Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ SV tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn acetobacter xylinum BHN2

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài này là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận tốt nghiệp là trung thực nếu sai tôi
xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Hà nội, tháng 05 năm 2011
Tác giả

Nguyễn Duy Khanh

GVHD: Phương Phú Công

i

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến TS. Phương Phú Công đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ trong
suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.

Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô và các bạn sinh viên đang học
tập và làm việc tại Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã
giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề
tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, nhưng người thân, bạn bè
đã quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn !
Hà nội, tháng 5 năm 2011
Sinh viên

Nuyễn Duy Khanh

GVHD: Phương Phú Công

ii

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU…………………………………………………………..1
1. Lý do chọn đề tài......................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài.................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu.................................................................................2
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài......................................................................2

PHẦN NỘI DUNG.......................................................................................3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................3
1.1. Đại cương về vi khuẩn A. xylinum và màng BC..................................3
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A. xylinum.........................................3
1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum......................................................4
1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn A. xylinum.......................................................................................5
1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose.............................................................5
1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4................................................5
1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O...........................................5
1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4...................................................6

GVHD: Phương Phú Công

iii

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn A. xylinum..........................................................................................6
1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống.....................6
1.3.2. Độ thông khí.......................................................................................7
1.3.3. Nhiệt độ………………………………………………………...…...7
1.3.4. Độ pH.................................................................................................7

1.4. Ứng dụng của màng BC........................................................................8
1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực............................................8
1.4.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng...........................................8
1.5. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới...........9
1.5.1. Trên thế giới………………………………………………………....9
1.5.2. Ở Việt Nam..........................................................................................9
1.6. Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài.......................10
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............12
2.1. Vật liệu.................................................................................................12
2.1.1. Vật liệu chính....................................................................................12
2.1.2. Hoá chất và thiết bị...........................................................................12
2.1.2.1. Hoá chất………………………………………………………….12
2.1.2.2. Thiết bị...........................................................................................12
2.1.3. Môi trường........................................................................................13

GVHD: Phương Phú Công

iv

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1)................................................13
2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)...........................................13
2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng...................................13
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................14

2.2.1. Phương pháp hoạt hóa giống A. xylinum BHN 2 ...............................14
2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A. xylinum BHN 2 ..14
2.2.3. Phương pháp bảo quản chủng giống A. xylinum BHN 2 trên môi trường
thạch nghiêng...................................................................................14
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ chủng
A. xylinum BHN 2 .............................................................................15
2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt
nhất từ chủng A. xylinum BHN 2 ............................................................15
2.2.4.2. Phương pháp xác định dai (độ bền cơ học) của màng BC.............16
2.2.4.3. Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến
khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 ………………...........17
2.2.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ S/V thích
hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 .....17
2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả…………………………....18
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................19

GVHD: Phương Phú Công

v

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn

A.

xylinum BHN 2 ........................................................................................19
3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC của chủng
A. xylinum BHN 2 với tỷ lệ S/V=0,8..................................................24
3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC của chủng
A. xylinum BHN 2 với tỷ lệ S/V=0,8............................................................29
PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................33
1. Kết luận...................................................................................................33
2. Đề nghị…………………………………………………………………33
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................34

GVHD: Phương Phú Công

vi

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH ẢNH

Hình 3.1: Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với khối lượng màng……………21
Hình 3.2: Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với độ bền kéo màng……………21
Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC……………..23
Hình 3.4: Thể hiện mối quan hệ giữa thời gian với khối lượng màng……....26
Hình 3.5: Thể hiện mối quan hệ giữa thời gian với độ bền kéo màng………26
Hình 3.6: Hình ảnh khối lượng màng sau 5 ngày nuôi cấy……………….…28

Hình 3.7: Thể hiện mối quan hệ giữa nhiệt độ với khối lượng màng……….31
Hình 3.8: Thể hiện mối quan hệ giữa nhiệt độ với độ bền kéo màng…….....31

Bảng 2.1: Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu ……………………….16
Bảng 3.1: Nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ vi
khuẩn A. xylinum BHN2 ………………………………………….……........20
Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng
BC từ chủng A. xylinum BHN 2 với tỷ lệ S/V=0,8…………………….……...25
Bảng 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy với tỷ lệ S/V=0,8 đến
khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 …………….……………30

