Nghiên cứu tạo chế phẩm bảo tử bacillus subtilis bất hoạt hấp phụ kháng nguyên cúm a h5n1 và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên chuột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI














LÊ LAN HƯƠNG


NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM BÀO TỬ
BACILLUS SUBTILIS BẤT HOẠT HẤP PHỤ KHÁNG
NGUYÊN CÚM A/H5N1 VÀ ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH
ðÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60.42.02.01


GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. ðINH DUY KHÁNG
GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH


HÀ NỘI - 2013

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn
toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tác giả luận văn



Lê Lan Hương

iii


LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn,
giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của toàn thể cán bộ nghiên cứu của phòng Vi sinh
vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam. Và sự hướng dẫn, góp ý của quý thầy cô cùng
toàn thể cán bộ Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – Khoa Công nghệ Sinh
học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô Trường ðại học
Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi
suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS. TS. Nguyễn Quang Thạch
ñã truyền ñạt những kiến thức mới và giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn
thành luận văn.
Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất ñến PGS.TS. ðinh
Duy Kháng ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu
ñể tôi hoàn thành khóa luận, mà trên tất cả là truyền ñạt cho tôi kinh nghiệm
làm việc và tư duy nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã tạo rất nhiều ñiều
kiện, giúp ñỡ tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn này.
Hà Nội, ngày 12 tháng 09 năm 2013
Học viên

Lê Lan Hương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

iv

MỤC LỤC

Lời cam ñoan ii
Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục các chữ viết tắt vii
Danh mục bảng viii
Danh mục hình ix
MỞ ðẦU 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 Diễn biến dịch cúm gia cầm A/H5N1 4
1.1.1 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới 4
1.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam 7
1.2 ðặc ñiểm virus cúm A/H5N1 11
1.2.1 Phân loại và cấu trúc di truyền virus cúm A/H5N1 11
1.2.2 Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm 13
1.2.3 Các phân ñoạn mã hóa các kháng nguyên bề mặt chủ yếu 15
1.3 Phương pháp chẩn ñoán và dự phòng 16
1.3.1 Phân lập và ñịnh loại virus 16
1.3.2 Phát hiện vật liệu di truyền của virus 17
1.3.3 Các kỹ thuật miễn dịch sử dụng trong chẩn ñoán huyết thanh học
và nghiên cứu cúm

17
1.3.4 Vaccine phòng cúm A/H5N1 19
1.3.5 Chất bổ trợ dùng trong vaccine cúm A/H5N1 21
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1 Vật liệu nghiên cứu 24
2.1.1 Sinh phẩm nghiên cứu 24
2.1.2 Các dung dịch, hoá chất, môi trường dùng trong nghiên cứu 24


v


2.1.3 Các trang thiết bị và dụng cụ dùng cho nghiên cứu 25
2.2 Phương pháp nghiên cứu 27
2.2.1 Ấp trứng 27
2.2.2 Soi trứng 27
2.2.3 Tiêm trứng 27
2.2.4 Thu hoạch trứng 28
2.2.5 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (kiểm tra hiệu giá HA) 29
2.2.6 Phương pháp sản xuất kháng nguyên virus tinh chế 30
2.2.7 Phương pháp ñiện di protein 31
2.2.8 ðịnh lượng HA bằng phương pháp khuếch tán miễn dịch (SRD) 32
2.2.9 Phương pháp ELISA 33
2.2.10 Phương pháp phân tích khả năng hấp phụ hạt virus bất hoạt trên
bào tử B.subtilis 34
2.2.11 Phương pháp chuẩn bị chế phẩm bào tử B.subtilis PY79 hấp phụ
hạt virus cúm NIBRG-14 tinh chế bất hoạt
35
2.2.12 Gây miễn dịch trên chuột thí nghiệm và thu mẫu ñể phân tích ñáp
ứng miễn dịch

35
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1 Kết quả sản xuất kháng nguyên tinh chế 36
3.1.1 Kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu của dịch niệu nhiễm cúm
H5N1 chủng NIBRG-14 ñể sản xuất kháng nguyên tinh chế
36
3.1.2 Kết quả tinh chế kháng nguyên HA bằng li tâm siêu tốc trên
gradient saccaroza
37
3.1.3 Kết quả thẩm tích 38
3.1.4 Kết quả ñiện di SDS-PAGE kiểm tra protein virus cúm NIBRG-
14 sau khi tinh chế 39
3.1.5 Kết quả ñịnh lượng bằng phương pháp Bradford 40

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

vi

3.1.6 Kết quả ñịnh lượng kháng nguyên HA bằng phương pháp khuếch
tán miễn dịch trên gel thạch (SRD)
43
3.2 Kết quả sản xuất chế phẩm bào tử Bacillus subtilis PY79 hấp phụ
hạt virus tinh chế
44
3.2.1 Kết quả hấp phụ virus lên bào tử 44
3.2.2 Kết quả tạo ñáp ứng kháng thể trên chuột gây miễn dịch bằng chế
phẩm bào tử B.subtilis PY79 bất hoạt hấp phụ virus
cúm A/H5N1 (NIBRG-14) tinh chế
46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

