nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ bacillus subtilis có trong natto nhật bản hướng tới thực phẩm chức năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Bùi Thị Nhung

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ
BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN
HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Bùi Thị Nhung

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ
BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN
HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số

: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN HỮU PHÚC

Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu được trình bầy trong phần kết quả của luận văn này là do
chính tôi thực hiện và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình
nào.
Tác giả luận văn

Bùi Thị Nhung

1


LỜI CẢM ƠN
Sau hai năm học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ
Sinh học. Để đạt được thành quả như ngày hôm nay
Tôi xin chân thành cảm ơn:
 Toàn thể quý Thầy, Cô khoa sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp. HCM đã truyền
đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong thời gian tôi theo học tại trường.
 TS. Nguyễn Hữu Phúc – giáo viên hướng dẫn của tôi, một người thầy nhưng cũng
rất gần gũi và luôn tận tâm đối với học trò của mình. Người đã hết lòng hướng dẫn, quan
tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong những lúc khó khăn. Thầy đã truyền đạt kiến thức và
kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này .
 Sở Giáo Dục - Đào Tạo tỉnh Bình Dương, Trường THPT An Mỹ đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian đi học.
 Ths. Dương Nhật Linh và Ths. Nguyễn Văn Minh (Đại Học Mở) đã nhiệt tình

giúp đỡ và hỗ trợ tôi làm thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
 Em Trang, Quỳnh, Phi (sinh viên Đại Học Mở) và toàn thể các bạn học viên cao
học khóa 22 đã luôn giúp đỡ, quan tâm và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
 Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân yêu trong gia đình đã
luôn bên cạnh, ủng hộ tôi, là nguồn động viên lớn lao nhất và hy sinh nhiều nhất để tôi có
được ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn
Bùi Thị Nhung

2


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 2
MỤC LỤC .................................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ 6
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................................. 7
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................................... 8
3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 8
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10
1.1. Khái quát chung về protease .................................................................................... 10
1.1.1. Khái niệm và phân loại ......................................................................................... 10
1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease ......................................................... 13
1.1.3. Enzyme protease kiềm .......................................................................................... 19
1.1.4. Enzyme Nattokinase ............................................................................................. 26
1.2. Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn ....... 30

1.2.1. Những vấn đề cơ bản trong lên men bán rắn ........................................................ 30
1.2.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn tạo enzyme.................................................. 30
1.2.3 Các giai đoạn của quá trình lên men bán rắn ......................................................... 31
1.3. Đại cương về Bacillus subtilis ................................................................................... 31
1.3.1. Lịch sử phát triển .................................................................................................. 31
1.3.2. Vị trí phân loại ...................................................................................................... 32
1.3.3. Đặc điểm phân bố ................................................................................................. 32
1.3.4. Đặc điểm hình thái và sinh hóa ............................................................................. 32
1.4. Giới thiệu bệnh huyết khối ....................................................................................... 34
1.4.1. Khái niệm về huyết khối ....................................................................................... 34
1.4.2. Nguyên nhân hình thành huyết khối ..................................................................... 34
1.4.3. Biến chứng của bệnh huyết khối ........................................................................... 35
1.4.4. Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam ....................................... 36

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 37
2.1. Vật liệu ....................................................................................................................... 37
2.1.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................... 37
3


2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................... 37
2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................ 37
2.2. Môi trường nghiên cứu ............................................................................................. 37
2.3. Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí thí ngiệm tổng quát) ................ 39
2.3.1. Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto .................................................. 40
2.3.2. Phương pháp cấy truyền VSV .............................................................................. 41
2.3.3. Phương pháp giữ giống dưới lớp dầu khoáng ...................................................... 41
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc ........................................................... 42
2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram ................................................................................... 42
2.3.6. Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A. Peskop .................................................... 43

2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase ..................................................... 43
2.3.8. Phương pháp xử lí tế bào và bào tử để chụp trên KHV điện tử quét SEM .......... 44
2.3.9. Chụp ảnh tế bào, bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét ....................................... 44
2.3.10. Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử .......................................... 44
2.3.11. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ............................... 45
2.3.12. Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân ............. 46
2.3.13. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến .......................... 47
2.3.14. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry...................................... 49
2.3.15. Phương pháp xác định hoạt độ nattokinase ........................................................ 50
2.3.16. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng tổng hợp
protease của chủng B. subtilis N18 ................................................................................. 51
2.3.17. Phương pháp làm natto ....................................................................................... 54
2.3.18. Phương pháp xác định độ ẩm của sản phẩm sau lên men................................... 55
2.3.19. Phương pháp tách chiết enzyme ......................................................................... 56
2.3.20. Phương pháp thu nhận enzyme ........................................................................... 56
2.3.21. Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng ethanol58
2.3.22. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................... 58

