khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetate của loài địa y roccella sinensis (nyl ) hale thu hái ở bình thuận

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CAO ETHYL ACETATE CỦA LOÀI ĐỊA Y
ROCCELLA SINENSIS (NYL.) HALE
THU HÁI Ở BÌNH THUẬN

GVHD:
Th.S DƯƠNG THÚC HUY
SVTH: NGUYỄN THỊ THƯƠNG
MSSV: K35106052

TPHCM, tháng 5 năm 2013


LỜI CẢM ƠN
-------Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Thầy Dương Thúc Huy, người đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức chuyên môn,
luôn theo sát hướng dẫn tận tình và truyền đạt cho em những kinh nghiệm nghiên cứu quý
báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Thầy Nguyễn Thụy Vũ đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Quý Thầy Cô trường Đại học Sư Phạm TP.HCM, những người đã trực tiếp giảng dạy,
truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là những
hành trang vô cùng quý giá, là bước đầu tiên cho em bước vào sự nghiệp sau này trong
tương lai cũng như trong thời gian em thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Các bạn sinh viên bộ môn Hóa hữu cơ khóa K35 và K36 đã động viên, giúp đỡ chia sẻ
những buồn vui khó khăn cùng em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Gia đình đã động viên, tạo mọi điều kiện vật chất và tinh thần để em hoàn thành tốt
khóa học.
Kính chúc mọi người vui vẻ, hạnh phúc, dồi dào sức khỏe và thành công trong công
việc.
Xin chân thành cảm ơn!


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
s

:

Mũi đơn (Singlet)

d

:

Mũi đôi (Doublet)

t

:

Mũi ba (Triplet)

m

:

Mũi đa (Multiplet)

q

:

Mũi bốn (Quartet)

NMR

:

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

HSQC

:

Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC

:

Heteronuclear Multiple Bond Coherence

1

:

Proton Nuclear Magnetic Resonance

:

Carbon Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR

13

C-NMR

J

: Hằng số tương tác spin-spin

ppm

:

Part per million

UV

:

Tia cực tím (Ultra violet)

EA

:

Ethyl acetate

H

:

Hexane

A

:

Acetone


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
1. Hình ảnh
Hình 1: Ba dạng chính của địa y

Trang
8

Hình 2: Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y

13

Hình 3: Địa y sợi Roccella sinensis

14

Hình 4: Sự tương quan trong phổ HMBC của hợp chất RS-H13

24

Hình 5: Sự tương quan trong phổ HMBC của hợp chất RS-C9

26

Hình 6: Sắc kí lớp mỏng hợp chất RS-C3

28

2. Sơ đồ
Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao của địa y

21

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ sắc kí cột trên cao ethyl acetate EA1

22

3. Bảng biểu
Bảng 1: Số liệu phổ NMR của hợp chất RS-C9 và RS-H13

27


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................. 8
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... 8
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU ......................... 8
MỤC LỤC ................................................................................................... 8
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................. 8
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN ....................................................................... 8
1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y ..................................................................................... 8
2. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y ........................................... 9
3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG ĐỊA Y ..... 12
5. Nghiên cứu hóa học về chi Roccella................................................................. 14

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .............................................................. 18
1. Hóa chất và thiết bị ........................................................................................... 18
2. Khảo sát nguyên liệu ......................................................................................... 18
3. Điều chế các loại cao......................................................................................... 18

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................... 22
1.

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-H13 .......... 22

2.

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-C9............. 23

3.

THỰC HIỆN PHẢN ỨNG TẠO DẪN XUẤT ACETONIDE ................. 26

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN ........................................................................ 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 29


LỜI MỞ ĐẦU
Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc
chữa bệnh như: Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Parmelia sulcata chữa các
bệnh về sọ não[1], …Ngày nay địa y vẫn được sử dụng làm một số loại thuốc dân gian.
Người da đỏ ở Florida và người Trung Quốc đã sử dụng một số loại địa y khác nhau làm
thuốc, đặc biệt là thuốc long đờm[1]. Ahmadjian và Nilsson[2] công bố rằng địa y Cetraria
islandica bán rộng rãi trong các tiệm bào chế thuốc ở Thụy Điển và dùng để điều trị bệnh
đái tháo đường, bệnh phổi và bệnh viêm mũi. Peltigera canina được sử dụng ở Ấn Độ như
một dược phẩm làm giảm các cơn đau gan[1].
Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà
phòng, nước hoa. Các loại hợp chất khác nhau và các dẫn suất của depside được chiết từ các
chi Evernia, Parmelia và Ramalina, một số có mùi hương hấp dẫn được dùng trong xà
phòng và nước hoa. Đặc biệt, địa y được xem như là các chất chỉ thị sinh học cho ô nhiễm
môi trường, đặc biệt là ở những nơi có mật độ giao thông lớn.
Với những công dụng đó, địa y được nhiều nhà hóa dược nghiên cứu, nhiều hợp chất
tự nhiên được cô lập và một số được xác định có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư,
kháng virut, giảm đau, hạ sốt[3,4] , …
Địa y là thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm. Nhờ
dạng sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây,... trong những điều
kiện khắc nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự
có mặt của địa y với sự phân bố phong phú và đa dạng. Vậy mà từ trước đến nay ở Việt
Nam chưa có nhiều tác giả nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như ứng dụng của địa y.
Để góp phần vào sự phát triển của khoa học Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn loại địa y
roccella sinensis thuộc chi Roccella (họ Rocellaceae) thu hái ở huyện Liên Hương, tỉnh
Bình Thuận, Việt Nam.

