứ vào kết quả thu được thì lên men trên MT 5 HTKS của chủng lớn nhất, là
1889 mcg/ml. MT 5 có thành phần như sau được lựa chọn để nghiên cứu tiếp (g/l): Glucoza
15; khô đậu tương 15; pepton 5; NaCl 2,5; CaCO
3
2; pH 6,5-7,0.

3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S.
orientalis 4912-81-61
Với mục đích nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp
vancomyxin, nhằm tối ưu các điều kiện lên men và thành phần MT sử dụng nguồn nguyên
liệu trong nước, chủng S. orientalis 4912-81-61 được nuôi trong bình tam giác có thể tích 500
ml, trên máy lắc 220 vòng/phút, kéo dài 120 giờ.
3.5.3. Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S.
orientalis 4912-81-61 trong thiết bị lên men Bioflo
Để xác định được thời điểm thu hồi CKS thích hợp nhất cần nghiên cứu động thái quá
trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng 61. Thí nghiệm được thực hiện trong
thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích 14 lít với các điều kiện lên men đã xác định được ở mục
trên.
Kết quả trình bày trên hình 3.13 cho thấy, biến chủng 61 phát triển tốt trong bình lên
men, đặc biệt từ giờ 48 sinh khối của chủng tăng nhanh đạt 5,8 mg/ml. Cũng tại thời điểm này
chủng bắt đầu sinh CKS, tới 120 giờ nồng độ đạt cực đại 2983 mcg/ml và sinh khối đạt 9,8

13
mg/ml. Trong 24 giờ đầu lượng đường giảm ít, nhưng sau thời điểm đó thì chủng phát triển

mạnh và tiêu thụ đường với tốc độ nhanh chóng. Như vậy 120 giờ là thời điểm thích hợp để
thu hồi CKS, nếu kéo dài thêm thì HTKS của chủng bị giảm xuống.







KẾT LUẬN

1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912 cho thấy,
chủng này có khả năng sử dụng nhiều nguồn đường; sinh trưởng tốt nhất trong khoảng nhiệt
độ 28-30
o
C và pH 6-9; có khả năng chịu NaCl đến 6% và không sinh xenlulaza. Chủng 4912
có hoạt phổ kháng khuẩn rộng và mạnh, ức chế được cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm.
2. Bằng phương pháp gây đột biến tế bào trần từ chủng S. orientalis 4912 dùng N-
metyl-N
‟
-nitro-N-nitrosoguanidin, đã chọn lọc được biến chủng ký hiệu S. orientalis 4912-81-
61 có hoạt tính kháng sinh cao nhất, cao hơn chủng gốc 94,3 %.
3. Môi trường lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61 sản xuất vancomyxin đã
được tối ưu hóa với thành phần như sau (g/l): đường kính 51,8; glucoza 17; bột đậu tương
30,6; NaCl 2,5; CaCO
3
2; CaCl
2
.2H
2

O 0,04; CuSO
4
.5H
2
O 0,01; pH ban đầu 7,0. Với môi
trường này, lên men biến chủng 4912-81-61 trong thiết bị Bioflo 110 dung tích 14 lít cho
lượng kháng sinh cực đại đạt 2983 mcg/ml ở 120 giờ, tăng 3,44 lần so với chủng gốc 4912
ban đầu.

References

Tiếng Việt
1. Bộ Khoa học và Công nghệ (2003), Báo cáo tổng kết đề tài KC 04 -09: “Nghiên cứu
áp dụng công nghệ sản xuất các kháng sinh mới hiệu quả cao bằng nguyên liệu trong
nước”, Hà Nội.

14
2. Egorov N. X. (1976), Thực tập vi sinh vật học (Nguyễn Lân Dũng dịch), Nhà xuất
bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu nâng cao họat tính kháng sinh của chủng
Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật dung
hợp tế bào trần, Luận án tiến sỹ sinh học, Hà Nội.
Tiếng Anh
4. Alfonso R. G. (2000), The Science and Practice of Pharmacy, Lippicatt Willium &
Wilkins.
5. Allen N. E., Nicas T. I. (2003), “Mechanism of action of oritavancin and related
glycopeptide antibiotics”, FEMS Microbiology Reviews 26, pp. 511- 532.
6. Anne J., Mellaert L. V., Eyssen H. (1990), “Optimum conditions for efficient
transformation of Streptomyces venezuelae protoplasts”, Applied Microbiology and
Biotechnology 32 (4), pp. 431-435.