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 60
3.1. Phân lập và tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao ........................... 60
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto của Nhật Bản............................................... 60
3.1.2. Tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao.............................................. 61
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai mẫu N18 và N441, định danh đến chi.... 66
3.2.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 66
3.2.2. Định danh đến chi theo hình thái .......................................................................... 68
4


3.3. Định danh hai mẫu N18 và N441 đến loài bằng sinh học phân tử ....................... 68
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên sự tổng hợp protease

của chủng B. subtilis N18 ................................................................................................. 69
3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành ....................................................... 69
3.4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường ...................................................................... 71
3.4.3. Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men ........................................................................ 72
3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu .................................................................................. 73
3.4.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống .................................................................................... 75
3.4.6. Ảnh hưởng của Zn2+ và K+ ................................................................................... 76
3.4.7. Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính protease ...... 77
3.4.8. Tối ưu hóa nồng độ tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm................................................................................... 78
3.5. Nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase ............................................ 82
3.5.1. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto của
Nhật Bản ......................................................................................................................... 82
3.5.2. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase trên MT lên men bán rắn ..................... 86
3.5.3. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase và sinh khối Bacillus subtilis ............... 91

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 96
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 103

5


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ACE

Angiotensin

BT

Bào tử

CPE

Chế phẩm enzyme

ĐN & GL

Đậu nành và gạo lức

ĐN

Đậu nành

G(-)

Gram âm

G(+)

Gram dương

GL

Gạo lức

KHV

Kính hiển vi

KL

Khuẩn lạc

MT

Môi trường

NXB

Nhà xuất bản

OD

Mật độ quang

PP

Phương pháp

STT

Số thứ tự

TB

Tế bào

TCA

Axit tricloacetic

TN

Thí nghiệm

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

6


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết
peptid (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy
phân này có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn, nhiều enzyme protease còn
có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc
acid amin. Protease là các enzyme công nghiệp quan trọng hàng đầu, chiếm ít nhất một
phần hai tổng sản lượng thị trường enzyme trên toàn thế giới (Rao et al.,1998). Các
enzyme protease chiếm vị trí quan trọng do được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp khác nhau: Chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, gia cầm, trong ngành công
nghiệp dược phẩm, công nghiệp thuộc da, sản xuất các chất tẩy rửa, công nghiệp dệt và
thu hồi bạc từ phim ảnh…

Vi sinh vật là nguồn quan trọng nhất trong sản xuất enzyme. Trừ một số ít protease
được sản xuất từ động vật, thực vật như trypsin, chymotrypsin, papain, bromelain, ficin, còn
lại hầu hết đựợc sản xuất từ vi sinh vật [2], trong đó vi khuẩn là nguồn đóng góp chủ yếu,
thứ đến là nấm mốc.
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 17 triệu người chết do các
bệnh tim mạch (nhồi máu cơ tim và đột quy), mà nguyên nhân là hậu quả của chứng huyết
khối. Theo ước tính thị trường toàn cầu về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14 tỷ USD
(Cong et al., 2009) [26]. Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người được chẩn đoán
đột quỵ có liên quan đến huyết khối. Huyết khối xuất hiện khi sợi protein có tên là Fibrin
tích lũy trong lòng mạch. Huyết khối là nguyên nhân gây tắc nghẽn các dòng mạch máu
tới nuôi mô và cơ tim. Nếu dòng mạch máu bị chẹn, oxy cung cấp cho các cơ đó bị giảm
hoặc không còn. Điều này dẫn đến chứng đau thắt ngực và cơn đau tim. Huyết khối trong
các tâm thất của tim có thể di chuyển lên não gây tắc nghẽn các mạch máu não và gây ra
các biến chứng như tai biến mạch máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ.
Các chất làm tiêu sợi fibrin đường tĩnh mạch như streptokinase, urokinase và hoạt hóa
plasminogen mô ( t-PA ) đã được sử dụng điều trị làm tan huyết khối từ những năm 1960,
1970, 1980. Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học của các chất này tồn tại không lâu nên
có trường hợp huyết khối lại xuất hiện trở lại và nguy cơ biến chứng gây xuất huyết (Kumar
A.,(2010) [40]. Năm 1980 đã có một phát minh vô cùng lý thú đó là enzyme Nattokinase
7