1 Kết luận 49
2 Kiến nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC 57
CÔNG TRÌNH ðà CÔNG BỐ LIÊN QUAN ðẾN LUẬN VĂN 61








vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1. BSA: Albumin from Bovine Serum (Albumin từ huyết thanh bê)
2. CDC: Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm soát
và Ngăn ngừa dịch bệnh)
3. FAO: Food and Agriculture Organisation of United Nations (Tổ chức
lương thực và nông nghiệp của Liên hiệp quốc)
4. HPAI: Highly pathogenic avian influenza (Cúm gia cầm ñộc lực cao)
5. IVI: International Vaccine Institute (Viện Vaccine Quốc tế)
6. MDCK: Madin – Darby Canine Kidney (Tế bào thận chó Madin – Darby)
7. NIBSC: The National Institute for Biological Standards and Control (Viện
Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm ñịnh Sinh học)
8. OIE: World Organisation for Animal Health (Tổ chức Thú y Thế giới)
9. PBS: Phosphate Buffered Saline (Muối ñệm phosphate)

10. WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

viii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang
1.1 Thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên thế giới ñược báo cáo
cho Tổ chức Y tế Thế giới năm 2003-2013
6
1.2 Tổng hợp tình hình bệnh cúm gia cầm trong 5 năm (2008-2012) 9
2.1 Thành phần gel polyacrylamit 31
3.1 Giá trị OD
595
nm của ñường chuẩn BSA và mẫu virus 41
3.2 Kết quả ñáp ứng kháng thể HI của các nhóm chuột ñược gây miễn dịch với
các công thức khác nhau
48



ix


DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 So sánh diện dịch cúm qua các năm 10
1.2 Số lượng các ổ dịch xuất hiện trung bình trong 1 năm chia theo
các tháng
10
1.3 So sánh mức ñộ dịch cúm qua các năm 11
1.4 Cấu trúc hạt virion và hình thái của virus cúm A 13
3.1 Kết quả phản ứng ngưng kết hồng cầu của dịch niệu 36
3.2 Hai dải băng virus xuất hiện sau khi li tâm phân vùng 37
3.3 Kết quả ñiện di kiểm tra protein của virus NIBRG-14 sau tinh chế 39
3.4 ðồ thị biểu diễn ñường chuẩn tương quan giữa giá trị OD
595nm
và
nồng ñộ BSA
42
3.5 Kỹ thuật SRD ñịnh lượng kháng nguyên HA. 43
3.6 Kết quả hấp phụ hạt virus cúm A/H5N1 (NIBRG-14) tinh chế lên
bào tử B. subtilis PY79 bất hoạt.
45
3.7 Kết quả ñáp ứng kháng thể của chuột gây miễn dịch với kháng
nguyên cúm NIBRG-14.
47






1

MỞ ðẦU

1. ðặt vấn ñề
Trên thế giới, bệnh cúm gia cầm A/H5N1 ñã lan rộng ra nhiều nước
thuộc Châu Á, Châu Âu và Châu Phi. Hàng triệu gia cầm ñã bị chết và bị tiêu
huỷ mỗi năm do virus cúm H5N1. Ở nước ta, bệnh cúm A/H5N1 trên gia cầm
xảy vào cuối năm 2003, nhưng ñến nay bệnh vẫn còn xảy ra ở nhiều ñịa
phương trên toàn quốc và có tính lặp lại hàng năm. Do ñó, bệnh cúm gia cầm
vẫn ñang là nỗi lo lớn của người chăn nuôi gia cầm và gây nhiều thiệt hại cho
ngành chăn nuôi trong nước. Nghiêm trọng hơn, virus cúm A/H5N1 có thể
biến ñổi, lây nhiễm từ gia cầm sang người với các triệu chứng lâm sàng rất
trầm trọng và gây ra nhiều ca tử vong.
Trước tình hình cấp bách trên, WHO ñã kêu gọi các nước cùng hợp tác
trong phòng chống dịch cúm gia cầm H5N1. Thế giới ñã triển khai nhiều biện
pháp phòng chống tổng hợp nhằm khống chế dịch bệnh, trong ñó biện pháp
sử dụng vaccine ñược xem là công cụ hữu hiệu trong việc khống chế và tiến
tới thanh toán dịch bệnh.
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống cúm cũng
là nhiệm vụ cấp bách ñược ñặt ra. Nhiều ñơn vị trong nước ñã nghiên cứu sản
xuất vaccine H5N1 phòng bệnh cho gia cầm và cho người như Viện Công
nghệ sinh học, Công ty vaccine và sinh phẩm số 1 (VABIOTEC), Viện
Vaccine Nha Trang, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Các vaccine cúm ñược
sản xuất tại Việt Nam ñều sử dụng chủng virus cúm tái tổ hợp ñược tạo trên
cơ sở di truyền ngược với hai gen HA và NA lấy từ chủng
A/Vietnam/1194/2004(H5N1) và 6 gen còn lại ñược lấy từ chủng A/PR/8/34
(H1N1). Các vaccine sản xuất trên cơ sở các chủng virus ñược tạo ra bằng di
truyền ngược có lợi thế là giảm ñộc lực, ñảm bảo an toàn cho sản xuất nhưng
có tính sinh miễn dịch thấp. ðối với vaccine cúm H5N1 sử dụng chủng di