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y
1.1 Khái niệm và phân loại địa y
Địa y, dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một
thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam
(cyanobacterium). Khoảng 17.000 loài địa y đã được biết. Địa y thường được chia làm ba
dạng chính: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose).

Xanthoria sp.,
địa y khảm trên đá núi lửa
tại miệng núi lửa ở Idaho, USA.

Xanthoparmelia cf. lavicola, Địa y sợi Hypogymnia cf.
một địa y phiến, trên đá tubulosa với Bryoria sp.
và Tuckermannopsis sp.
bazan
ở miền núi Canada.

Hình 1: Ba dạng chính của địa y
Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn
thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các
loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất. Kết quả từ sự cộng sinh này giúp
địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ
độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây,
kim loại, thủy tinh. [6]
1.2 Vai trò của các hợp chất tự nhiên trong địa y [8]
- Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao.
- Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại.
- Các carboxylic acid từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được các
khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate).

- Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng.
1.3 Một số ứng dụng của địa y


Địa y đã được sử dụng làm thực phẩm, làm phẩm nhuộm, nguyên liệu thô trong sản
xuất nước hoa và trong y học cổ truyền. Khoảng 700 tấn địa y Evernia prunastri và
Pseudevernia furfuracea (gọi là oakmoss) được khai thác hàng năm ở Pháp cho ngành công
nghiệp nước hoa.[5]
Y học cổ truyền Trung quốc từng sử dụng 71 loài địa y của 17 chi (9 họ) với mục đích
làm thuốc chữa bệnh.[5] Địa y thuộc họ Parmeliaceae, Usneaceae, Cladionaceae được sử
dụng nhiều hơn hết. Một vài loại cao điều chế từ địa y được sử dụng để trị các bệnh khác
nhau như Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Xanthoria parientina chữa bệnh vàng
da, chi Usnea để dưỡng tóc, Cetraria islandica (được gọi Ireland moss) chữa nhiễm khuẩn
và tiêu chảy. [5]

2. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y
Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học và
nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên. Tuy vậy,
các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát triển rất
chậm. Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm cũng
không dễ dàng, chỉ khoảng 10 % địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên chúng lại chứa
các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất có trong cùng loại địa y tự nhiên

[5]

. Lê

Hoàng Duy [6] đã nghiên cứu nuôi cấy thành công 10 % trên khoảng 50 loài địa y lấy từ Việt
Nam. Tuy đạt thành công về mặt cô lập hợp chất mới nhưng hầu như các hợp chất cô lập từ
địa y nuôi cấy đều khác so với các hợp chất địa y tự nhiên.

Khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay. Nghiên cứu về hoạt tính
sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống kê đầy đủ của
Boustie (2007) [9], Huneck (1999) [10], Muller (2001) [11] về kháng khuẩn, kháng
virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme …
2.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao[5]
Địa y hoặc các hợp chất của địa y

Hoạt tính

Barbatic acid, 4-O-demethylbarbatic

Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp

acid, diffractaic acid, evernic acid,
lecanoric acid, β-orcinolcarboxylic
acid, orsellinic acid

Trang 9


Ergochrome AA (secalonic acid A)

Gây độc cho thực vật

Evernic acid

Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau
bina

Lecanoric acid

Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây
Allium cepa

Các hợp chất phenol đơn vòng

Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật

Các quinone từ Pyxine sp.

Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium
cepa

Usnic acid

Ức chế sự nẩy mầm và phát triển của
Lepidium sativum

2.2 Hoạt tính kháng virus của các hợp chất địa y[5]
Hợp chất

Virus và enzyme của virus

Depsidone: virensic acid và dẫn xuất

Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực
khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV.