(NK). NK là một enzyme hoạt huyết mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền thống của Nhật
Bản có tên là Natto. Nó là một loại gia vị dân gian và là một phương thuốc cổ truyền chữa
bệnh tim mạch. Natto được sản xuất bằng lên men đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis –
một loại vi khuẩn có ích, khi ủ ấm với hạt đậu nành sản sinh ra enzyme NK. Bác sỹ
Hyroyuki Sumi là tác giả đầu tiên phát hiện Natto làm tan huyết khối năm 1980.
Dựa trên nguồn gốc thực phẩm và hoạt tính làm tan huyết khối tương đối mạnh,
NK có lợi thế về y tế và thương mại hóa nhờ tác dụng phòng ngừa và hiệu quả kéo dài,
uống thuận tiện và sự ổn định trong đường tiêu hóa (Sumi et al., 1990). NK tăng cường

hoạt hóa plasminogen và bất hoạt plasminogen activator inhibitor (Sumi et al, 1987,
Urano et al. 2001)[52]. Các sản phẩm NK ngày nay đang được bán rộng rãi trên thế giới
và sử dụng như một thực phẩm chức năng, hầu như không có phản ứng phụ.
Nguyên liệu để sản xuất NK chủ yếu là đậu nành, ngoài ra có thể sử dụng các sản
phẩm phụ của công nghiệp chế biến thực phẩm như cám mì, cám gạo, trấu, các loại vỏ đậu
(đậu xanh, đậu đỏ..), vỏ tôm. Công đoạn lên men có thể thực hiện bằng lên men bán rắn
hoặc lên men chìm, nhiệt độ lên men từ 30-40oC...Ngoài các chủng Bacillus subtilis phân
lập từ Natto, chúng ta có thể tìm kiếm ở Việt nam nhiều chủng Bacillus sp khác từ các sản
phẩm lên men truyền thống hoặc trong đất, nước của Việt nam. Tất cả những điều kiện
như vậy đều có thể đáp ứng ở Việt nam.
Với những lý do như trên chúng tôi thực hiện đề tài :
“Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có trong Natto Nhật Bản hướng
tới thực phẩm chức năng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ Natto Nhật Bản và xác định một số điều kiện tạo
chế phẩm protease giàu nattokinase
3. Nội dung nghiên cứu
1) Phân lập các mẫu B.subtilis từ Natto của Nhật Bản
2) Chọn lọc khả năng sản xuất protease của một số mẫu phân lập
3) Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của mẫu chọn lọc
4) Phân loại đến loài hai mẫuh Bacillus đã chọn
5) Xác định một số điều kiện lên men sản xuất protease của chủng chọn lọc
6) Nghiên cứu một số đặc tính của protease đã tinh sạch sơ bộ
8


7) Đề xuất quy trình tạo chế phẩm protease giàu nattokinase dạng bột khô
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013
- Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới

Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Đại Học Mở Tp. HCM

9


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về protease
1.1.1. Khái niệm và phân loại
1.1.1.1. Khái niệm protease
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid
(-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy phân này
có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn. Nhiều enzyme protease còn có thể xúc
tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin.
Phản ứng theo sơ đồ sau:

1.1.1.2. Phân loại protease
1.1.1.2.1. Dựa vào cơ chế xúc tác
Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm [11]:
Nhóm 1: Exo-peptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch. Thủy phân
đầu tận cùng của chuỗi polypeptide. Nếu xúc tác ở đầu gốc carboxyl tự do thì gọi là enzyme
carboxypeptidase. Nếu xúc tác ở đầu có gốc amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase
Dựa trên cơ chất enzyme sử dụng thì protease được chia thành hai nhóm: protease và
peptidase.
Nhóm 2: Endo-peptidase còn gọi là protease hay enzyme phân cắt nội mạch. Xúc tác phản
ứng thủy phân liên kết peptide bên trong chuỗi polipeptidase.
Cả hai enzyme endo-peptidase và exo-peptidase kết hợp với nhau một cách hiệu quả
trong việc thủy phân phân tử protein, có thể nói rằng chức năng chính của endo-peptidase là
tạo một lượng lớn những peptid có đầu tận cùng là nhóm carboxyl tự do và nhóm amin tự
do để tạo điều kiện cho exo-peptidase hoạt động.

10


Hình 1.1. Cơ chế xúc tác của enzyme protease
1.1.1.2.2. Dựa vào hoạt động của pH
Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau mà enzyme protease
được chia thành 3 loại.
- Loại 1: Protease acid: pHopt trong khoảng 2 – 5. Nhóm enzyme này xúc tác cho sự thủy
phân các peptid và protein ở vùng pH acid. Ngoài ra chúng còn có khả năng thủy phân một
số đi – tri peptid do có sự hiện diện của enzyme carboxylpeptidase.
Loại protease này thường được thu nhận từ các loại nấm sợi như: A. niger, A.
awmori, A.saitoi.
- Loại 2: Protease trung tính: pHopt trong khoảng hẹp, từ 6 – 7,5, không bền với nhiệt độ và
mất hoạt tính khi có mặt của protease kiềm, có trung tâm hoạt động là kim loại, chứa nhiều
Zn2+.
Được thu nhận chủ yếu từ các loại nấm sợi như: A. oryzae, A. flavus, A. fumigatus, A.
tericola.
- Loại 3: Protease kiềm: pHopt trong khoảng 8 – 11, thường được tổng hợp nhiều bởi vi
khuẩn và nấm men.
Những protease kiềm tính là nhóm được quan tâm khá nhiều trong những năm gần
đây vì có thể sử dụng chúng như chất phụ gia trong việc giặt tẩy, trong quá trình thuộc da,
xử lý chất thải môi trường. Đa số chúng được thu nhận từ chủng Bac.subtilis hay những vi
khuẩn khác.
1.1.1.2.3. Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động
Đây là cách phân loại chi tiết nhất, cách phân loại này dựa trên đặc điểm cấu tạo
trung tâm hoạt động của enzyme nên phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme đó.
Theo cách phân loại này protease được chia thành 4 nhóm.
Nhóm I: Cystein - protease ( EC.3.4.22)
11