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

2

truyền ngược, người ta bắt buộc phải sử dụng chất bổ trợ vaccine. Hiện nay,
Viện Công nghệ sinh học ñã sản xuất thành công vaccine cúm gia cầm H5N1
với chủng NIBRG-14 nhận của NIBSC (Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và
Kiểm ñịnh sinh học), Vương Quốc Anh. Vaccine ñã ñược thử nghiệm công
cường ñộc tại viện thú y và ñã chuyển giao công nghệ sản xuất cho
NAVETCO, Thành phố Hồ Chí Minh. Chất bổ trợ vaccine dùng cho vaccine
cúm gia cầm ñược sử dụng ở Việt Nam là Montanide ISA 50 và Montanide
ISA 70. ðối với vaccine cúm cho người, các cơ sở sản xuất ñều dùng chất
chất bổ trợ vaccine là hydroxide nhôm. Tuy nhiên, ñây là những chất bổ trợ
có giá thành tương ñối cao. Hơn nữa, cho ñến nay, các vaccine cúm H5N1
dùng cho gia cầm và cho người ở Việt Nam ñược ñưa vào cơ thể qua ñường
tiêm bắp, chưa có công trình nào nghiên cứu về khả năng tìm kiếm phương
thức ñưa vaccine vào cơ thể qua ñường hô hấp bằng phương pháp khí dung và
ñánh giá tính sinh miễn dịch của vaccine.
Việc tiếp tục tìm kiếm các chất bổ trợ vaccine có ưu thế hơn, ñặc biệt
các chất bổ trợ ñưa vaccine qua ñường mũi bằng khí dung ñể tạo ñáp ứng
miễn dịch tại chỗ là công việc ñã và ñang ñược nhiều phòng thí nghiệm trên
thế giới quan tâm. Các chất bổ trợ ñể ñưa vaccine vào cơ thể qua ñường hô
hấp – khí dung tạo ñáp ứng miễn dịch tại chỗ có ý nghĩa ñặc biệt vì giá thành
hạ và ít tác dụng phụ. Bào tử Bacillus subtilis ñã ñược nhiều phòng thí
nghiệm trên thế giới chứng minh là chất bổ trợ vaccine tạo ñáp ứng miễn dịch
tại chỗ có tiềm năng. ðây sẽ là phương pháp có lợi thế vì dễ thực hiện, giá
thành rẻ, dễ triển khai rộng rãi, ñặc biệt ñối với gia cầm.

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành ñề tài: Nghiên cứu tạo
chế phẩm bào tử Bacillus subtilis bất hoạt hấp phụ kháng nguyên cúm
A/H5N1 và ñánh giá khả năng sinh ñáp ứng miễn dịch trên chuột.

3


2. Mục tiêu
Tạo ra ñược qui trình sản xuất chế phẩm bào tử Bacillus subtilis bất
hoạt hấp phụ kháng nguyên cúm A/H5N1 ở qui mô phòng thí nghiệm và kích
thích sinh ñáp ứng miễn dịch phòng chống cúm A/H5N1 trên chuột khi gây
miễn dịch qua ñường mũi bằng khí dung.
3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu tạo chế phẩm virus cúm A/H5N1 bất hoạt tinh chế hấp phụ
bào tử Bacillus subtilis bất hoạt.
Gây miễn dịch cho chuột ñánh giá khả năng sinh ñáp ứng miễn dịch.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Diễn biến dịch cúm gia cầm A/H5N1
1.1.1. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới
Virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện trên thế giới ñã từ lâu. Ngay từ năm
1988, De BK và cộng sự ñã giải mã ñược gen mã hoá hemagglutinin (gen H5)
của virus cúm H5N1 phân lập ở Scotland (De BK và cs, 1988). Nhóm tác giả
này cũng ñã thành công trong việc tạo ra vaccine H5N1 tái tổ hợp bằng việc
chuyển gien H5 phân lập ñược vào virus ñậu mùa chủng vaccine. Tuy nhiên,
virus cúm gia cầm chỉ ñược ñặc biệt quan tâm khi virus này ñược phân lập từ
một trẻ em ba tuổi bị tử vong ở Hong Kong năm 1997 (Subbarao K và cs,

