nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật multiplex ligation dependent probe amplifitication để chẩn đoán đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen smn1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Dương Thị Huệ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT
MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT
PROBE AMPLIFITICATION ĐỂ CHẨN
ĐOÁN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN EXON 7,
EXON 8 CỦA GEN SMN1 GÂY BỆNH THOÁI
HÓA CƠ TỦY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Dương Thị Huệ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT
MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT
PROBE AMPLIFITICATION ĐỂ CHẨN
ĐOÁN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN EXON 7,
EXON 8 CỦA GEN SMN1 GÂY BỆNH THOÁI
HÓA CƠ TỦY
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:
60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN THỊ BĂNG SƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn Thạc sĩ Sinh học với đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ
thuật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến mất
đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy” là công trình nghiên cứu
của cá nhân tôi.
Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong
bất kì công trình nào.
Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham
khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 9 năm 2013
TÁC GIẢ LUẬN VĂN
Dương Thị Huệ

1


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Băng Sương người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể Quý thầy cô trong Khoa Sinh, Trường Đại học

Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đã chỉ dạy giúp đỡ và động viên tôi trong việc thực hiện luận
văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô trong Khoa Sinh, Bộ môn Y sinh học phân
tử, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ
tận tình trong việc nghiên cứu luận văn này.
Xin chân thành gửi lời cảm ơn tới bạn Phạm Quốc An, bạn Nguyễn Huỳnh Minh
Quân và toàn thể cán bộ công tác tại phòng thí nghiệm bộ môn Y sinh học phân tử,
Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bệnh Viện Nhi đồng I, Bệnh viện Nhi đồng II
đã tạo điều kiện cho tôi tiến hành thu thập mẫu nghiên cứu luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè lớp SHTN Khóa 22 đã động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận văn này.
Qua đây con cũng xin được gửi lời biết ơn sâu sắc tới Bố Mẹ và các anh chị đã
động viên hỗ trợ con trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận văn này.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 9 năm 2013
TÁC GIẢ LUẬN VĂN
Dương Thị Huệ

2


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

bp

Base pair

CK

Creatine kinase

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

DQ

Dosage quotients

EDTA

Ethilendiaminetetraacetic acid

FISH

Fluorescent insitu hybridization

kb

Kilobase

kDa

Kilodalton

MLPA

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NCBI

National Center for Biotechnology Information

Nu

Nucleotide

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

SMA

Spinal Muscular Atrophy

SMN

Survival Motor Neuron

snRNP

Small nuclear ribonucleoproteins

TBE

Tris Borate EDTA Buffer

UV

Ultra violet (tia tử ngoại)

μl

Microliter

3


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 2
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... 3
MỤC LỤC .................................................................................................................... 4
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 6
1. Lí do chọn đề tài ..............................................................................................................6
2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................................8

3. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................................8
4. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................................9
5. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................................9
6. Đóng góp của luận văn ...................................................................................................9
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn.................................................................9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 11
1.1. Đặc điểm của bệnh thoái hóa cơ tủy ........................................................................11
1.1.1. Đặc điểm lâm sàng và tiêu chuẩn cận lâm sàng .................................................... 11
1.1.2. Di truyền bệnh SMA ............................................................................................. 12
1.1.3. Bệnh học phân tử ................................................................................................... 14
1.1.4. Chữa trị bệnh SMA ............................................................................................... 22
1.2. Các phương pháp xác định đột biến gen smn1 .......................................................23
1.2.1. Phương pháp Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification ..................... 23
1.2.2. Phương pháp PCR - Restriction fragment length polymorphism (PCR - RFLP) . 26
1.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescent insitu hybridization -FISH) . 27
1.2.4. Real - time PCR .................................................................................................... 28
1.2.5. Giải trình tự gen bằng máy tự động....................................................................... 29
1.3. Lược sử nghiên cứu của đề tài ..................................................................................29
1.3.1. Lược sử nghiên cứu trên thế giới........................................................................... 29
1.3.2. Lược sử nghiên cứu ở Việt Nam ........................................................................... 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 32
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................32
2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất .........................................................................32
2.2.1. Quá trình nghiên cứu sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ sau .............................. 32
2.2.2. Hóa chất ................................................................................................................. 33
4

2.3. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................................34
2.3.1. Xây dựng quy trình nghiên cứu ............................................................................. 34
2.3.2. Quy trình lấy mẫu .................................................................................................. 35
2.3.3.Tách chiết DNA từ bạch cầu máu ngoại vi và dịch ối ........................................... 35
2.3.4. Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA ......................................................................... 36
2.3.5. Sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen
SMN1 ở bệnh nhân SMA ................................................................................................ 37
2.3.6. Sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định người lành mang gen bệnh ở bố mẹ bệnh
nhân ................................................................................................................................. 42
2.3.7. Sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen
SMN1 ở mẫu dịch ối ....................................................................................................... 42
2.3.8. Những lưu ý khi thực hiện phản ứng MLPA......................................................... 42
2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................43
2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ............................................................................43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................. 44
3.1. Kết quả hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu của kit SALSA
MLPA P021-A2 Beckman Coulter Genomelab GeXP ..................................................44
3.2. Kết quả đặc điểm tuổi và giới tính của bệnh nhân .................................................46
3.3. Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen SMN1 của bệnh nhân ...........................47
3.3.1. Kết quả bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp tử exon 7 và 8 ....................... 48
3.3.2. Kết quả bệnh nhân bị đột biến mất đoạn dị hợp tử exon 7 và 8 ............................ 49
3.3.3. Kết quả bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn exon 7 và 8 ................................ 50
3.3.4. Kết quả các dạng đột biến của bệnh nhân ............................................................. 51
3.3.5. Sự phân bố đột biến mất đoạn của gen SMN1 ...................................................... 53
3.4. Kết quả xác định kiểu gen dị hợp tử ở bố mẹ bệnh nhân ......................................55
3.4.1. Kết quả điện di mao quản xác định kiểu gen dị hợp tử của bố mẹ bệnh nhân SMA55
3.4.2. Kết quả các cặp bố mẹ có kiểu gen dị hợp tử ........................................................ 57
3.5. Kết quả chẩn đoán trước sinh...................................................................................60
3.5.1. Kết quả phân tích thai nhi của gia đình bệnh nhân SMA57 .................................. 60