Butyrolactone acid: protolichesterinic
acid

Sao chép ngược HIV

(+)-Usnic acid và 4 depside khác

Virus Epstein-Barr (EBV)

Emodin, 7-Cloroemodin, 7-Chloro-1O-methylemodin,
5,7Dichloroemodin, Hypericin

HIV, cytomegalovirus và các virus khác

2.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[5]
Hợp chất

Vi khuẩn

Usnic acid và các dẫn xuất

Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp.,
Clostridium perfringens, Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp.,
Enterococcus spp., Mycobacterium aurum

Protolichesterinic acid

Helicobacter pylori

Trang 10

Methyl orsellinate, Ethyl orsellinate,
Methyl
β-orsellinate, Methyl
haematommate

Epidermophyton floccosum, Microsporum
canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum, T.
mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus
subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans

Alectosarmentin

Staphylococcus
smegmatitis

1´-Chloropannarin, Pannarin

Leishmania spp

Emodin, Physcion

Bacillus brevis

Pulvinic acid và dẫn xuất

Drechslera rostrata, Alternaria alternata

aureus,

Mycobacterium

Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí
Leprapinic acid và dẫn xuất

Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

2.4 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y[5]
Hợp chất của địa y

Enzyme bị ức chế

Atranorin

Trypsin, Pankreaselastase,
Phosphorylase

Baeomycesis acid

5-Lipoxygenase

Bis-(2,4-dihydroxy-6-npropylphenyl)methane, Divarinol, cao
chiết
từ
Cetraria
juniperina,
Hypogymnia physodes và Letharia
vulpina

Tyrosinase

Chrysophanol

Glutathione reductase

Confluentic acid, 2β-O-Methylperlatolic
acid

Monoaminoxidase B

4-O-Methylcryptochlorophaeic acid

Prostataglandinsynthetase

(+)-Protolichesterinic acid

5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV)

Vulpinic acid

Phosphorylase

Trang 11


Norsolorinic acid

Monoamino oxidase

Physodic acid

Arginine decarboxylase

Usnic acid

Ornithine decarboxylase

2.5 Hoạt tính kháng ung thư và kháng đột biến của các hợp chất địa y[5]
Hợp chất

Hoạt tính trên loại tế bào

(-)-Usnic acid

Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu
P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại
tế bào sừng hóa HaCaT

Protolichesterinic acid

Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu
K-562 và khối u rắn Ehrlich

Pannarin,
Sphaerophorin

Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào

1-Chloropannarin,

Naphthazarin

Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa
xuất,

Gây độc chống lại tế bào murine P815
mastocytoma và các dòng tế bào khác

Hydrocarpone, Salazinic acid, Stitic
acid

Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan
chuột

Psoromic
acid,
Chrysophanol,
Emodin và dẫn xuất

Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu

Scabrosin
Euplectin

ester

và

dẫn

3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG ĐỊA Y
Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó hệ thống phân
loại được sử dụng nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata và cộng sự đề nghị[7].
Các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc
sinh tổng hợp của chúng (hình 3).
♦ Nguồn gốc polyketide: depside, depsidone, quinones, xanthones, chromones, aliphatic
acid …
♦ Nguồn gốc shikimic acid: terphenylquinone và dẫn xuất của tetronic acid.

Trang 12


♦ Nguồn gốc mevalonic acid: terpenoid, steroid

Hình 2: Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y [5]
4. Mô tả thực vật Roccella sinensis (Nyl.) Hale (Roccellaceace).
4.1 Đối tượng nghiên cứu.
Trong nghiên cứu này, đối tượng nghiên cứu là loài địa y Roccella sinensis
(Roccellaceace) được thu hái ở Bình Thuận.
4.2 Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Roccella sinensis
Họ: Rocellaceae
Địa y mọc trên thân cây chín tầng ở chùa Hang, ở độ cao 300 mét so với mực nước
biển, huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận.
Mẫu ký hiệu US-B028, được lưu trong quyển tiêu bản thực vật, bộ môn Hóa hữu cơ,
khoa Hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM.
Tên khoa học của các địa y được xác định bởi tiến sĩ Harrie J. M. Sipman, Khoa thực
vật học, Đại học Freie, Berlin, Đức.

Trang 13


Hình 3: Địa y sợi Roccella sinensis

5. Nghiên cứu hóa học về chi Roccella.
• Các acid béo:
Năm 1967, Huneck S. và các cộng sự đã cô lập được roccellaric acid (1) từ Roccella
mollis [12]. Năm 1994, Huneck đã cô lập được roccellic acid (2) từ Roccella phycopis [13].