1998). Theo thông báo của WHO, tới cuối năm 1997, ñã có 18 trường hợp
nhiễm cúm H5N1 tại Hong Kong, trong ñó có 06 ca tử vong. Tình hình ñặc
biệt trở nên nghiêm trọng từ cuối năm 2003 ñầu năm 2004, khi dịch cúm gia
cầm ñã lan rộng ra nhiều nước châu Á bao gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung
Quốc, Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái Lan và Indonesia. Tại các nước này,
hàng triệu gia cầm ñã bị chết và bị tiêu huỷ do virus cúm H5N1.
Năm 2009, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại 17 quốc gia và vùng lãnh
thổ bao gồm: Afghanistan, Bangladesh, Cămpuchia, Trung Quốc, ðức, ðặc
khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Nhật Bản, Lào, Mông Cổ, Nepal,
Nigeria, Nga, Tây Ban Nha, Thái Lan, Togo, Việt Nam.
Năm 2010, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại 16 quốc gia và vùng lãnh
thổ bao gồm: Bangladesh, Bhutan, Bungari, Cămpuchia, Trung Quốc, ðặc
khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Israel, Lào, Mông Cổ, Myanmar, Nepal,
Rumani, Nga, Tây Ban Nha và Việt Nam.
Năm 2011, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại các quốc gia và vùng lãnh
thổ bao gồm: Bangladesh, Cămpuchia, Trung Quốc, Ấn ðộ, Indonesia, Iran,


5


Israel, Nhật Bản, Mông Cổ, Myanmar, Hàn Quốc, Hy Lạp, ðặc khu hành
chính Hồng Kông và Việt Nam.
Từ ñầu năm 2012 ñến nay, dịch cúm trên gia cầm ñã xảy ra tại: Ai Cập,
Bangladesh, Nepal, Bhutan, Ấn ðộ, ðặc khu hành chính Hồng Kông, ðài
Loan (Trung Quốc), Myanmar, Israel, Việt Nam, Bangladesh, Indonesia,
Nepal, Bhutan.
Tính ñến nay, virus H5N1 ñã lan rộng ra hơn 60 nước thuộc châu Á,
châu Âu và châu Phi (Peiris JSM et al. 2007; Cục Thú y, 2012).
Tình hình càng trở nên rất ñáng lo ngại khi H5N1 có thể nhiễm từ gia

cầm sang người với các triệu chứng lâm sàng rất trầm trọng và gây ra nhiều
ca tử vong. Theo số liệu thống kê của WHO, tính ñến tháng 6 năm 2013, trên
toàn thế giới ñã phát hiện ñược 630 trường hợp nhiễm cúm gia cầm H5N1, trong ñó
có 375 trường hợp tử vong (WHO-
interface/EN_GIP_20130604CumulativeNumberH5N1cases.pdf). Các quốc gia
có bệnh nhân cúm trong năm 2012 gồm: Bangladesh (3 ca), Cambodia (3 ca),
Trung Quốc (2 ca), Ai Cập (11 ca), Indonesia (9 ca) và Việt Nam (4 ca). Trong 6
tháng ñầu năm 2013, số người bị nhiễm cúm H5N1 có: Bangladesh (1 ca),
Cambodia (11 ca), Trung Quốc (2 ca), Ai Cập (4 ca) và Việt Nam (2 ca).

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

6

Bảng 1.1. Thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên thế giới
ñược báo cáo cho Tổ chức Y tế Thế giới năm 2003-2013
Quốc gia
2003-
2009
2010 2011 2012 2013 Tổng số
Mắc

Chết

Mắc

Chết

Mắc

Chết

Mắc

Chết

Mắc

Chết

Mắc

Chết

Azerbaijan 8 5 0 0 0 0 0 0 0 0 8 5
Bangladesh 1 0 0 0 2 0 3 0 1 1 7 1
Cambodia 9 7 1 1 8 8 3 3 11 8 32 27
China 38 25 2 1 1 1 2 1 2 2 45 30
Djibouti 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
Egypt 90 27 29 13 39 15 11 5 4 3 173

63
Indonesia 162

134

9 7 12 10 9 9 0 0 192

160

Iraq 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2
Lao People's
Democratic
Republic
2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2
Myanmar 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
Nigeria 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
Pakistan 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1
Thailand 25 17 0 0 0 0 0 0 0 0 25 17
Turkey 12 4 0 0 0 0 0 0 0 0 12 4
Việt Nam 112