7. Anupama M., Narayana K. J. P., Vijayalakshmi M. (2007), “Screening of Streptomyces
purpeofuscus for antimicrobial metabolites”, Research Journal of Microbiology
2(12), pp. 992-994.
8. Atta H. M., Dabour S. M., Desoukey S. G. (2009), “Sparsomycin antibiotic production by
Streptomyces Sp. AZ-NIOFD1: Taxonomy, fermentation, purification and biological
activities”, American-Eurasian Journal Agricultural and Environment Science 5(3),
pp. 368-377.
9. Ayar-Kayali H., Tarhan L. (2006), “Vancomycin antibiotic production and TCA-
glyoxalate pathways depending on the glucose concentration in Amycolatopsis
orientalis”, Enzyme and Microbial Technology 38, pp. 727–734.
10. Bates J. (1997), “Epidemiology of vancomycin – resistant enterococci in the
community and the relevance of farm animals to human infection”, Journal of
Hospital Infection 37, pp. 89-101.
11. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (1989), Williams & Wilkins, Baltimore,
USA, Vol. 4.
12. Carneiro-da-Cunha M. G., de Filho J. L. L., de Campos-Takaki G. M. (2002), “Protoplast
formation and regeneration from Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 and
clavulanic acid production”, Brazilian Journal of Microbiology 33, pp. 347-351.
13. Chilukuri S. P. S., Tutika S. R., Pulipaka S. N. H. R. R., Uppuleti V. P. (2002), “Assay of
vancomycin and dotabumin using sodium metaperiodate”, Microchimica Acta 140,
pp. 109-118.

15
14. Demain A. L. (1981), “Industrial Microbiology”, Science 214, pp. 987-995.
15. Derek J. H. (2006), “Production of antibiotics fermentation”, In: Ratledge C., B.
Kristiansen eds., Basic Biotechnology, Cambridge University Press, Cambridge, 3
th
,
pp. 518-534.
16. Diana J., Visky D., Roets E., Hoogmartens J. (2003), “Development and validation of an

improved method for the analysis of vancomycin by liquid chromatography, Selective
of reversed-phase column towards vancomycin components”, Journal of
Chromatography I 996, pp. 115-131.
17. Dunstan G. H., Avignone-Rosa C., Langley D., Bushell M. E. (2000), “The vancomycin
biosynthetic pathway is induced in oxygen-limited Amycolatopsis orientalis (ATCC
19795) cultures that do not produce antibiotic”, Enzyme and Microbial Technology
27, pp. 502-510.
18. Farber B. B. (1984), “Vancomycin: Renewed interest in an old drug”, Europe Journal
Clinical Microbiology 3, pp. 1-3.
19. Garrity G. M., Bell J. A. and Lilburn T. G. (2004), “Taxonomic outline of the
prokaryotes”, In: Bergey’s manual of the systematic bacteriology, Williams &
Wilkins, Baltimore, USA, 2
nd
edition.
20. Heck A. J. R., Bonnici P. J., Breukink E., Morris D., Wills M. (2001), “Modification and
inhibition of vancomycin group antibiotics by formaldehyde and acetaldethyde”,
European Journal of Organic Chemistry 7(4), pp.910-916.
21. Hilgendor P., Heiser V., Diekmann H., Thoma M. (1987), “Constant dissoved oxygen
concentrations in cephlosporin C fermentation: Applicability of different controllers
and effect on fermentation parameters”, Applied Microbiology and Biotechnology 27,
pp. 247-251.
22. Holder I. A., Neely A. N. (1998), “Vancomycin resistant enterococci”, Bunrs 24, pp. 389-
391.
23. Hopwood D. A (2007), Streptomyces in nature and medicine, Oxford University Press,
New York, pp. 8-28.
24. Hopwood D. A., Bibb M. J., Chater K. F, Kieser T., Bruton C . J., Kieser H. M., Lydiate
D. J., Smith C. P., Ward J. M. (1985), Genetic manipulation of Streptomyces, A
laboratory manual, F. Crowe & Sons, Norwich, England, pp. 35 – 41.
25. Hyun H. H, Jung H. M., Kim S. Y., Lee J. K., Yoo S. R (2001), “Amycolatopsis
orientalis mutant strain producing vancomycin and fermentation method of

vancomycin using the same”, Korean Patent 0421712.