GVHD: Phương Phú Công

vii

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

 A.xylinum : Acetorbacter xylinum
 BC

: Bacterial cellulose

 Cs

: Cộng sự

 g

: gam

 N

: Niu tơn

 PC

: Plant cellulose

 S

: Diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm2)

 S/V

: Tỷ lệ diện tích bề mặt lên men trên thể tích

dịch
lên men tạo màng (cm 1 )
 V

GVHD: Phương Phú Công

: Thể tích dịch lên men tạo màng ( cm3)

viii

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

PHẦN MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và
đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose
thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin,
hemicellulose, peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đặc tính vượt trội
với độ dẻo dai, bề chắc [14].
Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho
quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế
bào,dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm
môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc
biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay
thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị
các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người [10].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ
khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí
nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A. xylinum BHN 2 có khả
năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ
chủng A. xylinum BHN 2 có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở
để tạo ra màng trị bỏng cho người.

GVHD: Phương Phú Công

1

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Với mục đích tìm hiểu diện tích và thể tích liên quan đến độ thoáng khí trong
quá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi tĩnh tôi chọn đề tài:
“ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn Acetobacter xylinum BHN 2 ”
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn
A. xylinum BHN 2 phân lập từ nguồn nguyên liệu từ phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 .
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 .
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn
A. xylinum BHN 2 .

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 .
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 .
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Bổ sung thêm các kiến thức về vi khuẩn A. xylinum nhằm tạo màng BC
được tốt nhất có triển vọng ứng dụng vào một số lĩnh vực trong cuộc sống,
đặc biệt là lĩnh vực y học .

GVHD: Phương Phú Công

2

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

PHẦN NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về vi khuẩn A. xylinum và màng BC
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. xylinum
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum thuộc
giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp
Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số
tác giả coi A. xylinum như một loài phụ của A. Aceti [12].
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay
không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc

điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi
trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi.
Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt
2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn
và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [18].
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A. xylinum
Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ 25-350C, pH = 4-6. Nhiệt độ
và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả trong môi trường tối ưu.
A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm
acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [8].
Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A. xylinum bao gồm: Oxy
hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính;

GVHD: Phương Phú Công

3

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid;
Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng
hợp cellulose [8].
1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A. xylinum

hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những
bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay
màng BC.
* Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch
thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính lại khác xa nhau.
Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo
thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi
lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó
và cuối cùng tạo dải ribbon. Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm.
Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon
của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc
mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy [13].
Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết
tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học
cao, khả năng hấp thụ nước lớn.
Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum được nghiên cứu đầu
tiên bởi Brown. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những

GVHD: Phương Phú Công

4

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính
của cellulose [13].
1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC
từ vi khuẩn A. xylinum
1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose
Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng
hợp cellulose của A. xylinum. Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ Nguyễn
Thị Nguyệt trên chủng A. xylinum HN5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn
nhất đến sự hình thành màng của A. xylinum là glucose. Để tạo màng phục vụ
mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã quyết định sử dụng hàm
lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu trên chủng A. xylinum BHN 2 [10]
[11].
1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4
Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống để
xây dựng tế bào. Nhân tố (NH4)2SO4 là một trong những nhân tố có ảnh
hưởng lớn đến sự phát triển của A. xylinum, là nhân tố quan trọng cung cấp
nguồn nitơ cho tế bào phát triển. Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trường
quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá
trình tạo màng BC. Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao
nhất [5] [7].
1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O
MgSO4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS-TS Đinh Thị
Kim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những

GVHD: Phương Phú Công

5

SV: Nguyễn Duy Khanh

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình
thành màng BC [9].
1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4
Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có
vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A. xylinum. Sử
dụng nồng độ 2g/l KH2PO4 sẽ cho sản lượng BC cao nhất [6].
1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn A.xylinum
1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống.
Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng
trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn.
Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ
kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng.
Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính
chất cơ học của màng BC. Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh
dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng
cung cấp cho hoạt động sống của tế bào.
Đối với loài A. xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các tế bào
liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt nuôi cấy.
Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dich thể. Vì vậy
việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho phù hợp có ý
nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao nhất. Sản lượng
cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ giống và thời
gian lên men [5].