3.5.2. Kết quả phân tích thai nhi của gia đình bệnh nhân SMA11 .................................. 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 66
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 73

5


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Thoái hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy - SMA) là bệnh di truyền do gen lặn nằm
trên nhiễm sắc thể thường, bệnh được mô tả đầu tiên bởi nhà thần kinh học Guido Wernig
(người Australia) vào năm 1891 [10]. Đây là một trong những bệnh thần kinh cơ di truyền
thường gặp. Tần suất mắc bệnh 1/10.000 - 1/25.000 và tần suất người bình thường mang
gen bệnh là 1/50 [40].
Người ta đã phát hiện 4 gen liên quan đến bệnh, mỗi gen gồm hai bản sao có trình tự
tương đối giống nhau: gen SMN (Suvival motor neuron: gồm SMN1 và SMN2); Neuroral
apoptosis inhibitory protein gene (NAIP và ΨNAIP); Basal transcription factor subunit p44
(p44t và p44c); H4F5c và H4F5t [34].
Nguyên nhân chính gây bệnh SMA là do đột biến gen SMN (survival motor
neuron).Gen SMN nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 5 (5q13), gồm hai bản sao
SMN1 và SMN2, hai gen này có trình tự gần như giống nhau, chỉ khác nhau ở 5 nucleotide.
Gen SMN1 nằm ở vùng telomer, gen SMN2 nằm ở vùng centromer trên nhiễm sắc thể. Gen
SMN quy định tổng hợp protein SMN biểu hiện chủ yếu ở các tế bào thần kinh vận động
tủy sống (spinal motor neuron). Cả hai gen SMN1 và SMN2 đều tổng hợp ra protein tương
ứng, tuy nhiên do sự khác nhau ở một vài nucleotide nên SMN1 tổng hợp được protein có
chức năng, trong khi protein do gen SMN2 tổng hợp có chức năng rất hạn chế. Do đó, khi
gen SMN1 bị đột biến dẫn đến không tổng hợp protein thực hiện chức năng gây bệnh
SMA. Các tác giả khẳng định đột biến gene SMN1 là nguyên nhân chính gây nên bệnh

SMA. Các kết quả nghiên cứu cho thấy 94% bệnh nhân thoái hóa cơ tủy bị mất cả hai bản
sao của gen SMN1 còn 6% bệnh nhân rơi vào trường hợp mang kiểu gen SMN1 dị hợp tử,
bệnh nhân có 1 allele SMN1 bị đột biến mất gen SMN1 và 1 allele mang gen SMN1 bị đột
biến điểm, không tổng hợp được protein SMN1 có chức năng [4]. Nghiên cứu của Ogino S.
cho thấy 94% bệnh nhân thoái hóa cơ tủy bị đột biến mất cả hai exon 7 của gen SMN1. Sự
mất exon 7 được chứng minh là do đột biến mất đoạn gen chứa exon 7 hoặc do exon 7 của
gen SMN1 đột biến chuyển thành exon 7 của gen SMN2. Các bệnh nhân bị đột biến mất hai
exon 7 (SMN1) đa số kèm theo đột biến mất exon 8 của gen SMN1, tuy nhiên có trường
hợp vẫn mang ít nhất một bản sao của exon 8 [40].

6


Ngày nay với sự phát triển của kĩ thuật di truyền có rất nhiều phương pháp được áp
dụng để xác định các dạng đột biến gen SMN1 như: Phương pháp PCR - Restriction
fragment length polymorphism (PCR - RFLP), phương pháp Real- time PCR, phương pháp
lai huỳnh quang tại chỗ (FISH),... Hiện nay ở Việt Nam, một số tác giả đã sử dụng kỹ thuật
PCR-RFLP để chẩn đoán bệnh thoái hóa cơ tủy, tuy nhiên phương pháp này chỉ phát hiện
được các bệnh nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 đồng hợp tử mà không phát hiện được kiểu
gen dị hợp tử, do vậy đã bỏ sót tổn thương. Trong những năm gần đây, Multiplex Ligation dependent Probe Amplification (MLPA) là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn
đoán đột biến mất đoạn ngắn, lặp đoạn cũng như phát hiện kiểu gen dị hợp tử với độ chính
xác cao và cho kết quả nhanh chóng. So với các phương pháp khác, MLPA có ưu điểm nổi
bật là giúp phát hiện dạng đột biến gen SMN kể cả những đột biến nhỏ không được xác định
bởi phương pháp FISH và số lượng bản sao của gen, không cần tiến hành xử lí enzyme cắt
giới hạn sau khuếch đại do đó góp phần tiết kiệm thời gian, kinh phí, công sức. Bên cạnh xác
định được mất đoạn đồng hợp tử gen SMN1 thì kỹ thuật MLPA còn giúp phát hiện các cơ
thể mang kiểu gen dị hợp tử thông qua xác định số lượng bản sao gen SMN, giúp phát hiện
người lành mang gen bệnh [28], [36]. Bên cạnh đó, kĩ thuật MLPA còn giúp khảo sát các gen
khác liên quan đến bệnh SMA như NAIP và ΨNAIP,…
Mức độ nguy hiểm của bệnh SMA được xếp thứ hai trong các bệnh lí thần kinh - cơ di