57 7 2 0 0 4 2 2 1 125

62
Tổng cộng 468

282

48 24 62 34 32 20 20 15 630

375


Trong các năm lưu hành trên gia cầm, thủy cầm và chim hoang dại,
virus cúm H5N1 ñã trải qua sự biến ñổi về mặt di truyền rất ñáng kể và tạo ra
tới 10 clade (từ Clade 0 ñến clade 9) với nhiều Subclade khác nhau (CDC-
www.cdc.gov/EID/content/14/7/e1.htm
). Clade 2.2 xuất hiện ñầu tiên tại Hồ
Qinghai, Trung Quốc sau ñó lan rộng ra nhiều nước châu Á, châu Âu, châu

7


Phi trong giai ñoạn 2006-2007 và hiện vẫn ñang tồn tại trong quần thể gia
cầm ở một số nước thuộc châu Á và châu Phi (Li Y et al. 2011). Trong thời
gian này, clade lưu hành chủ yếu ở ðông Nam Á là clade 2.3.4. Gần ñây,
clade 2.3.2 lại ñược phát hiện trên chim hoang dại ở Hồng Kong, Nhật Bản,
Nga và Mông Cổ. Người ta cũng phát hiện sự xuất hiện lặp ñi lặp lại của
clade 2.3.2 ở chim hoang dại tại châu Âu, ñồng thời cũng thấy các vụ dịch do
clade này xuất hiện thường xuyên hơn ở các nước ðông Nam Á (Kang HM et
al. 2011; Reid SM et al. 2011). Các chủng virus cúm ñược phân lập và xác ñịnh từ
ngày 16 tháng 2 ñến ngày 19 tháng 9 năm 2011 thuộc các clade sau: Clade 1.1,
Clade 2.2.1, Clade 2.2.1.1, Clade 2.2.2, Clade 2.3.2.1, Clade 2.3.4, Clade 2.3.4.2
(WHO- www.who.int/csr/disease/avian_influenza/
uidelines/ 011_09_h5_h9_
accinevirusupdate.pdf). Tuy nhiên, cho ñến nay, các chủng virus cúm H5N1 nhiễm
sang người chỉ tìm thấy ở 4 clade: clade 1, clade 2.1, clade 2.2, and clade 2.3.4
(Webster RG and Govorkova EA, 2006).
Vụ ñại dịch cúm H1N1 xuất hiện vào mùa xuân năm 2009 làm cho
hàng trăm ngàn người mắc trên toàn thế giới (Qiu J, 2009; Stone R, 2009).
Người ta sợ rằng nếu cứ tồn tại ñồng thời hai phân type (subtype) cúm
H5N1 ñộc lực cao và H1N1 ñại dịch có khả năng lây truyền cao từ người
sang người thì nguy cơ tạo ra một chủng tái tổ hợp vừa có ñộc lực cao vừa
có khả năng lây truyền từ người sang người là một hiểm họa ñối với nhân
loại (Huang YH, 2009).
1.1.2. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng
12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau ñó ñã nhanh chóng lan tới hầu hết các

tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn. ðây là lần ñầu tiên
dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia
cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân. Dịch cúm gia
cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều ñịa phương trong cả nước. Thống

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

8

kê các ñợt dịch lớn trong cả nước từ năm 2003 -2012 như sau:
Từ tháng 12/2003 ñến tháng 3/2004, dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà
Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai
tháng ñã xuất hiện ở 57/64 thành trong cả nước. Tổng số gà và thủy cầm mắc
bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng ñàn gia cầm. ðặc
biệt, có 3 người ñược xác ñịnh nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 ñã tử vong
trong ñợt dịch này.
Từ tháng 4/2004 ñến tháng 11/2004, dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh, thời
gian cao ñiểm nhất là trong tháng 7, sau ñó giảm dần ñến tháng 11/2004 chỉ
còn một ñiểm phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu hủy ñược thống kê trong vụ
dịch này là 84.078 con. Và ñã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1,
trong ñó có 9 ca tử vong.
Từ tháng 12/2004 cho ñến tháng 15/12/2005, dịch cúm gà xảy ra trên
36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy ñược Cục Thú y thống kê
là 1,846 triệu con. Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng
rộng rãi cho các ñàn gia cầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng
chống dịch quyết liệt, dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam. Mặc dù
vậy, ñến 06/12/2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 ñã tái bùng phát ở Cà Mau,
sau ñó lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ.
Theo báo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn) ñến ngày 10/06/2007 dịch ñã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố (Nghệ An,

Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam ðịnh, ðồng Tháp, Hải Phòng, Bắc
Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam, Hưng Yên,
Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ ñược khống chế hoàn toàn vào 8/2007.
Dịch bệnh lại tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng
3/2008. Cho ñến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản ñã ñược
khống chế trên toàn quốc (
).
Năm 2009, cả nước ñã có 129 ổ dịch tại 71 xã, phường, thị trấn của 35