GVHD: Phương Phú Công

6

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

1.3.2. Độ thông khí
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện tiên
quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của quá
trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ
thông khí quyết định năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và
sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao
trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng,
thoáng và lớp môi trường mỏng [11].
Wan phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành
cellulose vi khuẩn. Cellulose hình thành dưới áp suất oxy thấp có sự phân
nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất oxy cao. Do đó ảnh hưởng
trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng BC [19].
1.3.3. Nhiệt độ
0

Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A. xylinum từ 25-35 C. Ở nhiệt độ thấp
quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến
mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm

[15].
1.3.4. Độ pH
Vi khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp.
Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá
môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn
sự phát triển của vi sinh vật có hại [16].

GVHD: Phương Phú Công

7

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

1.4. Ứng dụng của màng BC
1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực
Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ
bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả
năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề
dày của vi sợi dưới 100nm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh
học, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có các
ứng dụng đa dạng trong nhiều lãnh vực như y học, thực phẩm, mỹ phẩm, bảo
vệ môi trường, công nghiệp [5] [7] [10].
1.4.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày.
Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại

di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh.
Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận
khoảng hơn 400 ca bỏng. Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi.
Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng.
Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc
biệt quan trọng. Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng
làm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho
quá trình tái tạo phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại
chỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm
khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và
dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức
hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biểu mô hóa hình

GVHD: Phương Phú Công

8

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật [7] [11].
1.5. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới
1.5.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A.xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, dùng màng
BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang

đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown, Jonas và Farad, dùng
màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang,
làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm.
Đặc biệt Brown đã dùng BC làm vải đặc biệt, Jonas và Farad dùng màng BC
để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protêin hay cho sắc kí
[13] [17].
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả Wan và Millon sử
dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt.
Đặc biệt tác giả Wan đã đượng đăng kí bản quyền về làm màng BC từ
A.xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad, đã dùng màng BC làm
da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [17] [19].
1.5.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải
tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số
màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử
dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng … Từ
năm 2000 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã có

GVHD: Phương Phú Công

9

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

một số công trình nghiên cứu về màng BC từ A. xylinum và bước đầu nghiên
cứu về các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học
dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [7].
Điều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp dụng
từ rất lâu và phổ biến ở tất cả các nước. Các thuốc này có sẵn trong thiên
nhiên và có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết
thương, vết loét…
Màng BC có nhiều ưu điểm để trở thành chất mang các hợp chất có
nguồn gốc từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng [7] [11].
1.6. Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài
Luận văn thạc sĩ vi sinh học 2009 : “Nghiên cứu một số đặc tính vật lý của
màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng” của Trần như
Quỳnh- ĐHSP Hà Nội đã làm được một số vấn đề sau:
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn A. xylinum
BHN2.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men tạo màng
BC của chủng A. xylinum BHN2, qua đó lựa chọn được môi trường thích hợp
cho chủng A. xylinum BHN2 lên men tĩnh.
+ Điều kiện nuôi cấy: hàm lượng giống bổ sung ban đầu cho lên men tạo
màng là 10% thể tích lên men, với PH ban đầu của môi trường lên men từ 4,55,5.
+ Môi trường dinh dưỡng: hàm lượng đường glucose 20g/l; (NH4)2SO4: 2
g/l; KH2PO4: 2 g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l.

GVHD: Phương Phú Công

10

SV: Nguyễn Duy Khanh

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

- Nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men cho chủng
A. xylinum BHN2 tạo màng tốt nhất là S/V = 0,8.
- Xử lý màng BC ứng dụng trong điều trị bỏng và khảo sát các đặc tính của
màng: khả năng kháng khuẩn cao, độ bền cơ học 3,62 kN/m, độ thấu khí
120ml/phút, khả năng hút nước 6,82g/100cm2/24 giờ; màng không có triệu
chứng kích ứng.
- Màng BC tẩm dầu mù u và kem nghệ làm lành vết thương sau 19 ngày điều
trị.

GVHD: Phương Phú Công

11

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu chính
Đối tượng nghiên cứu là các chủng A. xylinum BHN 2 từ phòng thí
nghiệm Vi Sinh - Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư pham Hà Nội 2
cung cấp.

2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
- Nguồn Cacbon: Ethanol, Glucose, Acid acetic, Agar.
- Nguồn Nitơ: Pepton, (NH4)2SO4
- Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O.
- Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol.
- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
- Ngoài ra còn sử dụng : nước dừa.
2.1.2.2. Thiết bị
- Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức).
- Nồi hấp Tommy (Nhật).
- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).
- Máy li tâm Sorvall (Mỹ).
- Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20l – 10ml.
- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40.
- Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ).
- Khay nhựa có kích thước 15 x 10 x 4 cm.
- Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn…

GVHD: Phương Phú Công

12

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1)
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2 g

CaCO3 : 10g

Agar: 20g

Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Ethanol: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2 g

Pepton: 4g
Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Ethanol: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.