16
26. Ismail A. (2006), “Numerical assessment of mycelium color in classification of some
Streptomyces isolates”, International Journal of Agriculture

Biology 8(6), pp. 872-
875.
27. Jensen S. E. and Demain A. L. (1995), “Beta-lactams”, Genetics and biochemistry of
antibiotics production, Butterworth-Heinemann, Newton, Mass, pp. 239-268.
28. Johnson J. L. H., Yalkowsky S. H. (2006), “Refomulation of a new vancomycin analog:
An example of the importance of buffer species and strength”, American Association
of Pharmaceutical Science Technology 7(1), Article 5, pp. 1-5.
29. Jung H. M., Kim S. Y., Hyun H. H., Lee J. K. (2002), “Ca
2+
and Cu
2+
supplementation
augments vancomycin production by Amycolatoppsis orientalis”, Biotechnology
Letters 24, pp. 293 – 296.
30. Jung H. M., Kim S. Y., Moon H. J., Oh D. K., Lee J. K (2007), “Optimization of culture
conditions and scale-up to pilot and plant scale for vancomycin production by
Amycolatopsis orientalis”, Applied Microbiology Biotechnology 77, pp. 789-795.
31. Kampfer P., Kroppenstedt R. M., Dott W. (1991), “A numerical classification of the
genera Streptomyces and Streptoverticillium using miniaturized physiological test”,
Journal of Genetic Microbiology 137, pp.1831-1891.
32. Kim K. S., Cho N. Y., Pai H. S., Ryu D. D. Y. (1983), “Mutagenesis of Micromonospora
rosaria by using protoplasts and mycelia fragments”, Applied and Environmental
Microbiology 46(3), pp. 689-693.
33. Kim S. Y., Kim D. S., Jung H. M., Lee J. K. (2008), “Mutant strain of Amycolaptosis

orientalis and process for preparing vancomycin hydrochloride”, European patent
application EP 1959006A1.
34. Koch A. L. (2003), “Bacterial wall as target for attack: Past, Present, and Future
research”, Clinical Microbiology Reviews 16, pp. 673-687.
35. Kothe H.W., Vohis G., Kroppenstedt R. M. and Henssen A. (1989), “A taxonomic study
of Mycolateless, wall chemotype IV Actinomyces”, Systematic Applied
Microbiology 12, pp. 61-69.
36. Lawrence M. T. (2001), Current Medical Diagnosis and Treatment, Mc. Graw Hill,
USA.
37. Lessard I. A. D., Pratt S. D., Mccafferty D. G., Bussiere D. E., Hutchins C., Wanner B.
L., Waslch L. K. (1998), “Homologs of the vancomycin resistance D-Ala- D-Ala
dipeptidase Van X in Sreptomyces toyocaensis, Escherichia coli and Synechicystis:

17
attributes of catalytic efficiency, stereoselectivity and regulation with implication for
function”, Chemistry & Biology 5(9), pp. 489-504.
38. Martins R. A., Giumarães L. M, Pambukian C. R., Tonso A., Facciotti M. C. R.,
Schmidell W. (2004), „„The effect of dissolved oxygen concentration control on cell
growth and antibiotic retamycin production in Streptomyces olindensis S20
fermentations”, Brazilian Journal of Chemical engineering 21(2), pp. 185-192.
39. Matsushima P., McHenney M. A., Baltz R. H. (1987), "Efficient transformation of
Amycolatopsis orientalis (Nocardia orientalis) protoplasts by Streptomyces
plasmids”, Journal of Bacteriology 169, pp. 2298-2300.
40. McCornick M. H., McGuire J. M. and L. (1962), “Vancomycin and method for its
preparation”, US Patent 622264.
41. Mclntyre J. J., Bull A. T., and Bunch A. W. (1996), “Vancomycin production in batch
and continuous culture”, Biotechnology and Bioengineering 49, pp. 412-420.
42. Mclntyre J. J., Bunch A. W., and Bull A. T. (1999), “Vancomycin production is enhanced
in chemostat culture with biomass-recycle”, Biotechnology and Bioengineering 62,
pp. 576-582.

43. Mulichak A. M., Losey H. C., Walsh C. T., Garavito R. M. (2001), “Structure of the
UDP-Glucosyltransferase GtfB that modifies the heptapeptide aglycone in the
biosythesis of vancomycin group antibiotics”, Structure 9, pp. 547-557.
44. Nagarajan R. (1991), “Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and
related glycopeptides”, Antimicrobiology Agents Chemotherapy 35, pp. 605-609.
45. Nagy M., Miklos J., Istvan F., Ilona V., Geza K., Viola M., Andrasi A., Laszlo K.,
Gabriella Z., Marta S. nee Z., Endre K., Agnes U., Mihaly G. (1993), “Process for the
preparation of vancomycin”, US patent 5223413.
46. Narayana K. J. P., Prabhakar P., Vijayalakshmi M., Venkateswarlu Y., Krishna P. S. J.
(2008), “Study on bioactive compounds from Streptomyces sp. ANU 6277”, Polish
Journal of Microbiology 57(1), pp. 35-39.
47. Padma P. N., Rao A. B., Yadav J. S., Reddy G. (2002), “Optimization of fermentation
conditions for production of glycopeptide antibiotic vancomycin by Amycolatopsis
orientalis”, Applied Biochemistry and Biotechnology 103, pp. 395-406.
48. Peter F. S (2000), “Fermentation technology”, In: Walker J. M., Rapley R., Molecular
Biology and Biotechnology, Royal Society of Chemistry Publishing, Cambridge, 4
th
,
pp 1-24.