9


huyện, thị xã thuộc 18 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và
tiêu huỷ là 112.847 con.
Năm 2010, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 62 xã, phường của 36 huyện,
quận thuộc 23 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là
75.769 con, trong ñó gà là 21.938 con (chiếm 28,95 %), vịt là 52.809 con
(chiếm 69,7 %) và ngan là 1022 con (chiếm 1,34%).
Năm 2011, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 82 xã, 43 huyện, quận thuộc
22 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh là 110.311 con gia cầm trong
ñó có 39,126 con gà, 70,020 con vịt và 1.165 ngan con tổng số gia cầm chết
và tiêu hủy là 151.356 con gia cầm.
Từ ñầu năm 2012 ñến nay, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 296 xã, 121
huyện, quận thuộc 32 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu
hủy là 616.109 con gia cầm trong ñó 117.946 con gà (chiếm 19,14%),
479.859 con vịt (chiếm 77,89%) và 18.304 con ngan (chiếm 2,97%).
()
Bảng 1.2. Tổng hợp tình hình bệnh cúm gia cầm trong 5 năm (2008-2012)
Năm

Số
tỉnh
Số
huyện
Số xã Gà Vịt Ngan Tổng
2008
27 54 80 40525 61027 4506 106.058

2009
18 35 71 24686 85038 3123 112.847

2010
23 36 62 21938 52809 1022 75.769
2011
22 43 82 60787 89204 1365 151.356

2012
32 121 296 117.946 479.859

18304

616.109

Trung
bình/1 năm
25 58 118 53.176 153.587

5.664 212.427

(Cục Thú y, 2012)

Qua 5 năm từ 2008 – 2012, trung bình mỗi năm có khoảng 118 xã tại
58 huyện thuộc 25 tỉnh có dịch. Số gia cầm bệnh chết tiêu hủy là hơn 212

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

10

ngàn con, chủ yếu là vịt chiếm 72,30%, gà chiếm 25,03% và ngan là 2,67%.
Như vậy, bình quân mỗi năm, mỗi tỉnh có dịch có khoảng 5 xã có dịch và tiêu
hủy khoảng 8.500 con gia cầm bệnh.

Hình 1.1: So sánh diện dịch cúm qua các năm
(Cục Thú y, 2012)
Từ năm 2008 ñến 2011, số xã, huyện, tỉnh có ổ dịch là tương ñương
nhau, tuy nhiên năm 2012, số huyện có dịch tăng lên gấp 2 lần và số xã có
dịch tăng lên gấp 3 lần so với những năm trước ñó.

Hình 1.2: Số lượng các ổ dịch xuất hiện trung bình trong 1 năm
chia theo các tháng (Cục Thú y, 2012)


11


Như vậy, các tháng mùa xuân (tháng 1 ñến tháng 3) và mùa hè (tháng
7, tháng 8) là cao ñiểm xuất hiện nhiều ổ dịch cúm gia cầm.

Hình 1.3: So sánh mức ñộ dịch cúm qua các năm
(Cục Thú y, 2012)

Từ năm 2008 ñến 2011, số gia cầm bệnh, chết và tiêu hủy là tương
ñương nhau (khoảng trên dưới 100 ngàn con, chủ yếu vẫn là vịt). Năm 2012,
số gia cầm mắc bệnh, chết tăng cao ñột biến, ñặc biệt là vịt và ngan.
Về tình hình người bị nhiễm cúm gia cầm tại Việt Nam, theo số liệu
của WHO, tính ñến nay, cả nước ñã có 125 ca nhiễm cúm H5N1 trong ñó 62
ca tử vong. Riêng năm 2012 có 4 ca nhiễm cúm trong ñó 2 ca ñã tử vong và 6
tháng ñầu năm 2013 có 2 ca nhiễm cúm trong ñó 1 ca ñã tử vong.
1.2. ðặc ñiểm virus cúm A/H5N1
1.2.1. Phân loại và cấu trúc di truyền virus cúm A/H5N1
Virus cúm A/H5N1 thuộc type A chi Influenzavirus họ
Orthomyxoviridae là họ virus ña hình thái, có vỏ ngoài, genom là RNA ñơn,
âm (-), phân ñoạn. Họ này gồm 4 nhóm virus: Nhóm virus cúm A, nhóm virus
cúm B, nhóm virus nhóm C, nhóm Thogotovirus. Virus Orthomyxoviridae là
tác nhân chủ yếu gây bệnh ñường hô hấp trên ở người, ñộng vật, gia cầm và
chim. Các nhóm virus này khác nhau kháng nguyên ở bề mặt. Trong ñó nói