• Các hợp chất aliphatic mạch vòng:
Năm 1970 Ferguson G., Mackey I. R., tìm ra acetylportentol (3) từ Roccella
fuciformis[14]; cũng trong năm đó, Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S., đã phân lập
được protentol (4) từ Roccella galapagones[15].
• Các hợp chất carbohydrat:
Năm 1969, C. F. Culberson đã cô lập được hợp chất meso–erythitol (5) từ Roccella
phycopis [16] và D-tagatose (6) từ Roccella fuciformis [16]
Năm 1945, Anker R. M., Cook A. H. đã cô lập được ethyl orsellinate (7) từ Roccella
fuciformis [17]. Sau đó hợp chất này cũng được tim ra bởi Dyke H. J., Elix J. A., Marcuccio S.
M., Whitton A. A. (1987); Gavin J. , Tabacchi R. (1975); Hase T. A., Suokas E., McCoy K.
(1978) và Sonn (1928).
Năm 1969, C. F. Culberson và các cộng sự đã cô lập được (+) - montagnetol (8) từ
Roccella Montagnei [16].
• Các hợp chất carotenoid:

Trang 14


Năm 1988, Czeczuga đã cô lập được β-carotene (9) từ Roccella fuciformis

[18]

và γ-

carotene (10) từ Roccella montagnei Bel [18].
• Các hợp chất chromane và chromone:
Năm 1969 Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S. đã cô lập lepraric acid (11) từ
Roccella fuciformis

. Năm 1972 Hucneck S., Follmann G. đã tìm được lobodirin (12) từ

[19]

Roccella cerebriformis
được

[20]

. Cũng trong năm đó Huneck và các cộng sự của mình cô lập

2–methyl–5-hydroxy-6–hydroxymethyl–7-methoxychromone

(13)

từ

Roccella

fuciformis [20].
Năm 1992 Huneck S., Jakupovic J., Follmann G. đã cô lập được mollin (14) và

roccellin (15) từ Roccellaria mollis [21] .
Năm 1992 Huneck S., Jakupovic J., Follmann G., đã công bố hợp chất galapagin (16) từ
Roccella galapagoensis Follm [21].

• Các hợp chất depside:
Năm 1980, Sundholm E. G. và Huneck S. đã cô lập được erythrin (17) từ Roccella
phycopsis Ach[22].
• Các hợp chất dibenzofurane:
Năm 1993, Huneck và cộng sự của mình đã tìm thấy 3-O-demethylschizopeltic acid
(18) từ Roccella hypomecha Bory [23].
Năm 1991, Huneck và các cộng sự đã cô lập được 9-methylpannarate (19) từ Roccella
capensis Follm [24].
• Các hợp chất chứa N:
Năm 1983 Marcuccio S. M., Elix J. A., đã cô lập được picroroccellin (20) từ Roccella
fuciformis

. Năm 1972 Bohman-Lindgren G., Ragnarsson U., tìm ra roccanin (21) từ

[25]

Roccella canariensis [26].
• Công thức hóa học của các hợp chất:
HOOC

Me

O

Me

O

Roccellaric acid (1)

H 3C
H 3C

(H2C) 11

H

H

COOH
COOH

Roccellic acid (2)

Trang 15


H 3C

O

O
CH 3
O

O

O
CH 3
CH 3
O
CH 3

H 3C

CH 3
O
CH3

O

CH2OH
H
OH
H

H3C
O

H 3C

CH 3

C O
CH 3

Prortentol (4)

H
H

O
H
OH

meso-Erythitol (5)

Me

Me

OH

CO 2

COOC2H 5

OH
CH2OH

OH

CH3

HO

Acetylportentol (3)

HO

OH
CH 2OH

H
OH

OH

HO

H

H

D-tagatose (6)
Me

Ethyl orsellinate (7)
Me

Me

CH 2
OH
H
CH 2OH

(+)- Montagnetol (8)

Me
Me
Me

Me

Me

Me

Me

β - Carotene (9)
Me

Me

Me

Me

Me

Me

Me

Me

Me

Me

γ – Carotene (10)
CH 3 O
HOOC

OH

OH

O

O
H 3CO

O

OAc

AcO
HO

Me

O
O
OAc

Leprapic acid (11)

Lobodirin (12)
Trang 16

O

O

Me


OH

O

OH

HOH2C
O

H 3CO

O

HO
HO

Me

O

OH
Me

OAc

2-methyl-5-hydroxy-6-

O

O

Me

Mollin (14)

hydroxymethyl-7methoxychromone (13)
OH O
Me

OAc
O

HO
HO

OAc

OH

O

OH

HO
HO

Me
O

O

O

O
O

Me

OAc

Roccellin (15)

Galapagin (16)

Me
COO

OH

OH

COO

OMe

Me
n-Bu

HO

Me

CH 2
H
OH
H

Me

OH
CH 2OH

Erythrin (17)

OH

3-O-Demethylschizopeltic acid (18)