truyền chỉ sau bênh loạn dưỡng cơ Duchenne và chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu,
cuối cùng bệnh nhân sẽ tử vong. Trẻ em mắc bệnh SMA là một gánh nặng cho gia đình, xã
hội và chính bản thân bệnh nhân. Do vậy hiện nay các nhà khoa học chọn lựa phương pháp
sàng lọc trước sinh với mục đích hạn chế sinh ra các em bé mắc bệnh thoái hóa cơ tủy.
Cũng như các bệnh di truyền khác, trong bệnh thoái hóa cơ tủy, người con mắc bệnh không
phải 100% là do nhận gen bệnh từ bố mẹ mà có thể do bản thân người con tự đột biến trong
quá trình hình thành giao tử [42]. Do vậy khi đã chẩn đoán chính xác vị trí đột biến của
người con thì cần phải xác định kiểu gen của bố mẹ bệnh nhân. Nếu bố và mẹ là người
mang gen bệnh (kiểu gen dị hợp tử) thì đến lần mang thai sau bắt buộc phải tiến hành chọc
ối và chẩn đoán xem thai nhi có bị đột biến không để tư vấn di truyền và có hướng xử lý kịp
thời. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng
kĩ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến mất
đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy”.
7


2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định tỉ lệ đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8 của gen SMN1 ở các bệnh nhân
thoái hóa cơ tủy.
- Xác định tỉ lệ người lành mang gen ở bố mẹ bệnh nhân.
- Phân tích kiểu gen của thai nhi và tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng có kiểu gen
dị hợp tử đang mang thai.
3. Đối tượng nghiên cứu
- Nhóm chứng: Gồm 30 người bình thường, không mắc bệnh SMA trong đó có 15
nam và 15 nữ. Được dùng để hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại các đoạn dò và làm mẫu

đối chứng khi tiến hành phản ứng MLPA cùng với mẫu bệnh nhân.
- Nhóm nghiên cứu:
(1) Gồm 50 bệnh nhân: Các bệnh nhân này được chọn từ kết quả chẩn đoán dựa trên
các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như sau:

+ Giảm vận động xu hương gốc chi (khả năng ngồi, khả năng đứng, khả năng đi, khả
năng bú, ảnh hưởng tới cơ hô hấp: Tiếng khóc bé, thở nông).
+ Giảm trương lực cơ.
+ Mất hoặc giảm phản xạ gân xương.
+ Teo cơ gốc chi.
+ Phát triển tinh thần bình thường.
+ Không có rối loạn hoặc mất cảm giác
+ Biểu hiện co cứng cơ cục bộ: Lưỡi rung, rung tay.
+ Biến chứng cơ xương khớp: Cong vẹo cột sống, biến dạng lồng ngực, cứng khớp.
+ Biến chứng cơ xương khớp: Cong vẹo cột sống, biến dạng lồng ngực, cứng khớp.
(2) Xác định kiểu gen dị hợp tử của bố mẹ bệnh nhân: 07 cặp vợ chồng là bố mẹ của
các bệnh nhân được xác định có đột biến mất đoạn exon 7, 8 của gen SMN1 sẽ được phân
tích gen để phát hiện kiểu gen dị hợp tử.
Điều kiện chọn lựa: Bố mẹ của bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu.
(3) Chẩn đoán trước sinh: 02 thai phụ là mẹ bệnh nhân SMA đang mang 02 thai nhi
được thực hiện chẩn đoán trước sinh.
Điều kiện chọn lựa: Gia đình của bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu.

8


4. Nội dung nghiên cứu
- Phát hiện đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8 của gen SMN1 cho các bệnh nhân
thoái hóa cơ tủy.
- Xác định số lượng bản sao exon 7, exon 8 của gen SMN1 giúp xác định kiểu gen của
bố mẹ từ đó đề nghị chẩn đoán trước sinh cho các cặp cha mẹ mang gen.
- Bước đầu chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền cho một số cặp vợ chồng.
5. Phạm vi nghiên cứu
- Phát hiện đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 ở gen SMN1.
- Bước đầu chẩn đoán trước sinh cho một số gia đình bệnh nhân.

6. Đóng góp của luận văn
- Xác định tỉ lệ bệnh nhân SMA mang đột biến gen SMN1 ở Việt Nam bằng phương
pháp MLPA.
- Xác định tỉ lệ cha mẹ bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử bằng phương pháp MLPA.
- Chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền cho các gia đình bệnh nhân SMA mang đột
biến đồng hợp tử gen SMN1.
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
* Ý nghĩa khoa học
Các bệnh lý di truyền nói chung hay bệnh thoái hóa cơ tủy nói riêng là những bệnh
chưa điều trị được ở Việt Nam. Phần lớn chỉ điều trị triệu chứng để kéo dài thời gian sống
của bệnh nhân. Đối với bệnh thoái hóa cơ tủy, phần lớn bệnh nhân tử vong sớm do suy hô
hấp. Tỷ lệ người lành mang gen bệnh chiếm tỷ lệ khoảng 1/50, do vậy nếu không quản lý
được người lành mang kiểu gen dị hợp tử thì gen bệnh sẽ lan truyền trong cộng đồng và tỷ
lệ trẻ em mắc bệnh sẽ ngày càng tăng cao. Từ thực tế này, các nhà khoa học khuyên phải
phát hiện các cặp vợ chồng mang gen bệnh và tư vấn chẩn đoán trước sinh bệnh thoái hóa
cơ tủy để phát hiện sớm các thai nhi mắc bệnh, có hướng xử trí thích hợp. Ở Việt Nam,
phần lớn các cặp vợ chồng không được sàng lọc trước bệnh thoái hóa cơ tủy, đa số đã sinh
con mắc bệnh mới đi khám và phân tích gen. Do vậy chúng ta cần chẩn đoán đột biến gen
SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy ở người con, sau khi xác định được kiểu gen và vị trí đột
biến ở người con sẽ phân tích kiểu gen của bố mẹ xem có mang gen bệnh hay không. Nếu
có thì bắt buộc phải chẩn đoán trước sinh cho thai kỳ tiếp theo. Đề tài này thực hiện với mục
đích trên nên có ý nghĩa khoa học như sau:
9