- Còn được gọi là thinol protease hoặc sulfhydryl protease.
- Đặc trưng cho nhóm này là papain, bromelin, ficin và một số protease từ vi sinh vật.
- Trung tâm hoạt động bao gồm 2 acid amin là cysteine và histidine
- Hoạt động trong vùng pH rộng trong khoảng 4,5 – 10, tuy nhiên vùng pHopt là 6 –
7,5, phụ thuộc vào cơ chất
- Có khả năng bền với nhiệt độ từ 60 – 800C ở pH tự nhiên
- Nhóm enzyme này rất nhạy với các phản ứng oxy hóa, vì vậy người ta thường dùng
chúng kèm theo tác nhân khử (ví dụ cystein), hoặc dùng các chất có cấu trúc không gian
phức tạp như EDTA.
- Bị ức chế hoạt động bởi chất sulfhydryl.
- Nhóm II: Aspartic protease (EC 3.4.23)
- Còn được gọi là acid protease
- Đại diện cho nhóm các enzyme như rennin, pepsin.
- Aspartic protease có nguồn gốc từ VSV, được chia làm hai nhóm là pepsin-like và
rennin-like. Nhóm pepsin-like thu nhận từ Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Asp.
awamon, Penicilium spp và Trametes sanguinea…Nhóm rennin-like thu nhận từ Asp.usami,
Mucor pusillus…
- Phân tử aspartic protease có hai nhóm carbocyl, 1 ở miền tiếp xúc và một ở tâm hoạt
động. Tâm hoạt động gồm: 2 aspartic acid và 1 tyrosine
- pH hoạt động trong khoảng 2 – 4 và còn gọi là protease-acid, riêng cathepsin D có
pHopt trong khoảng 6 – 7, cắt liên kết k – casein làm đông tụ sữa với tính đặc hiệu rất cao.
- Hoạt tính enzyme bi ức chế bởi peptatin
- Nhóm III: Metallo - protease (EC 3.4.24)
- Các enzyme nhóm này gồm exopeptidase, dipeptidase, amino peptidase,
carboxylpeptidase A & B, prolidase và một số protease thu nhận từ VSV như Bac. cereus,
Bac. megaterium, Bac. subtilis, Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae
- Hầu hết protease đều chứa các ion kim loại trong phân tử enzyme. Phần lớn chúng
chứa 1 mol Zn2+ trên 1 mol protein, nhưng với prolidase và prolinase thì thay bằng 1 mol
Mn2+. Trong đó kim loại đóng vai trò chất nhận điện tử trong enzyme carboxylpeptidase A,

nó thiết lập liên kết với carboxyl trong liên kết peptid và sẽ phân tách liên kết này.
- Hoạt động trong vùng pH 6 – 9
- Các tác nhân vô hoạt là các chất có cấu trúc không gian phức tạp như EDTA hay natri
dodecylsulfate.
12


- Nhóm IV: Serine protease ( EC.3.4.21)
- Đại diện cho nhóm này là các enyme có nguồn gốc từ động vật như trypsin,
chymotrypsin, plasmin và thrombin. Một số khác được tổng hợp từ VSV mà đặc biệt là từ
VK và nấm mốc như B.cereus, B.firmus, B.subtilis, Asp.flavus, Asp. oryzae.
- Hai acid amin hình thành trung tâm hoạt động là serine và histidine.
- Khoảng pHopt là 7 – 11
- Các tác nhân làm mất hoạt tính của enzyme thuộc nhóm này là đi – isopropyl
phosphoroflouridate (DFP) hay phenylmethenesulphosphate ( PMSF), coumarin và một số
chất ức chế thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành, aprotinin, chymostatin.
- Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực nhất là
nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng trong khoảng pH khá rộng từ trung
tính đến kiềm đã làm tăng khả năng ứng dụng của nhóm enzyme này so với các nhóm
protease khác.
1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease
1.1.2.1. Cơ chế phản ứng của protease
Việc thủy phân protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng. Hoạt động của chúng
được chia ra làm 2 loại như sau:
- Thủy phân giới hạn: Enzyme thủy phân có giới hạn đối với một hay một số các liên
kết peptide có trong phân tử protein và tạo thành các peptid phân tử nhỏ.
- Thủy phân không giới hạn: Protein bị thủy phân thành những acid amin
Dưới tác dụng của protease, liên kết peptide -CO-NH- sẽ bị thủy phân tạo thành sản
phẩm là aminoacid và một ít peptide có phân tử nhỏ.
Với 4 nhóm protease được chia theo đặc điểm cấu tạo của trung tâm hoạt động sẽ có 4

cơ chế xúc tác khác nhau như sau:

13


Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của

Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của

Serine - protease [62]

Cystein – protease[63]

14


Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của

Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của

Aspartic – protease[64]

Metallo – protease[65]

* Cơ chế phản ứng của nhóm serine protease
Serine protease có chung nhóm phân loại (EC 3.4.21), là một trong số các
enzyme được nghiên cứu khá rộng rãi. Ngoài khả năng thủy phân protein trong quá trình
tiêu hóa của động vật, serine protease còn tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý trong cơ
thể như làm tan huyết khối và hoạt hóa các bổ thể. Trung tâm hoạt động của nhóm này có
chứa amino acid aspartic, histidin và serine, trong đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ

chất theo cơ chế được trình bày trong hình 1.7

15


Hình 1.6. Các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease
Cơ chế theo hình 1.7 gồm 3 phản ứng:
- Phản ứng 1: Nhóm -OH của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với
nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ diện
(tetrahedral complex).
- Phản ứng 2: Ở trạng thái chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển điện tích
lên O tạo nhóm C=O mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch polypeptide đầu N và
hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme mới.
- Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu C còn lại
và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease.
1.1.2.2. Ứng dụng của enzyme protease[1][11][16]
Ngày nay việc khai thác và sử dụng enzyme đã phát triển thành một nghành công
nghiệp với kỹ thuật hoàn chỉnh đã đem lại nguồn lợi không nhỏ.
Người ta đã tìm ra trên 2000 enzyme khác nhau, nhưng chỉ có 140 enzyme có thể
thương mại được. Năm 1997, thị trường về enzyme đã đạt 150 triệu USD.

16


Trong đó các enzyme thuộc nhóm protease hiện đang được ứng dụng nhiều nhất,
chiếm 59% lượng enzyme được ứng dụng. Đặc biệt là enzyme protease kiềm được ứng
dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn so với các loại enzyme khác.
Ngoài ra protease còn được ứng dụng trong các lĩnh vực:
* Trong công nghiệp thịt
Có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm mềm thịt. Ngoài papain có thể dùng

chế phẩm protease của VSV thủy phân một phần nào đó các protein tham gia trong thành
phần của thịt. Kết quả là chất lượng của các loại thịt được tăng cao.
Để làm mềm thịt có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau:
- Ngâm thịt vào dung dịch có chứa hỗn hợp protease, giữ ở pH và nhiệt độ thích hợp.
Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến và thuận lợi hơn cả.
- Tẩm bột làm mềm thịt (có chứa protease, muối, mì chính) trên bề mặt thịt.
- Tiêm dung dịch enzyme vào mô thịt
- Tiêm enzyme vào máu động vật trước khi giết mổ.
Thịt sau khi làm mềm có thể biến thành các thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.
* Trong công nghiệp sữa
Protease không những có khả năng phân giải protein mà còn có khả năng làm đông
tụ sữa. Protease của nấm mốc và vi khuẩn cũng thể hiện khả năng đó. Tuy nhiên, tất cả các
protease của VSV đều khác với rennin động vật ở chỗ chúng không những làm đông tụ
được sữa mà còn có thể thủy phân sâu casein, do đó ảnh hưởng xấu đến chất lượng phomat.
Trong sản xuất phomat người ta cố gắng tìm những chủng VSV tạo ra được protease
có tính chất giống rennin hoặc thay thế một phần rennin (25 – 50%) bằng protease của VSV.
Ở Nhật, từ canh trường bề mặt Mucor, người ta có thể thu được chế phẩm protease dùng
trong sản xuất phomat. Ở một số nước khác, người ta cũng thu được chế phẩm tương tự nấm
mốc Asp.candidus 11 hoặc từ Bacillus mesentericus
* Trong công nghiệp thuộc da
Trong công nghiệp thuộc da, protease của VSV cũng góp phần quan trọng trong hai
quá trình: Làm mềm da và tách lông [60]. Về mặt này, chế phẩm protease như là một
phương tiện có hiệu quả để hoàn thiện kỹ thuật chế biến da.