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

12

chung cúm C là loại thường gặp nhất ở người nhưng hiếm khi gây bệnh trầm
trọng, cúm B thỉnh thoảng bùng phát thành dịch ở trẻ em, còn virus cúm A là
loại có ñộc lực cao nhất có thể gây nên những ñại dịch rất nguy hiểm trên cả
gia cầm và con người trên toàn cầu. Virus họ này rất nhạy cảm với nhiệt ñộ,
với các dung môi hoà tan lipit, các loại hoá chất sát trùng và oxi hoá, với
formaldehyt, và các tia phóng xạ (Murphy, Webster, 1996).
Bốn nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae ñều có hệ gen chỉ gồm
RNA ñơn, sợi âm (negative single stranded RNA – (-)ssRNA), ñộ dài 10.000
– 15.000 nuleotide, ñược phân thành 6 – 8 ñoạn. Mỗi ñoạn gồm nhiều phân tử
axit nucleic, khác nhau về tính chất vật lý, cùng ñược gói lại trong một virion

theo một cơ chế bọc gói rất kỹ lưỡng. Do thông tin di truyền chứa trong các
sợi RNA kích thước nhỏ nên ít xảy ra sự sai lệch thông tin. Nếu một phân tử
bị hư hỏng thì cũng không ảnh hưởng ñến quá trình nhân lên của virus.
Genome của virus cúm A có chiều dài tổng số khoảng 13500
nucleotide, gồm 8 phân ñoạn mã hoá cho 8 protein: Phân ñoạn 1 – 3 mã hoá
cho các protein không cấu trúc (enzyme polymerase – protein sớm phục vụ
cho sao chép nucleic) gồm PB1 (87 kDa), PB2 (84 kDa) và PA (83 kDa);
phân ñoạn 4 mã hoá cho hemaglutinin (HA) (protein bề mặt gắn vào thụ thể tế
bào, gây ngưng kết hồng cầu) (63 kDa khi chưa ñược glycosyl hoá và 77 kDa
nếu ñược glycosyl hoá); phân ñoạn 5 mã hoá cho nucleoprotein (NP) (protein
muộn ñóng vai trò cấu trúc dưới ñơn vị nucleocapsid) (56 kDa); phân ñoạn 6
mã hoá cho enzyme neuraminidase (NA); phân ñoạn 7 mã hoá cho protein
ñệm (M) (matrix protein), gồm 2 tiểu phần M1 (28 kDa) và M2 (11 kDa);
phân ñoạn 8 mã hoá cho protein không cấu trúc (NS) (non – structural
protein) với chức năng chưa rõ, gồm 2 tiểu phần NS1 (27 kDa) và NS2 (14
kDa) (Murphy, Webster, 1996; Luong, Palese, 1992).
Axit nucleic và protein của virus sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung
quanh một trục tạo nên câu trúc ñối xứng xoắn hình cầu (ñường kính 89 – 120
nm) hoặc hình sợi kéo dài (tới vài µm) của virion. Một hạt virion có trọng
lượng phân tử khoảng 250 triệu Da. Nucleocapsid ñược bao bọc bởi màng


13


protein nền M1; phía ngoài màng là lớp lipid kép có nguồn gốc từ màng sinh
chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn ñịnh cấu trúc của virus. Lớp vỏ
ngoài vủa virus còn có các glycoprotein (protein ñã ñược glycosyl hoá).
Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm ñã ñược ñặc
biệt hoá ñể gắn protein màng của virus vào, gồm: protein M2 ñâm xuyên và

nhô ra khỏi vỏ ngoài và 2 protein gai nhô ra ngoài bề mặt (HA và NA).
A B


Hình 1.4: Cấu trúc hạt virion và hình thái của virus cúm A
A: Hình thái hạt virion chụp dưới kính hiển vi ñiện tử;
B: Mô hình cấu trúc hạt virus
(Wikipedia.Bách khoa toàn thư mở)
1.2.2. Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm
Virus cúm xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô ñường hô hấp thông qua
cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể. Sau khi vào ñược trong tế bào biểu mô
ñường hô hấp, virus nhân lên và phát triển rất nhanh, phá vỡ tế bào ñể chui ra
và xâm nhập vào các tế bào lành khác. Ở niêm mạc ñường hô hấp trên, virus
cúm bị các yếu tố miễn dịch không ñặc hiệu của cơ thể như dịch mũi họng,
dịch phế nang và IgA chống lại. Khi virus cúm vượt qua ñược hàng rào này
chúng sẽ xâm nhiễm xuống cơ quan hô hấp dưới, ñó là phổi. Tại ñây chúng
nhân lên rất nhanh và phá huỷ các tế bào.
Quần thể chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời) và gia cầm (vịt, gà tây, gà,
ngan, ngỗng) là các vật chủ tự nhiên của virus cúm A. Do ñó, virus cúm A