- Ứng dụng kĩ thuật MLPA trong chẩn đoán bệnh thoái hóa cơ tủy giúp giảm tỉ lệ mắc
bệnh thoái hóa cơ tủy cũng như hạn chế được sự lan truyền gen SMN1 bị đột biến trong
cộng đồng Việt Nam.
- Xác định tỉ lệ các kiểu gen SMN1 ở các bệnh nhân thoái hóa cơ tủy Việt Nam.
* Ý nghĩa thực tiễn

- Chẩn đoán các đột biến gen SMN1 của một số bệnh nhân thoái hóa cơ tủy.
- Chẩn đoán trước sinh cho một số cặp vợ chồng nhằm mục đích tư vấn di truyền trước
sinh.

10


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm của bệnh thoái hóa cơ tủy
1.1.1. Đặc điểm lâm sàng và tiêu chuẩn cận lâm sàng
Bệnh thoái hóa cơ tủy còn được gọi là bệnh teo cơ tủy hay teo cơ thần kinh tủy sống.
Đây là bệnh di truyền với các đặc điểm lâm sàng như sau:
Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN biểu hiện chủ yếu ở các tế bào thần kinh
vận động tủy sống (spinal motor neuron). Gen SMN bị sai hỏng dẫn đến sản xuất ra protein
thiếu hụt chức năng là nguyên nhân chính của bệnh SMA. Do tổn thương các tế bào thần
kinh sừng trước tủy sống nên bệnh nhân có biểu hiện giảm khả năng vận động tiến triển với
các đặc trưng là: Yếu cơ đối xứng gốc chi, trương lực cơ giảm, phản xạ gân xương giảm
hoặc mất, lưỡi rung, biến dạng lồng ngực và cứng khớp. Trường hợp nặng, bệnh nhi chết
trong vòng năm đầu tiên của cuộc đời do biến chứng viêm phổi và suy hô hấp [9].
Dựa vào mức độ thiếu hụt loại protein SMA bệnh được chia làm 3 type khác nhau: I,
II, III; bệnh nhân type I lượng protein SMN giảm nhiều nhất [37].
Theo hội nghị quốc tế về SMA - tháng 6/1992 tại Bonn, Đức bệnh có tiêu chuẩn như
sau [37].
- SMA type I (Bệnh Werdnig-Hoffmann, OMIM 253300): Là thể bệnh nặng nhất trên
lâm sàng, chiếm 25% các type bệnh. Bệnh xuất hiện trước 6 tháng tuổi. Trẻ có biểu hiện
khó thở, khó nuốt, giảm trương lực cơ toàn thân nặng, mất phản xạ gân xương, co rút cơ cục
bộ (lưỡi, mặt), không tự ngồi được. Trẻ phát triển tinh thần bình thường. Cơ hai chi dưới
của trẻ luôn luôn trong tư thế giống như chân ếch. Các cơ liên sườn bị yếu liệt khiến trẻ phải
thở bằng cơ hoành kém hiệu quả. Bệnh tiến triển nhanh, trẻ thường tử vong trước hai tuổi do
viêm phổi và suy hô hấp.

- SMA type II (Bệnh OMIM 253550): Thể này chiếm khoảng 50% các trường
hợp. Bệnh xuất hiện muộn hơn, thường là từ 6 đến trước 18 tháng tuổi. Trẻ có biểu hiện
giảm trương lực cơ, chậm phát triển vận động, có thể ngồi được nhưng không đứng và đi
được. Có biến chứng cong vẹo cột sống và nuốt khó. Trẻ phát triển tinh thần bình thường.
Trẻ có thể sống đến tuổi đi học, một số ít có thể sống đến tuổi trưởng thành [8].
- SMA type III (Bệnh Kugelberg-Welander, OMIM 253400): Đây là thể nhẹ nhất,
chiếm khoảng 25% các type. Bệnh khởi phát muộn và tiến triển chậm. Bệnh xuất hiện sau 2
tuổi. Trẻ chậm phát triển vận động, tự đi được nhưng muộn hoặc biết đi rồi sau đó đi lại khó
11