O
OH

Me
COOMe

Me

OH

O
COOH

O
COOH

Me
N

O
OH

hoặc

HN

OH

O

OMe

9-Methylpannarate (19)

Pricroccellin (20)
O

O
N

H
HN
O

NH

H H
H
N
O

Roccarin (21)
Trang 17

NH
Me

N
O

OMe

Me


CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
1. Hóa chất và thiết bị
1.1 Hóa chất
Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm eter dầu hỏa,
ethyl acetate, acid acetic, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol là hóa chất của hãng
Chemsol-Việt Nam và được làm khan bằng Na 2 SO 4 nếu sử dụng lại và nước cất.
Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung dịch
acid sulfuric 30%, vanillin/H 2 SO 4 , đèn UV.
Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm, Ấn Độ.
1.2 Thiết bị
- Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu (becher, lọ thủy tinh, bình lóng).
- Cột sắc ký: cột cổ điển.
- Sắc ký lớp mỏng 25 DC – Alufolien 20 × 20 cm Kiesel gel F 254 Merck.

- Máy cô quay chân không Buchi-111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath, máy
sấy.
- Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR,

13

C-NMR: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân

Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR.
- Tất cả phổ được ghi tại: Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa Học Tự

Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí
Minh.

2. Khảo sát nguyên liệu
Chương I mục 4.2

3. Điều chế các loại cao
3.1 Điều chế cao methanol
Mẫu cây ban đầu được rửa sạch, phơi khô, nghiền nhỏ có khối lượng là 1.7 kg được tiến
hành bằng phương pháp ngâm dầm trong dung môi methanol ở nhiệt độ phòng. Lấy dịch
chiết cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp.
Trong khi dịch methanol bay hơi một kết tủa tách ra và được lọc ra khỏi dịch. Dịch còn
lại được tiếp tục làm khô thu được cao methanol thô (450g). Thực hiện sắc ký cột silica gel
Trang 18


trên cao methanol thô, giải ly bằng dung môi hexan thu được cao Hexan. Phần còn lại thực
hiện sắc ký cột silica gel, giải ly lần lượt bằng hệ dung môi hexan : ethyl acetate có độ phân
cực tăng dần từ 9:1 đến 0:10 thu được các loại cao EA1, EA2, EA3, EA4 và phần còn lại.
Thực hiện sắc ký cột silica gel trên phần còn lại, giải ly bằng dung môi methanol thu được cao
Methanol.
3.2 Sắc kí cột trên cao ethyl acetate EA1
Cao ethyl acetate EA1 chọn khảo sát được sắc kí cột giải ly với hệ dung môi eter dầu
hỏa : ethyl acetate thu được 3 phân đoạn (EA1.1 - EA1.3).
Phân đoạn EA1.2 (15.137g) thực hiện sắc kí cột và giải ly với hệ dung môi eter dầu hỏa:
ethyl acetate (8:2) thu được 3 phân đoạn (EA1.2.1 - EA1.2.3). Tiếp tục thực hiện sắc kí cột
silica gel trên phân đoạn EA1.2.2 và giải ly với hệ dung môi eter dầu hỏa: ethyl acetate (8:2)
thu được 3 phân đoạn (EA1.2.2.1, EA1.2.2.2, EA1.2.2.3). Phân đoạn EA1.2.2.1 thực hiện sắc
ký lớp mỏng điều chế và giải ly với hệ dung môi dietyl eter: eter dầu : acid acetic (9:1:0,01)
thu được hợp chất kí hiệu là RS-C9.

Phân đoạn EA1.2.2.2 thực hiện sắc ký lớp mỏng điều chế và giải ly với hệ dung môi
eter dầu hỏa : ethyl acetate (6 : 4) thu được hợp chất kí hiệu là RS-H13.

Trang 19


Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế các loại cao của địa y.
Bột địa y Roccella siensis
(1.7kg)
-Ngâm, tận trích bằng methanol
-Lọc, cô quay thu hồi dung môi
Cao Methanol thô
(400g)
- Sắc kí cột silica gel
- Giải ly: Hexan 100%
- Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

Phần còn lại

Cao H
( 250g)

- Giải ly: H:A (9:1  0:10)
- Lọc, cô quay thu hồi dung môi

Phần còn

Cao EA1

Cao EA2

Cao EA3

Cao EA4

lại

(21g)

(11g)

( 30g)

( 64g)

- Giải ly: Methanol
- Lọc, cô quay thu hồi dung môi
Cao Methanol
(8g)

Trang 20


Sơ đồ 2.2: Sơ đồ sắc kí cột trên cao ethyl acetate EA1.
Cao EA1
(21g)
- Sắc kí cột silica gel.
- Giải ly với hệ eter dầu: ethyl acetate

Phân đoạn

Phân đoạn

Phân đoạn

EA1.1

EA1.2

EA1.3

(2.780g)

(15.137g)

(2.178g)

- Sắc kí cột silica gel.
- Giải ly với hệ eter dầu : ethyl acetate (8:2).