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

14

thường không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ cho chim và gia cầm. Tuy
nhiên, một số biến thể cường ñộc (H5, H7) xuất hiện gần ñây do tái tổ hợp với
nhiều gen khác nhau, có thể gây dịch cúm nguy hiểm làm chết hàng loạt cả ở
chim và gia cầm (Li et al., 2004; Alexander, 2007). Thời gian ủ bệnh từ vài
giờ ñến 21 ngày, có trường hợp kéo dài ñến 28 ngày. Gia cầm bệnh sốt cao,
chảy nước mắt, ñứng tụm một chỗ, lông xù, phù ñầu và mắt, da tím tái, chân

xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ. Con vật khi sốt cao có biểu hiện không bình
thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh. Triệu chứng chung
là giảm hoạt ñộng, giảm tiêu thụ thức ăn, gầy yếu. Trường hợp nặng có biểu
hiện ho, khó thở, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật
hoặc ở tư thế không bình thường. Những triệu trứng trên có thể xảy ra cùng
một lúc hoặc riêng rẽ (Lê Văn Năm, 2005).
Tuy nhiên, virus cúm A ñặc biệt là chủng virus A/H5N1 hiện ñang lưu
hành có thể xâm nhiễm gây bệnh ở các loài ñộng vật có vú khác như hổ, mèo
ngựa, lợn và người (Murphy, Webster, 1996; Alexander, 2007). Bệnh lây
truyền nhanh chóng từ cơ thể bệnh sang cơ thể khỏe mạnh bằng ñường hô hấp
thông qua các hạt aerosol có chứa virus trong không khí và/hoặc qua ñường
tiêu hóa do tiếp xúc trực tiếp với các bề mặt (không khí, ñất, nước, phương
tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi bị ô nhiễm (dịch bài xuất, xác vật bệnh,
chất thải) của cơ thể bệnh (Alexander, 2007; Lê Thanh Hòa, 2004).
ðối với người, sau khi nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 1 ñến 5 ngày trung
bình là khoảng 3 ngày. Lúc ñầu bệnh nhân sốt cao 39
o
C và kéo dài từ 1 ñến 3
ngày, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho, sổ mũi nhức ñầu
khủng khiếp, có thể tiến tới khó thở rồi nghẹt thở, kèm theo các rối loạn về
thính giác và thị giác. ðặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 gây tỉ lệ tử vong rất
cao cả ở gia cầm và trên người, có người có thể nhiễm cả ñường hô hấp trên
và dưới (Claas et al., 1998). Trong trường hợp không xảy ra những biến
chứng phức tạp, sự gây nhiễm tự giới hạn và bệnh nhân tự phục hồi trong


15


vòng một tuần. Tuy nhiên, nếu trường hợp diễn biến phức tạp, bệnh có thể trở

nên trầm trọng thậm chí có thể dẫn ñến tử vong, ñó là trường hợp bị biến
chứng ñi kèm viêm phổi do virus hoặc do vi khuẩn hoặc cả hai.
1.2.3. Các phân ñoạn mã hóa các kháng nguyên bề mặt chủ yếu
HA và NA là các kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm A, có
vai trò kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể ñặc hiệu chống lại virus bảo
vệ cơ thể. Các phân ñoạn HA và NA của virus cúm A có tần suất ñột biến cao
và hình thành các phân type HA và NA khác nhau (16 phân type HA và 9
phân type NA). Tuy nhiên chỉ có 4 phân type HA (H1, H2, H3, H5) và 2 phân
type NA (N1, N2) là ñược phân lập từ chủng virus gây bệnh cho người:
- Phân ñoạn HA có ñộ dài thay ñổi tùy theo từng chủng virus cúm A.
ðây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp Hemagglutinin - một kháng
nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm. Glycoprotein HA giúp virus có thể
gắn với các thụ thể sialic acid ñặc hiệu trên bề mặt tế bào, hòa màng và xâm
nhiễm tế bào chủ. Về mặt miễn dịch học, HA là kháng nguyên chủ yếu của
virus cúm A, là ñích quan trọng của các kháng thể trung hòa; do ñó HA là cơ
sở ñể ñiều chế các vaccine phòng cúm hiện nay.
Về cấu tạo, phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å),
bao gồm 3 ñơn phân (trimer), mỗi ñơn phân (monomer) ñược tạo thành từ hai
dưới ñơn vị là HA
1
(36 kDa) và HA
2
(27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu
nối disulfide (-S-S-). Các ñơn phân sau khi tổng hợp ñã ñược glycosyl hóa và
gắn vào mặt ngoài capsid là dưới ñơn vị HA
2
, phần ñầu tự do hình chỏm cầu
ñược tạo bởi dưới ñơn vị HA
1
chứa ñựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của

HA trên bề mặt màng tế bào ñích. Vùng nối giữa HA
1
và HA
2
gồm một số
amino acid mang tính kiềm. ðây chính là ñiểm cắt của protein HA (HA
cleavage site) dưới tác dụng của enzyme protease và trình tự amino acid tại
vùng này có vai trò quyết ñịnh ñộc lực của virus (Bosch et al., 1979;
Gambotto et al., 2008). HA có khối lượng phân tử khoảng 63.10
3
Da (nếu