khăn hơn. Có các biểu hiện của yếu cơ gốc chi, co cứng cơ, cong vẹo cột sống. Trẻ phát
triển tinh thần bình thường nên có thể đi học được. Tỉ lệ sống sót: Một số trẻ biểu hiện bệnh
muộn và tiến triển chậm nên có thể sống đến tuổi trưởng thành [8].
Ngoài ra theo một số tác giả khác còn phân chia thêm SMA type IV: Còn gọi là loại
người lớn, thường xảy ra sau tuổi 30. Các triệu chứng: Bắt đầu teo cơ cột sống thường là
nhẹ đến trung bình và bao gồm yếu cơ, run và co giật.
Các xét nghiệm cận lâm sàng của bệnh bao gồm:
- Xác định hoạt độ enzyme creatine kinase (CK): Creatine kinase là một loại
enzyme có vai trò chuyển hóa năng lượng giúp cho quá trình co cơ. Khác với một số bệnh
thần kinh cơ di truyền như loạn dưỡng cơ Duchenne có nồng độ enzyme CK trong huyết
thanh tăng rất cao (30 - 40 lần so với bình thường), trong bệnh thoái hóa cơ tủy, tổn thương
cơ là do sự thoái hóa của tế bào sừng trước tủy sống, do vậy hoạt độ CK huyết thanh chỉ
tăng nhẹ (2 - 9 lần) hoặc không tăng [8].
- Đo điện cơ đồ: Đây là phương pháp được sử dụng để chẩn đoán phân biệt bệnh lý
teo cơ do tổn thương ở cơ hay do tổn thương thần kinh
Bệnh nhân thoái hóa cơ tủy có hình ảnh bất thường trên bản điện di cơ [11].
+ Ở trạng thái nghỉ: Có sự xuất hiện các hoạt động điện thế tự phát kiểu sóng nhọn
dương và co giật sợi cơ, co giật bó cơ và phóng điện lặp lại phức hợp.
+ Ở trạng thái co cơ: Khoảng điện thế của đơn vị vận động dài ra, biên độ tăng và số

lượng các pha tăng.
+ Ở trạng thái co cơ tối đa: Điện thế của đơn vị vận động giảm kết hợp với giao thoa
không hoàn toàn với các nhịp phóng điện của từng đơn vị vận động nhanh hơn.
1.1.2. Di truyền bệnh SMA
Cơ chế di truyền của bệnh: Bệnh di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường
(nhiễm sắc thể số 5). Do đó bệnh có thể gặp ở cả hai giới nam và nữ. Người bố và người mẹ
mang kiểu gen dị hợp tử tuy không biểu hiện bệnh nhưng sẽ có khả năng truyền gen bệnh
cho con. Khi người con nhận một allele bệnh từ người mẹ và một allele bệnh từ người bố sẽ
có kiểu gen đồng hợp tử và biểu hiệu bệnh.
Trường hợp bố và mẹ có kiểu gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần
sinh như sau (hình 1.1):
- 50% số con là người lành mang gen bệnh
12


- 25% số con là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh
- 25% số con mắc bệnh SMA.

Hình 1.1. Sơ đồ cơ chế di truyền bệnh SMA
(Nguồn: [62])
Trường hợp người bố hoặc người mẹ bình thường, kết hôn với người mang gen bệnh
thì tỉ lệ con là người lành mang gen bệnh là 50%.
Khi người mang gen bệnh kết hôn với người bệnh thì tỉ lệ con bị bệnh là 50% (các
trường hợp được thể hiện trong bảng 1.1).
Ngoài ra, bệnh nhân SMA có thể không nhận gen bệnh từ bố mẹ mà đột biến gen
SMN có thể phát sinh trong quá trình hình thành giao tử (đột biến de novomutation) với tần
số thấp. Tần số phát sinh giao tử đột biến ở người cha là 2,11.10-4 và thấp hơn ở người mẹ
là 4,15.10-5 [42].
Bảng 1.1. Kiểu gen bệnh SMA của bố mẹ và tỉ lệ mắc bệnh ở thế hệ con
Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ

Bố

Mẹ

Rr

Rr

Lành mang gen

Lành mang gen

Tần số con với các kiểu gen khác nhau
RR

13

rr

Rr

Lành

Bệnh Lành mang gen bệnh

25%

25%

50%

bệnh

RR
Lành

bệnh
Rr
Lành mang gen

50%

0

50%

0

50%

50%

0

0

100%

0

100%

0

bệnh

Rr

Rr

Lành mang gen

Bệnh

bệnh
rr

RR

Bệnh

Lành

Rr

Rr

Bệnh

Bệnh

Ghi chú: R: bình thường, r: bệnh
(Nguồn: [11])
1.1.3. Bệnh học phân tử
Người ta đã phát hiện 4 gen liên quan đến bệnh, mỗi gen gồm hai bản sao có trình tự
tương đối giống nhau: Gen SMN (Suvival motor neurongồm SMN1 và SMN2); Neuroral
apoptosis inhibitory protein gen (NAIP và ΨNAIP); Basal transcription factor subunit p44
(p44t và p44c); H4F5c và H4F5t (hình 1.2A) [34].
C

14


Hình 1.2. Sơ đồ vị trí gen SMN và sự
khác nhau giữa hai gen SMN1 và SMN2
A. Cấu trúc vùng gen SMA gồm 4 gen:
H4F5, SMN, NAIP và p44c
B. Năm vị trí nucleotide khác nhau giữa hai
gen SMN1 và SMN2
C. Vị trí 5q13
(Nguồn: [11])