17


Protein là một phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy
phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin,
globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả (Christner, 1996; Varela et al., 1997)

* Trong hương phẩm và mỹ phẩm
Protease sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt,
kem đánh răng… Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết, làm cho da mịn. Thuốc
đánh răng có chứa protease có tác dụng chữa viêm lợi và diệt khuẩn. Các loại xà phòng
chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở áo quần, drap ở
bênh viện… khá tốt.
* Trong công nghiệp y dược
Trong công nghiệp y dược, các chế phẩm protease được sử dụng để sản xuất các MT
dinh dưỡng hỗn hợp có proten dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các VSV khác.
Ngoài ra người ta còn thường dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các
huyết thanh kháng độc tố để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch)
Chế phẩm protease thuần khiết được sử dụng trong y học để loại bỏ các tổ chức hoại
tử, hỗ trợ tiêu hóa, loại trừ cholesterol bám trên thành mạch máu và để chữa bệnh viêm tắc
động mạch.
Tác giả Phạm Thị Trân Châu đã kết hợp cùng với bệnh viện quân y 108 nghiên cứu
sử dụng chế phẩm protease có tên gọi Prozumabo để điều trị bỏng, kết quả cho thấy dả mạc
rụng nhanh, vết thương nhanh khỏi [11].
* Trong kỹ nghệ phim ảnh
Protease vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu ảnh quang khác nhau như
điện ảnh, giấy ảnh, phim rơnghen…Các protease sẽ phân giải và hòa tan lớp nhũ tương
gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy
ảnh quý.
* Ứng dụng protease để sản xuất các sản phẩm lên men giàu đạm
- Tương: Nguyên liệu trong sản xuất tương là gạo nếp, đậu tương. Nấm mốc từ ngoài
không khí rơi vào xôi (được nấu lên từ gạo nếp) và phát triển thành phức hệ enzyme
amylase – protease tham gia vào hai quá trình sinh hóa quan trọng là thủy phân protein của
đậu nành thành các acid amin và thủy phân tinh bột thành đường. Do vậy tương có vị ngọt
của đường, vị đậm đà của chất đạm, vị mặn của muối ăn.

18

- Nước mắm: Nước mắm là dịch thủy phân protein cá nhờ hệ enzyme protease của
hệ vi khuẩn có trong ruột cá, mang cá, trong đó chủ yếu là B.subtilis, B.mesentericus. Nếu
để cá tự thủy phân trong quá trình ướp chượp, thời gian sản xuất sẽ kéo dài từ 6 tháng đến 1
năm. Khi thêm nguồn protease từ động vật, thực vật hoặc VSV thì quy trình sẽ rút ngắn về
thời gian. Nếu dùng chế phẩm protease nấm mốc ở độ tinh khiết cao có thể giảm thời gian
ướp chượp xuống chỉ còn 17 – 60 giờ với tỉ lệ enzyme : Cơ chất khoảng 10%. Đây cũng là
cơ sở của việc sản xuất nước mắm ngắn ngày.
- Chao: Là một sản phẩm làm từ đậu nành bằng phương pháp lên men VSV, hệ VSV
chủ yếu trong chao là nấm mốc Mucor: Actinomucor elegans, Mucor hiemalis, Mucor
silvaticus, mucor sultiliscimus, trong đó Actinomucor elegans là tốt nhất.
- Nước chấm lên men: Nước chấm là tên chung chỉ các loại gia vị dạng lỏng chứa
chủ yếu là acid amin, muối ăn và hương vị đặc trưng. Nước chấm được sản xuất từ các
nguyên liệu giàu protein theo hai phương pháp hóa học và lên men vi sinh vật
Phương pháp lên men trong sản xuất nước chấm sử dụng phản ứng thủy phân protein
nhờ xúc tác là enzyme protease từ vi sinh vật.
* Trong chăn nuôi: Nhiều loại protease của vi nấm cũng có thể bổ sung vào khẩu phần ăn
trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nhằm tăng nhanh quá trình tiêu hóa thức ăn, tăng tốc độ
tăng trọng của động vật, nhất là động vật non.
1.1.3. Enzyme protease kiềm
Thế giới ngày nay người ta tập trung quan tâm vào các sản phẩm thân thiện môi
trường và đầu ra của sản phẩm. Nhiều quá trình hóa học đang được thay thế bằng quá trình
thực hiện bằng enzyme. Protease kiềm là một trong những nhóm quan trọng nhất của
enzyme vi sinh do được sử dụng có hiệu quả trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như
công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp thực phẩm, thức ăn gia
súc, công nghiệp dược phẩm và công nghiệp hóa học. Các protease kiềm quan trọng cho
công nghiệp từ nguồn vi khuẩn đã được nghiên cứu rộng rãi, trong đó Bacillus sp được công
bố nhiều. Hầu hết các protease kiềm quan trọng trong công nghiệp chịu được nhiệt độ cao
50-70oC (Bảng 1.1 và Hình 1.8).