Phân đoạn

Phân đoạn

Phân đoạn

EA1.2.1

EA1.2.2

EA1.2.3

(541mg)

(1.3g)

(12.296g)

- Sắc kí cột silica gel.
- Giải ly với hệ eter dầu : ethyl acetate (8:2).

Phân đoạn

Phân đoạn

Phân đoạn

EA1.2.2.1

EA1.2.2.2

EA1.2.2.3

(627mg)

(162mg)

(430mg)

- Sắc kí lớp mỏng điều chế.

- Giải ly với hệ Dietyl eter : eter
dầu : acid acetic (9 :1:0.01)

- Sắc ký lớp mỏng điều chế
- Giải ly với hệ eter dầu :
ethyl acetate (6 : 4)

RS-C9

RS-H13

(200mg)

(24mg)

Trang 21


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Cao EA1 (22g) thực hiện sắc ký cột phân thành 3 phân đoạn ký hiệu từ EA1.1 đến
EA1.3. Chọn khảo sát trên phân đoạn EA1.2 (15.137g), thực hiện sắc ký cột silica gel và
sắc ký lớp mỏng điều chế nhiều lần đã cô lập được hai hợp chất RS-C9 và RS-H13. Cấu
trúc hóa học của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp hóa lý hiện đại như
phổ NMR, HSQC, …

1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-H13
Hợp chất H13 được cô lập từ phân đoạn EA1.2 (15.137g).
• Trạng thái: chất dầu trong suốt.
• Dữ liệu phổ 1H NMR (500 MHz, acetone-d 6 ) và

13

C NMR (125 MHz, acetone-d 6 )

được trình bày trong bảng 1.
• Phổ HSQC trình bày ở phụ lục 3
• Phổ HMBC trình bày ở phụ lục 4
Biện luận cấu trúc phổ RS-H13
Phổ 1H-NMR cho thấy có tín hiệu của 2 proton thuộc vòng thơm [δ H 6.29 (1H, d,
J=2.0Hz), 6.23 (1H, d, J=2.0Hz)] ghép cặp meta với nhau. Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho
thấy tín hiệu của 3 nhóm methyl [δ H 2.52 (3H, s), 1.41 (3H, s), 1.33 (3H, s)], 1 nhóm
hydroxy kiềm nối [δ H 11.46 (1H, s)], 1 nhóm methylen liên kết oxy với 2 proton không
tương đương ghép cặp với nhau {δ H 4.63 [1H, dd, (J=11.0, 3.5Hz), 4.44 [1H, dd, (J=11.0,
7.5Hz)]}, 1 nhóm methylen thứ hai [δ H 3.72 (2H, m)], 2 nhóm methine {δ H 4.59 [1H, ddd,
(J=7.5, 6.0, 3.5Hz)], 4.32 (1H, like_q, J=6.0Hz)}. Sự chẻ mũi giữa nhóm methylen ở δ H
4.63 và 4.44 với proton nhóm methine ở δ H 4.59 cho thấy các proton của hai nhóm này ghép
cặp với nhau theo hệ thống ABX.
Phổ

C-NMR cho thấy hợp chất RS-H13 có 15 carbon: 1 nhóm carboxyl ester có độ

13

dịch chuyển hóa học δ C 172.0 (-COO), 6 carbon vòng thơm trong đó có 2 carbon nối với
oxy và 4 carbon mang nhóm thế khác [δ C 166.4, 163.4, 144.7, 105.5, 112.4, 101.7], 1 nhóm
methyl gắn nhân thơm [δ C 24.3], 2 carbon methylen [δ C 64.8, 61.1], 2 carbon methine [δ C
75.8, 78.1], 1 carbon tứ cấp liên kết với 2 oxy [δ C 109.2] và 2 carbon methyl [δ C 28.2, 25.6].
Việc xác định được hỗ trợ bởi phổ HSQC.
Ở vòng thơm, trên phổ HMBC cho thấy proton nhóm methyl ở δ H 2.52 tương quan với
các carbon δ C 112.4 (C-5), 144.6 (C-6), 105.5 (C-1). Proton ở δ H 6.29 tương quan với các