Nguyên nhân chính gây bệnh SMA là
do đột biến gen SMN (survival motor
neuron). Gen SMN nằm trên nhánh dài của
nhiễm sắc thể số 5 (5q13), gồm hai bản sao
SMN1 và SMN2, hai gen này có trình tự
gần như giống nhau, chỉ khác nhau ở 5
nucleotide (Hình 1.2B) [15], [34]. Các tác giả khẳng định đột biến gen SMN1 là nguyên

nhân chính gây nên bệnh SMA. Các kết quả nghiên cứu cho thấy 94% bệnh nhân thoái hóa
cơ tủy bị mất cả hai bản sao của gen SMN1 còn khoảng 6% bệnh nhân rơi vào trường hợp
mang kiểu gen SMN1 dị hợp tử, bệnh nhân có 1 allele SMN1 bị đột biến mất gen SMN1 và
1 allele mang gen SMN1 bị đột biến điểm, không tổng hợp được protein SMN1 có chức
năng [4].
Nghiên cứu của Ogino S. cho thấy 94% bệnh nhân thoái hóa cơ tủy bị đột biến mất cả
hai exon 7 của gen SMN1. Sự mất exon 7 được chứng minh là do đột biến mất đoạn gen
chứa exon 7 hoặc do exon 7 của gen SMN1 đột biến chuyển thành exon 7 của gen SMN2
[41]. Các bệnh nhân bị đột biến mất hai exon 7 (SMN1) đa số kèm theo đột biến mất exon 8
của gen SMN1, tuy nhiên có trường hợp vẫn mang ít nhất một bản sao của exon 8 [41].
1.1.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen SMN1
Gen SMN1 nằm ở vùng telomer, gen SMN2 nằm ở vùng centromer trên nhiễm sắc thể.
Mỗi bản sao dài 27kb, gồm 9 exon (exon 1, 2a, 2b, 3 - 8). SMN2 chỉ khác SMN1 ở 5
15


nucleotide: Một ở intron 6 (A>G), một ở exon 7 (T>C), hai ở intron 7 (G>A, G>A) và một
ở exon 8 (A>G) (hình 1.2B) [15].
Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN biểu hiện chủ yếu ở các tế bào thần kinh
vận động tủy sống (spinal motor neuron). Protein SMN là một protein phổ biến trong tế bào
người với trọng lượng phân tử 38 kilodalton (kDa), gồm 294 amino acid.
Cả hai gen SMN1 và SMN2 đều tổng hợp ra protein tương ứng, tuy nhiên do sự khác
nhau ở một vài nucleotide nên SMN1 tổng hợp được protein có chức năng, trong khi protein
do gen SMN2 tổng hợp có chức năng rất hạn chếdo thiếu hụt exon 7 (hình 1.4). Do đó, khi
gen SMN1 bị đột biến dẫn đến không tổng hợp protein thực hiện chức năng gây bệnh
SMA. Trong đó vùng mã hóa exon 7 đóng vai trò rất quan trọng trong việc mã hóa chức
năng của protein SMN. Đột biến exon 7 làm giảm khả năng tương tác của protein SMN với
các protein khác trong quá trình sinh học (ví dụ: protein neuron specific profilin II) dẫn đến
không thực hiện chức năng bình thường [9]. Nucleotide ở vị trí +6 của exon 7 gen SMN1 là
C, ứng với exon 7 gen SMN2 là T. Sự khác biệt này theo lý thuyết không làm biến đổi dịch

mã, nghĩa là cho dù nucleotide bị thay đổi thì amino acid ứng với vị trí trên vẫn không bị
thay đổi do đây là đột biến đồng nghĩa [52]. Người ta chứng minh rằng đột biến C chuyển
thành T tại exon 7 đã làm ảnh hưởng quá trình hoàn thiện mRNA và gây mất đoạn exon
này, tạo ra protein SMN bị thiếu hụt exon 7 (Δ7 SMN) (hình 1.3) [16].

16


Hình 1.3. Quá trình hoàn thiện mRNA của gen SMN1 và SMN2
A. Quá trình hoàn thiện mRNA của gen SMN1 tạo mRNA hoàn thiện
B. Quá trình hoàn thiện mRNA của gen SMN2 tạo ra 90% mRNA thiếu hụt exon 7
(Nguồn: [16])
Trong quá trình ghép nối nhân tố SF2/ASF cùng với Htra2 và một số yếu tố điều hòa
khác như SRp30c, hnRNP-Q, hnRNP-G sẽ thực hiện quá trình ghép nối, giúp hoàn thiện
pre-mRNA thành mRNA, từ đó tạo ra protein mang đầy đủ chức năng.
Sự khác nhau trong trình tự nuleotide tại vị trí tăng cường quá trình ghép nối (exonic
splicing enhancer - ESE - vùng tăng cường splicing thuộc exon) ở exon 7 sẽ làm cho các
nhân tố ghép nối SF2/ASF của gen SMN1 bám gắn với exon 7 hiệu quả hơn so với
SF2/ASF của gen SMN2. Do đó 100% protein SMN của gen SMN1 mang exon 7 trong khi
đó sự bỏ qua exon 7 của gen SMN2 dẫn đến chỉ có 10% sản phẩm phiên mã của gen SMN2
có exon 7 (hình 1.3A) [17].
Các vùng ISS (intronic splicing silencer - vùng ức chế splicing thuộc intron) như: ISSN1 nằm sau exon 7 là nơi bám của các yếu tố ức chế hnRNP-A1. Khi các yếu tố này hoạt
động, quá trình ghép nối sẽ đi theo xu hướng bị ức chế, protein tạo ra sẽ bị mất đoạn exon 7,
dẫn đến mất chức năng. Ở exon 7 SMN2, sự hiện diện của T thay vì C đã làm phá vỡ ái lực
cao giữa SF2/ASF với ESE, dẫn đến hoạt động của các nhân tố tăng cường ghép nối bị giảm
17


đi đáng kể. Đồng thời, sự thay đổi này cũng làm xuất hiện một vùng ức chế mới nơi mà
hnRNP-A1 có khả năng bám lên. Do đó phần lớn protein tạo ra từ SMN2 đều bị thiếu hụt

exon 7 do ưu thế điều hòa nghiêng về sự ức chế quá trình ghép nối exon 7 [30].