Bảng 1.1. Thị trường enzyme toàn cầu dựa trên cơ sở các lĩnh vực ứng dụng (triệu USD)
Lĩnh vực
ứng dụng
Kỹ thuật

2005

2006

2007

2012

1075

1105

1140

1355

19

Tăng trưởng %
2007-2012
3


Thực phẩm

775

800

830

1010

4

Chăn nuôi

240

260

280

375

6

Tổng cộng

2090

2165

2250

2740

4

ezyme phân
tích và y học,
10%

Protease kiềm,
25%

Lipase, 3%
Carbohydratase
khác, 10%

Các protease
khác, 21%

Amylase, 18%
rennins, 10%

Trypsin, 3%

Hình 1.7. Thị trường của các enzyme trên thế giới (Rao el al., 1998)[47]
1.1.3.1. Nguồn thu nhận protease kiềm
Protease kiềm được thu nhận từ các nguồn VSV khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi và
một số ít nấm men.
Trong tất cả các nguồn vi sinh thu nhận protease kiềm thì vi khuẩn là nguồn đặc biệt
quan trọng do được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp dệt,
công nghiệp da, thực phẩm và thức ăn gia súc…

Nguồn lớn nhất protease kiềm vi khuẩn là từ các loài Bacillus. Một số loài nấm được
biết có sản xuất protease kiềm và được sử dụng trong công nghiệp thuộc các loài thuộc chi
Aspergillus. Chỉ có một vài nghiên cứu về nấm men sản xuất protease kiềm. Protease kiềm
được sản xuất từ nấm men như Aureobasidium pullutans, Yarrowia lipolytica, Issatchenkia
orientalis và Criptococcus aureus có pH tối ưu 9-10 và nhiệt độ tối ưu 45-50oC, đã có công
bố về sản xuất một số peptid có hoạt tính sinh học mạnh.
Hiện tại các protease kiềm từ nấm ăn đã được nghiên cứu và công bố. Bảng 1.2 liệt
kê các vi sinh vật sản xuất protease kiềm.
Bảng 1.2. Các protease kiềm từ vi sinh vật (V.K.Nigam et al., 2012)[51]
Vi sinh vật

Ứng dụng

Tài liệu

Pseudomonas aerugenosa

Dùng trong điều trị thay

Najafi et al., 2005

20


PD 100

collagen, xử lí chất thải, tẩy
vết máu và tẩy lông

Thermoactinomyces sp

RM 4

Tẩy lông

Bacillus pumilus Cbs
Streptomyces sp. Ab1

Công nghiệp chất tẩy rửa,
công nghiệp thực phẩm và
công nghiệp dược phẩm
Thuốc tẩy, tẩy lông
Tẩy lông, thủy phân lông vũ

Bacillus subtilis PE-11

Thuốc tẩy

Bacillus sp.SSBi

Công nghiệp chất tẩy rửa
Trích ly chitin, thủy phân
lông vũ, tẩy lông
Ứng dụng

Bacillus sp.Tk1 và TK2

Bacillus licheniformis RP1
Vi sinh vật
Bacillus coagulans
Bacillus licheniformis

Lĩnh vực công nghiệp

Bacillus clausii

Lĩnh vực công nghiệp

Bacillus cereus

Chất tẩy rửa , tẩy vết máu

Bacillus sp.K-30

Loại bỏ protein trong cám
gạo, chất tẩy rửa

Bacillus cereus 1173900
Bacillus circulans
Bacillus subtilis
Pseudomonas fluorescens
Microbacterium AR-68
Streptomyces pulveresceus
Stenotrophomonas
maltophila MTCC 7528
Shewanella oneidensis
MR-1
Streptomyces
orantiograceus EGS-5
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae (kỹ

thuật di truyền) U 1521
Aspergillus
Aspergillus terreus
Aspergillus aidulans Ha10

Verma et al., 2011
Kuberan et al.,2010
Jaouadi et al.,2011
Jaouadi et al.,2011
Adinarayana et
al.,2003
Singh et al.,2005
Hadda et al., 2011
et al.,
Tài liệu
Asokan et al
al.,2010
Vadlamani et
al.,2011
Abou- elela et al.,
2011
Naidu et al.,2005

Ravindran et
al.,2011
Prakasham eal.,2005
Loại bỏ lông trong công
Mukhtar and Haq et
nghiệp thuộc da
al., 2008

Kalaiarasi and
Chất tẩy rửa, công nghiệp dệt
Sunitha et al.,2009
Chất tẩy rửa, công nghiệp
Gessesse et al.,1997
thuộc da
Jayasree et al., 2009
Chất tẩy rửa cho vào khi giặt
Kuddus et al.,2011
với nước lạnh, bảo vệ môi
trường vùng lạnh
Tẩy lông

Lĩnh vực công nghiệp

Anbu et al.,2009

Công nghiệp nhiệt độ cao

Ahmad, 2011

Chất tẩy rửa
Công nghiệp thực phẩm và
thức ăn động vật

Devi et al.,2008
Samarntar et
al.,1999

Công nghiệp da và thực phẩm

Chellapandi, 2011

Công nghiệp thực phẩm, công
nghiệp y dược và công

Charles et al.,2008

21


Engyodontium album
BTMFS10
Aspergillus flavus

nghiệp da
Chất tẩy rửa, thu nhận bạc
trong trong xử lí phim
Công nghiệp chất tẩy rửa,
tổng hợp peptid