18
49. Punita M., Pradeep S., Subir K. (2005), “A comparative evalution of oxygen mass
transfer and broth viscosity using Cephalosporin C production as a case strategy”,
World Journal of Microbiology and Biotechnology 21, pp. 525-530.
50. Radhakrishnan M., Balaji S., Balagurunathan R. (2007), “Thermotolerant actinomycetes
from the Himalayan mountain-antagonistic potential, characterization and
identification of selected strains”, Malaysian Applied Biology 36 (1), pp. 59-65.
51. Robert E.W. H., Daniel S. C. (1999), “Peptide antibiotics”, Antimicrobial agents and
chemotherapy 43, pp. 1317 – 1323.
52. Sahin N., Ugur A. (2003), “Investigation of the Antimicrobial Activity of Some

Streptomyces Isolates”, Turkey Journal Biology 27, pp. 79-84.
53. Sattur A. P., Lee J. H., Song K. B., Panda T., Kim C. H., Rhee S. K., Gokul B. (2000),
“Analytical techniques for vancomycin”, Biotechnology Bioprocess Engineering 5, pp.
153-158.
54. Schmidt F. R. (2005), “Optimization and scale up of industrial fermentation processes”,
Applied Microbiology Biotechnology (●), pp. 1-11.
55. Sherling, E.B. and D.Gottlieb (1966), “Methods for characterization of Streptomyces
species”, International Journal of Systematic Bacteriology 16(3), pp .313-340.
56. Srinivasan A., Dick J.D., and Perl T.M. (2002), “Vancomycin resistance in
staphylococci”, Clinical Microbiology Reviews 15 (3), pp. 430-438.
57. Staroske T. and William D. H. (1998), “Synthesis of covalent head to tail dimers of
vancomycin”, Tetrahedron Letters 39, pp 4917 – 4920.
58. Sussmuth R. D. (2006), “The chemistry and biology of vancomycin and other
glycopeptide antibiotic derivatives”. In: Liang X. T., Fang W. S., eds, Medicinal
chemistry of bioactive natural products, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp.
35-52.
59. Tarhan L. and Ayarkayali H. (2005), “Variations of vancomycin production by
Amycolatopsis orientalis depending on the glucose and glycerol concentrations as
carbon sources”, Trakya University Journal Science, Turkey 6 (2), pp 108-115.
60. The Columbia Electronic Encyclopedia (2007), Production of Antibiotics, Columbia
University Press, 6
th
.
61. Tresner H. D., Backus E. J. (1963), “System of color wheels for Streptomycete
taxonomy”, Applied Microbiology 11, pp. 335-338.
62. Vila M. M. D. C., Salomao A. A., Tubino M. (2008), “Flow injection analysis of
vancomycin”, Ecletica Quimica 33(2), pp. 62-72.

19
63. Vladimir B. (1975), Methods in Enzymology, The University of Leningrad, Leningrad,

VXLIII, pp. 100-123.
64. Yan H., Cheng X. and He B. (1998), “Calculation of concentrations of equilibrum
components in an vitro activity test of vancomycin antibiotics and the possible mode
of action”, Biophysical Chemistry 74, pp. 107 -115.
65. Yong G. E., Yongping L., Xue-ying P., Jin, Jian Z. C., Jun R. L. (2003), “Vancomycin
producing strain and optimization of the fermentation medium”, Chinese Journal of
Antibiotics 28(3), pp. 134-143.
66. Waksman S. A. (1961), “Classification, idetification and description of the genera and
species”, In: The Actinomycetes, Vol.2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore.
67. Williams S. T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E.M., Sneath P.H.A. and Sackin
M.J. (1983), “Numerical classification of Streptomyces and related genera”, Journal
of Genetic Microbiology 129, pp.1743-1813.
68. Witt D. and Stackebbandt E. (1990), “Unification of the genera Streptomyces and
Streptoverticillium and amendation of Streptomyces Waksman and Henrici 1443”,
Systematic Applied Microbiology 13, pp. 361- 371.
69. Wright G.(2005), “Glycopeptide biosynthesis”, MAC Biochemistry 30, pp.1-3.
70. KCTC Strain Database. Online Catalogue.
71.
72.