Hình 1.4. Sự khác nhau về chức năng giữa gen SMN2 và gen SMN1
a. Gen SMN1 và SMN2, b. Tiền mRNA của gen SMN2 và gen SMN1, c. mRNA của
gen SMN2 và gen SMN1, d. Protein quy định bởi gen SMN2 và gen SMN1
(Nguồn: [48])
Protein SMN là một protein phổ biến trong tế bào người với trọng lượng phân tử 38
kilodalton (kDa), gồm 294 amino acid. Protein SMN có trong hạt của sợi trục neuron, màng
sinap của tế bào thần kinh cơ và tập trung trong các cấu trúc Cajal boies (CBs) được gọi là
thể cuộn ở nhân tế bào thần kinh cơ.
Protein SMNtham gia vào phức hợp protein SMN, phức hợp này đóng vai trò quan
trọng trong sự lắp ráp các snRNP của tế bào chất cũng như quá trình tái tạo các snRNP và
quá trình ghép nối mRNA (spliceosome) trong nhân tế bào.

18


Phức hợp
SMN

snRNA đi
bà

Bào tương
Methyl
hóa
arginin
e

Phức hợp

snRNP

Hình 1.5. Vai trò của protein SMN trong quá trình lắp ráp snRNPs
Chú thích: CBC: cap - binding - complex; CB: Cajal bodies - Thể cuộn
(Nguồn: [43])
Phức hợp protein SMN (phức hợp SMN) sẽ giúp gắn kết phức hợp Sm (một vòng gồm
7 protein - có màu xanh lá cây trong hình 1.5) với snRNA trong bào tương tạo thành phức
hợp snRNP (small nuclear ribonucleoprotein). Sau đó cùng phức hợp snRNP đi vào trong
nhân. Tại nhân, phức hợp snRNP tách ra tập trung trong thể cuộn (CBs), còn phức hợp
protein SMN sau đó sẽ tham gia vào quá trình ghép nối pre-mRNA thành mRNA hoàn
chỉnh ở trong Gem [43] (Gem thường tìm thấy cùng các thể cuộn). Đột biến mất đoạn exon
7 gen SMN1 làm cho protein SMN không có khả năng liên kết và tái tạo các snRNP.
Mặc dù gen SMN được biểu hiện trong tất cả các mô đóng vai trò quan trọng trong
quá trình ghép nối mRNA trong mọi tế bào. Tuy nhiên khi mức độ protein SMN hạ xuống,
chỉ có tế bào thần kinh vận động là bị ảnh hưởng ở những bệnh nhân SMA. Sự biểu hiện
SMN được chia làm 3 mức độ: Mức độ cao trong não, tủy sống, thận và gan; ở mức độ vừa
phải trong cơ xương và cơ tim; mức độ thấp trong nguyên bào sợi và tế bào lympho. Ở
những bệnh nhân SMA type I, mức độ SMN bị suy giảm vừa phải trong cơ và nguyên

19


lympho bào (lymphoblast) nhưng lại bị giảm đến 100 lần trong tủy sống so với người bình
thường [22].
1.1.3.2. Các dạng đột biến của gen SMN1
Có 3 dạng đột biến của gen SMN1 gây bệnh SMA đó là: Đột biến mất đoạn, đột biến
chuyển đổi gen SMN1 thành gen SMN2 và đột biến điểm. Trong đó hai dạng đột biến mất
đoạn và đột biến chuyển đổi gen dẫn đến hậu quả làm thiếu hụt exon 7 (hoặc exon 7 và exon
8) trong quá trình cắt nối tạo mRNA hoàn chỉnh, chiếm khoảng 94 - 95% trong các trường
hợp SMA. Còn khoảng 5 - 6% các trường hợp SMA là chứa đột biến điểm trên nhiễm sắc

thể này và một đột biến mất đoạn hoặc chuyển đổi gen trên nhiễm sắc thể còn lại [48]. Các
dạng đột biến xảy ra có thể ở trạng thái dị hợp tử hoặc đồng hợp tử.Song chỉ dạng đồng hợp
tử (đột biến xuất hiện ở cả trên 2 allele) mới biểu hiện ra kiểu hình.

Hình 1.6. Sơ đồ minh họa các loại đột biến gen SMN1
a. Đột biến mất đoạn (một phần gen hoặc toàn bộ gen); b. Đột biến chuyển đổi gen (từ
SMN1 sang SMN2); c. Các điểm đột biếnđã xác định
(Nguồn: [48])
* Đột biến mất đoạn gen (deletion)
Đoạn exon 7 bị mất hoặc cả gen SMN1 bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau.
Trong cấu trúc của vùng gen SMA (5q13) có sự lặp lại nhiều lần trong trình tự, chính vì vậy
trong quá trình sao chép DNA có thể dẫn đến hiện tượng kết cặp bổ sung trong 1 mạch phân
tử DNA tạo cấu trúc kẹp tóc làm bỏ qua sao chép đoạn gen dẫn đến đột biến mất đoạn (hình
1.7. B) [29]).

20


Hình 1.7. Cơ chế đột biến vùng gen SMA (5q13)
A. Chuyển đổi gen, B. Mất đoạn giữa của nhiễm sắc thể mang gen SMN1 và SMN2, C.
Mất đoạn giữa của nhiễm sắc thể mang gen SMN2
(Nguồn: [29])
* Đột biến chuyển đổi gen (gene conversion)
Gen SMN1 bị chuyển thành gen SMN2 do nucleotide C bị chuyển thành T, do đó
trong quá trình hoàn thiện mRNA bị thiếu hụt exon 7. Giữa gen SMN1 và SMN2 có 5
nucleotide khác nhau: Một ở intron 6 (A>G), một ở exon 7 (T>C), hai ở intron 7 (G>A,
G>A) và một ở exon 8 (A>G). Tuy nhiên, chỉ cần một đột biến T>C ở exon 7 có thể coi là
đột biến chuyển đổi gen từ SMN1 sang SMN2 do nucleotide này có vai trò quan trọng trong
việc hoàn thiện mRNA để tạo mRNA chứa exon 7 quy định protein có chức năng [14], [16],
[57].