Jasmin et al.,2010
Yadav et al., 2011

1.1.3.3. Sản xuất protease kiềm
Để có thể sử dụng enzyme protease kiềm trong công nghiệp, đòi hỏi phải sản xuất
công nghiệp. Hiện tại phương pháp lên men bán rắn và phương pháp lên men chìm đều
được sử dụng.
Các thành phần môi trường đặc biệt là nguồn carbon và nitơ cũng như các thông số
lên men như nhiệt độ, pH, chế độ oxy hòa tan, chế độ đảo trộn trong lên men bán rắn và chế

độ khuấy trộn trong lên men chìm là những yếu tố có ảnh hưởng rất quan trọng đến năng
suất lên men (Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Thông số hóa lí sản xuất protease kiềm (V.K.Nigam et al., 2012)[51]
Tốc
độc
lắc,
khuấy
(rpm)

Tài liệu

Nguồn
carbon

Nguồn nitơ

pH

Nhiệt
độ
(0C)

B.licheniformi
s N2

Glucose

Bột đậu
nành tách
dầu

10

37

140

Nadeem et
al., 2008

Bacillus
subtilis CR
179

Tinh
bột,
maltose

Cao ngô

8

45

150

Akhavan et
al., 2011

A. niger

Glucose

Ammonium
sulphate

8,5

45

150

Devi et al.,
2008

Halobacterium
sp. IS

Cám gạo

Bột đậu nành
tách dầu

7

40

200

Vijayanand

et al., 2010

Bacillus subtilis
SVR-07

Glucose

Bột đậu nành
tách dầu

9,0

55

150

Reddy et al.,
2011

Bacillus brevis

Lactose

Bột đậu nành
tách dầu

10,5

37

200

Banerjee et
al., 1999

Bacillus
licheniformis
NCIM 2042

Tinh bột

Bột đậu nành
tách dầu

7

37

180

Bhunia et
al.,2010

Bacillus
subtilis RSkk96

Arabino
se

Cao thịt bò

9

37

150

Akcan et al.,
2011

Vi sinh

22


Pseudomonas
fluorescens
Microbacteriu
m
AR-68
Streptomyces
pulverescens

Cám mì

Peptone

9

37

-

Kalaiarasi et
al.,2009

Glucose,
sucrose

Pepton

10,3

32

-

Gessesse et
al.,1997

Tinh bột

Casein

9

33

-

Jayasree et
al.,2009

Mỗi chủng VSV sản xuất protease kiềm đều đòi hỏi những điều kiện khác nhau, một
số chủng vi sinh đòi hỏi phải có các ion kim loại dưới dạng các muối cho vào môi trường.
Vì chi phí giá cả của môi trường lên men liên quan đến giá thành sản phẩm, đồng
thời theo xu hướng sản xuất sạch hơn, một số chất thải trong nông nghiệp có thể được sử
dụng có hiệu quả trong công nghiệp sản xuất protease kiềm như cám gạo, cám lúa mì, trấu
lúa, vỏ đậu các loại.v.v.. Hầu hết các vi sinh vật sản xuất protease kiềm ở pH 8-9 và nhiệt độ
32 - 45oC.
Để đạt được năng suất tối đa và sử dụng tiết kiệm các nguồn nguyên liệu, vật tư,
năng lượng, các nhà nghiên cứu đã liên tục nghiên cứu tối ưu các điều kiện sản xuất. Theo
truyền thống các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu từng biến số theo thời gian, mỗi biến số cho
một tối ưu độc lập. Điều này tốn rất nhiều thời gian, chi phí tốn kém và không phản ảnh
đúng giá trị tối ưu khi có một số lượng lớn các biến số tham gia và can thiệp bởi sự tương
tác giữa chúng.
Gần đây một số phương pháp thống kê như phương pháp Taguchi, thiết kế PlacketBurman và phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) cho kết quả tối ưu hóa nhanh hơn, giúp ta
hiểu biết tốt hơn sự tương tác giữa các biến số (bảng 1.4).
Bảng 1.4. Các phương pháp thống kê tối ưu hóa sản xuất protease kiềm
(V.K.Nigam et al., 2012) [51]
Phương pháp

Vi sinh

tối ưu hóa

Các thông số

Cải thiện

được tối ưu

năng suất

Plackett-

Bacillus.

Lượng giống,

Burman, và

licheniformis

nhiệt độ, pH, tốc

RSM

NCIM 2042

độ khuấy

Phương pháp

Bacillus

Plackett-

subtilis

Burman

DKMNR

Plackett-

Bacillus

Thành phần môi

Burman và

subtilis C4

trường, và tốc độ

Nguồn carbon,
nitơ

23

1,72 lần

4,4 lần

2,2 lần

Tài liệu

Bhuniaa et al.,

2012

Kezia et al., 2011

Romsomsa et al.,
2010