Trang 22


carbon δ C 24.3 (C-8), 105.5 (C-1), 163.4 (C-4) và ghép meta với proton δ H 6.23. Proton ở
δ H 6.23 tương quan với carbon δ C 112.4 (C-5), 163.4 (C-4), 166.4 (C-2). Nhóm hydroxyl
kiềm nối (δ H 11.46) cũng có tương quan với carbon δ C 166.4 (C-2), 105.5 (C-1). Từ dữ liệu
phổ trên khẳng định nhân thơm có cấu trúc của một đơn vị orsellinate.
Proton nhóm methylen ở [δ H 4.63, 4.44] dịch chuyển về vùng từ trường thấp nên phải
liên kết ester với nhóm –COO của đơn vị orsellinate. Trên phổ HMBC thấy các proton của
nhóm methylen này tương quan với carbon nhóm carboxyl ở δ C 172.0 (C-7), carbon ở δ C
75.8 (C-2’). Điều này tái khẳng định vị trí của nhóm methylen này.
Thêm nữa, proton H-2’ (ở δ H 4.59, ở δ C 75.8) có tương quan với carbon ở δ C 109.2 (C5’). Proton H-3’ (ở δ H 4.32) cũng tương quan với carbon ở δ C 109.2 (C-5’). Ngoài ra, hai
nhóm methyl [δ H 1.44, 1.33] cũng tương quan với carbon ở δ C 109.2 (C-5’). Tất cả điều này
khẳng định phần đường đã bị acetone hóa tại vị trí C-2’;C-3’. Như vậy, cấu trúc của RSH13 được xác định. RS-H13 được đề nghị là [5-(hydroxymethyl)-2,2-dimethyl-1,3dioxolan-4-yl]methyl 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoate.
8

CH3 O

H

7

5

HO

1
3

H

1'

O CH2
6'
2'
CH
3
HC O
OH 3'
7'
HC O 5' CH3
4'
CH2OH

Hình 4: Sự tương quan trong phổ HMBC của hợp chất RS-H13

2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RS-C9
Hợp chất RS-C9 được cô lập từ phân đoạn EA1.2 (15.137g).
• Trạng thái: chất dầu trong suốt.
• Dữ liệu phổ 1H NMR (500 MHz, acetone-d 6 ) và
được trình bày trong bảng 1.
• Phổ HSQC trình bày ở phụ lục 7
• Phổ HMBC trình bày ở phụ lục 8
Biện luận cấu trúc phổ RS-C9

Trang 23

13

C NMR (125 MHz, acetone-d 6 )


Phổ 1H-NMR cho thấy có tín hiệu của 2 proton thuộc vòng thơm [δ H 6.29 (1H, d,
J=2.5Hz), 6.23 (1H, d, J=2.5Hz)]. Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho thấy tín hiệu của 3 nhóm
methyl [δ H 2.51 (3H, s), 1.36 (3H, s), 1.29 (3H, s)], 1 nhóm methylen liên kết oxy với 2
proton không tương đương ghép cặp với nhau {δ H 4.58 [1H, dd, (J=11.5, 3.0Hz )], 4.32
[1H, dd, (J=11.5, 6.5Hz)]}, 1 nhóm methylen thứ 2 {δ H 4.10 [1H, dd, (J=8.0, 6.5Hz)], 3.98
[1H, dd, (J= 7.5, 3.5Hz)]}, 2 nhóm methine {δ H 3.90 [(1H, ddd, (J=8.0, 6.5, 3.0Hz)], 4.10
(1H, dd, (J=8.0, 6.5Hz)]. Sự chẻ mũi giữa nhóm methylen ở δ H 4.58 và 4.32 với proton
nhóm methine ở δ H 3.90 cho thấy các proton của hai nhóm này ghép cặp với nhau theo hệ
thống ABX.
Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất RS-C9 có 15 carbon: 1 nhóm carboxyl ester có độ dịch
chuyển hóa học δ C 172 (-COO), 6 carbon vòng thơm trong đó có 2 carbon nối với oxy và 4
carbon mang nhóm thế khác [δ C 166.0, 163.6, 144.6, 105.4, 112.4, 101.6], 1 nhóm methyl
thơm [δ C 24.4], 2 carbon methylen [δ C 67.8, 67.7], 2 carbon methine [δ C 77, 71.3], 1 carbon
tứ cấp liên kết với 2 oxy [δ C 110.0], 2 carbon methyl [δ C 27.1, 25.5]. Việc xác định được hỗ
trợ bởi phổ HSQC.
Ở vòng thơm, trên phổ HMBC cho thấy proton nhóm methyl ở δ H 2.51 tương quan với
các carbon δ C 112.4 (C-5), 144.6 (C-6), 105.4 (C-1). Proton ở δ H 6.29 tương quan với các
carbon δ C 24.4 (C-8), 105.4 (C-1), 163.6 (C-4) và ghép meta với proton δ H 6.23. Proton ở
δ H 6.23 tương quan với carbon δ C 112.4 (C-5), 163.6 (C-4), 166.0 (C-2). Từ các dữ liệu phổ
trên khẳng định nhân thơm có cấu trúc của một đơn vị orsellinate.
Proton nhóm methylen ở [δ H 4.58, 4.32] dịch chuyển về vùng từ trường thấp nên phải
liên kết ester với nhóm –COO của đơn vị orsellinate. Trên phổ HMBC thấy proton này
tương quan với carbon nhóm carboxyl ở δ C 172.3 (C-7), carbon ở δ C 77.0 (C-3’), carbon ở
δ C 71.3 (C-2’). Điều này tái khẳng định vị trí của nhóm methylen này.
Thêm nữa, proton H-3’ (δ H 4.10, ở δ C 77.0) có tương quan với carbon ở δ C 110.0 (C5’). Proton H-4’ (ở δ H 3.98) cũng tương quan với carbon ở δ C 110.0 (C-5’). Ngoài ra, hai
nhóm methyl [δ H 1.36, 1.29] cũng tương quan với carbon ở δ C 110.0 (C-5’). Tất cả điều này
khẳng định phần đường đã bị acetone hóa tại vị trí C-3’;C-4’. Như vậy, cấu trúc của RS-C9