* Đột biến điểm (point mutations)
Đột biến điểm là những đột biến mà chỉ ảnh hưởng đến một vài nucleotide của gen
SMN1. Những điểm đột biến dẫn đến việc sản xuất các protein SMN không có chức năng
21


hoặc không ổn định. Hiện nay các đột biến điểm được xác định ở hình 1.6.c [48]. Các đột
biến điểm thường xuất hiện như: Đột biến lệch khung dịch mã (frameshift), đột biến nhầm
nghĩa (missense) và đột biến vị trí cắt nối gen (splice site).
1.1.4. Chữa trị bệnh SMA
Đến nay bệnh SMA vẫn chưa có phương pháp chữa trị đặc hiệu chủ yếu chỉ là các biện
pháp chăm sóc, hỗ trợ làm giảm các di chứng của bệnh, chế độ dinh dưỡng đầy đủ, điều trị
kháng sinh khi có bội nhiễm, hỗ trợ hô hấp khi có biến chứng suy hô hấp…Hiện nay các
nghiên cứu đã đưa ra các hướng điều trị như sau [20]:
- Tăng cường biểu hiện của protein SMN hoàn chỉnh từ các sản phẩm dịch mã của gen
SMN2.
- Thay đổi cơ chế phiên mã mRNA exon 7 của gen SMN2 để tạo được sản phẩm phiên
mã và dịch mã đầy đủ của gen này.
- Duy trì tính ổn định của sản phẩm protein SMN hoàn chỉnh.
Cơ chế phiên mã mRNA của exon 7 rất phức tạp đòi hỏi rất nhiều các yếu tố liên quan
trong đó có các yếu tố tăng cường (điều hòa dương tính) và các yếu tố ức chế (điều hòa âm
tính). Các nhà khoa học đã tác động vào các yếu tố này để tăng cường sự biểu hiện của
protein SMA.

Hình 1.8. Các yếu tố điều hòa liên quan đến quá trình hoàn thiện exon 7 gen SMN
(Nguồn: [27])
Năm 2010, Yimin Hua và cộng sự đã nghiên cứu thiết kế đoạn antisense
oligonucleotide 2’-O-(2-methoxyethyl) (MOE) phosphorothioate-modified (ASO) tại vị trí
thay đổi nucleotid ở vùng 5’ exon 7 của gen SMN2 sao cho đoạn antisense này có thể ngăn
22

chặn quá trình ức chế exon 7 và tăng cường sự phiên mã của exon này. Đoạn antisense này
được đưa vào cơ thể chuột, kết quả cho thấy có sự tăng cường sao chép mRNA và biểu hiện
protein ở các tế bào thần kinh vận động tủy sống [27].
Cho đến nay việc điều trị các bệnh di truyền nói chung và bệnh SMA nói riêng vẫn
đang là khó khăn cho ngành y học do đó cách bệnh này vẫn là gánh nặng cho bản thân bệnh
nhân, gia đình và xã hội. Chính vì vậy, trước khi các nhà khoa học tìm ra phương pháp chữa
trị đặc hiệu thì việc sàng lọc người lành mang gen, chẩn đoán trước sinh để hạn chế sinh ra
những đứa trẻ mang SMA được coi là lựa chọn được ưu tiên hàng đầu.
1.2. Các phương pháp xác định đột biến gen smn1
1.2.1. Phương pháp Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification
Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification (MLPA) còn gọi là kĩ thuật
khuếch đại đa đoạn dò, được mô tả lần đầu tiên vào năm 2002 bởi Schouten J.P. và cs, đây
là phiên bản mới của phản ứng PCR, trong đó nhiều đoạn DNA đích được khuếch đại chỉ
bằng 1 cặp mồi. Kỹ thuật MLPA sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai với phân tử
DNA đích đặc hiệu. Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligoncleotide có kích thước khác nhau (đoạn
dò xuôi và đoạn dò ngược). Các probe sẽ gắn đặc hiệu vào các exon của phân tử DNA đích,
sau đó enzyme ligase được thêm vào để nối hai đoạn dò này lại với nhau tạo thành đoạn dò
hoàn chỉnh và được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được đánh dấu
huỳnh quang. Đoạn đệm được thiết kế dài ngắn khác nhau nên khi phản ứng PCR khuếch
đại sẽ tạo ra nhiều đoạn DNA có chiều dài khác nhau và được phân tách bằng điện di mao
quản. Nếu exon bị đột biến mất đoạn thì không có hiện tượng lai probe và probe đó sẽ
không được khuếch đại, do đó khi điện di mao quản sẽ không thấy hình ảnh exon bị đột biến
mất đoạn. Nếu gen có đột biến lặp đoạn, kết quả trên hình ảnh điện di mao quản cho thấy
đỉnh tín hiệu của probe tương ứng với exon bị đột biến sẽ tăng cao khác biệt so với bình
thường [40].
Đến nay có hơn một triệu phản ứng MLPA được thực hiện mỗi năm trên khắp thế giới
và được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh lý di truyền người, di truyền tế bào và
nghiên cứu ung thư, cho phép phát hiện các tổn thương gen một cách nhanh chóng và chính

xác.

23