2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2 g

Pepton: 4g
Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Ethanol: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước dừa: 1000ml.

GVHD: Phương Phú Công

13

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp hoạt hóa giống A.xylinum BHN 2
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử dụng
phải hoạt hóa giống “làm thức tỉnh giống”, nhân giống đảm bảo đủ số lượng
tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng

môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C
trong 20 phút. Sau đó đem xử lí trong đèn tím 15 phút để khử khuẩn, sau đó
cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong
24 giờ.
2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum BHN 2
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C
trong 20 phút để tránh phân dã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong
15 phút. Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bổ sung vào môi
trường lên men 5% giống đã hoạt hóa. Nuôi cấy ở điêu kiện tĩnh trong 7-10
ngày.
2.2.3. Phương pháp bảo quản chủng giống A.xylinum BHN 2 trên môi
trường thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh sẽ được cấy
trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 –
4 ngày ở 300C. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 40C để bảo quản giống. Cấy truyền giữ
giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần.

GVHD: Phương Phú Công

14

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ
chủng A. xylinum BHN 2

2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC
tốt nhất từ chủng A. xylinum BHN 2
S: diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm2)
V: thể tích dịch lên men tạo màng ( cm3)
Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích
dịch lên men để tìm tỷ lệ S/V thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ
chủng A.xylinum BHN 2 , chúng tôi tiến hành theo các bước sau:
- Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC. Quy đổi thể tích từ đơn
vị ml sang đơn vị cm3. Sau đó tính tỷ lệ S/V.
+ Dụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có kích thước 15 x
10 x 4 cm, từ đó ta tính được diện tích bề mặt lên men tạo màng BC là
S= 15 x 10= 150 (cm2).
+ Thể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ S/V thì ta
phải quy đổi ml sang cm3. Ta đã biết 1ml=1cm3. Ta có bảng sau:

GVHD: Phương Phú Công

15

SV: Nguyễn Duy Khanh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Bảng 2.1: Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu
S (cm2)

V ( ml =cm3)

S/V (cm-1)

150

150

1,0

150

167

0,9

150

187.5

0,8

150

215

0,7

150

250

0,6

150

300

0,5

- Bước 2: Tiến hành lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng A.xylinum BHN 2
với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai,
khối lượng tươi, khối lượng khô để tìm S/V thích hợp tạo màng BC tốt nhất.
2.2.4.2. Phương pháp xác định dai (độ bền cơ học) của màng BC
.

Độ chịu kéo (độ dai): Lực kéo lớn nhất mà mẫu thử chịu được trước khi

đứt trong điều kiện xác định của phương pháp thử tiêu chuẩn.
Độ bền kéo (độ dai) có thể được hiểu như là khi một lực tác động tăng
dần đến khi vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt. Ở giá trị lực kéo giới hạn cho sự
đứt của vật liệu được ghi lại được ký hiệu σk. Độ bền kéo được ứng dụng rất
nhiều cho các vật liệu trong các lĩnh vực như thiết kế chế tạo máy, xây dựng,
khoa học vật liệu.

GVHD: Phương Phú Công

16

SV: Nguyễn Duy Khanh

Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Để xác định độ dai của màng tôi đã dùng một lực kế(đơn vị là NNiutơn). Sau khi thu màng tôi tiến hành đo độ dai bằng cách:
+ Cố định đầu trước của màng
+ Tiếp đến lấy lực kế lò xo cố định vào đầu sau
+ Kéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu N.
2.2.4.3. Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2
Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đến tỷ lệ S/V
thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 theo
các tiêu chí: khả năng xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, khối
lượng tươi, khối lượng khô từ đó tìm thời gian thích hợp tạo màng BC tốt
nhất.
2.2.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ S/V
thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2
Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ từ 20-400C đến tỷ lệ S/V
thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 theo các
tiêu chí: khả năng và thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ
dai, khối lượng tươi, khối lượng khô từ đó tìm nhiệt độ thích hợp tạo màng
BC tốt nhất.

GVHD: Phương Phú Công

17

SV: Nguyễn Duy Khanh