được xác định. RS-C9 được đề nghị là 2-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)-2-hydroxyethyl
2,4-dihydroxy-6-methylbenzoate.

Trang 24


8

CH3 O

H

7

5

1
3

HO

H

1'

O CH2
2'
HC OH
OH 3'
6'

HC O 5' CH
3
7'
4'
CH3
H2C O

Hình 5: Sự tương quan trong phổ HMBC của hợp chất RS-C9
Bảng 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RS-C9 và RS-H13
Hợp chất RS-C9 (Acetone-d6)
Vị
trí

δ H (ppm)

δC
(ppm)

Hợp chất RS-H13 (Acetone-d6)
δ H (ppm)

HMBC
1

13

H C

δC
(ppm)

1

105.4

105.5

2

166.0

166.4

3

6.23 (d, 2.5)

4
5

101.6

2, 4, 5

6.23 (d, 2.0)

163.6
6.29 (d, 2.5)

112.4

101.7

1, 4, 8

6.29 (d, 2.0)

112.4

144.6

144.7

7

172.3

172.0

1’

H13C

2, 4, 5

163.4

6

8

HMBC
1

1, 3, 4, 8

2.51 s

24.4

1, 5, 6

2.52 s

24.3

1, 5, 6

4.58 (dd, 11.5, 3.0)

67.8

7, 2’, 3’

4.63 (dd, 11.0, 3.5)

64.8

7, 2’

4.32 (dd, 11.5, 6.5)

4.44 (dd, 11.0, 7.5)

2’

3.90 (ddd, 8.0, 6.5,
3.0)

71.3

1’, 4’

4.59 (ddd, 7.5, 6.0,
3.5)

75.8

1’, 5’

3’

4.10 (dd, 8.0, 6.5)

77.0

1’

4.32 (like_q, 6.0)

78.1

1’, 5’

4.10 (dd, 8.0, 6.5)

67.7

2’, 3’, 5’

3.72 m

61.1

2’

4’

3.98 (dd, 7.5, 3.5)

5’
6’

110.0
1.29 s

25.5

109.2
5’

1.41 s

Trang 25

25.6

5’


7’

1.36 s

27.1

2OH

5’

1.33 s

28.2

11.46 s

5’
1, 2

3. THỰC HIỆN PHẢN ỨNG TẠO DẪN XUẤT ACETONIDE

Thí nghiệm 1: Tiến hành ngâm hợp chất tinh khiết RS-C3 trong dung môi acetone lần
lượt trong 24 giờ, 48 giờ.
Thí nghiệm 2: Thực hiện phản ứng đun hoàn lưu hợp chất tinh khiết RS-C3 trong hệ
dung môi acetone : DMSO ở 120oC lần lượt trong 30 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút, 2 giờ, 2 giờ
30 phút.
Sau mỗi thí nghiệm thực hiện sắc kí lớp mỏng điều chế với hệ dung môi chloroform :
methanol : ethyl acetate : acid acetic (9:1:0.2:0.2) thấy xuất hiện thêm một vết mới, chứng
tỏ hợp chất RS-H13 và hợp chất RS-C9 là những hợp chất giả tạo được hình thành trong
quá trình ly trích các hợp chất từ địa y Roccella sinensis .

Hình 6: Sắc kí lớp mỏng hợp chất RS-C3
Đối với dẫn xuất acetonide không cần xúc tác cũng có thể được tạo thành ở điều kiện
thường.

Trang 26