nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex ligation dependent probe amplification để chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

Lê Trần Hoàng Phúc

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE
AMPLIFICATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN
MẤT ĐOẠN GEN
α GLOBIN GÂY BỆNH
α THALASSEMIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TP. Hồ Chí Minh – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

Lê Trần Hoàng Phúc

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE
AMPLIFICATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN
MẤT ĐOẠN GEN
α GLOBIN GÂY BỆNH
α THALASSEMIA
Chuyên ngành

:

Mã số

60 42 01 14

:

Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.BS. NGUYỄN THỊ BĂNG SƯƠNG

TP. Hồ Chí Minh – 2013


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong
bất kì công trình nào.
Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham
khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 9 năm 2013
TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Lê Trần Hoàng Phúc

1

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương - Trường Đại Học Y
Dược TP.HCM - người đã rất tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy (cô) trong Hội đồng đã đọc và góp ý cho luận
văn của tôi.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đỗ Thị Thanh Thủy - Trường Đại Học Y Dược
TP.HCM đã cho tôi nhiều ý kiến quý báu trong quá trình làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy (cô) của Trường, Phòng Sau đại học, Khoa
Sinh học - Trường Đại học Sư phạm TP.HCM; Quý thầy (cô) và các kỹ thuật viên của
Trung tâm Y Sinh học phân tử - Trường Đại Học Y Dược TP.HCM đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này.
Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và
bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 9 năm 2013
TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Lê Trần Hoàng Phúc

2


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 2
MỤC LỤC .................................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... 5
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 6
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................................. 6
2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................................... 7

3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 7
4. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................................ 7
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn ................................................................ 8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 9
1.1. Cấu tạo của hồng cầu .................................................................................................. 9
1.1.1. Thành phần Hem .....................................................................................................9
1.1.2. Thành phần globin .................................................................................................10
1.2. Bệnh thalassemia và α thalassemia .......................................................................... 11
1.2.1. Bệnh thalassemia ...................................................................................................11
1.2.2. Bệnh α thalassemia ................................................................................................12
1.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử xác định đột biến gen HBA ..........................20
1.2.4. Hướng điều trị bệnh α thalassemia ........................................................................25
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA và đột biến gen α globin gây
bệnh α thalassemia ............................................................................................................ 26
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ......................................................................27
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước .......................................................................29

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 31
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 31
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 31
2.3. Các thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu ......................................................... 31
2.3.1. Các thiết bị, dụng cụ ..............................................................................................31
2.3.2. Hóa chất .................................................................................................................31
2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 32
2.4.1. Tách chiết DNA từ mẫu máu ngoại vi ..................................................................32
2.4.2. Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA .........................................................................34
3

2.4.3. Tiến hành kỹ thuật MLPA .....................................................................................35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................. 40
3.1. Kết quả hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu ....................... 40
3.2. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 42
3.3. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân và bàn luận các kết quả...................... 43
3.3.1. Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen α globin .................................................43
3.3.2. Kết quả của các mẫu bệnh nhân có đột biến mất đoạn dạng--SEA .........................46
3.3.3. Kết quả của các mẫu bệnh nhân có đột biến mất đoạn dạng -α3,7 .........................49
3.3.4. Kết quả của các mẫu bệnh nhân có đột biến mất đoạn dạng -α4,2 .........................52
3.3.5. Kết quả của các mẫu bệnh nhân không có đột biến mất đoạn ..............................54
3.3.6. Tỷ lệ đột biến mất đoạn ở bệnh nhân α thalassemia .............................................56
3.3.7. Sự phân bố vị trí bị mất đoạn của gen α thalassemia ............................................57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 61
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 69

4


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp

Base pair

C-ARMS-PCR

Combine Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain
Reactions

CGH

Comparative genomic hybridization

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA

Ethilendiaminetetraacetic acid

FISH

Florescence In Situ Hybridization (Lai huỳnh quang tại chỗ)

fl

femtolit (1 fl = 10-15 lit)

HbCS

Hemoglobin Constant Spring

HbQS

Hemoglobin Quong Sze

LOH

Loss of heterozygosity

MCH

Mean corpuscular hemoglobin (Lượng hemoglobin trung bình trong một
hồng cầu)

MCV

Mean corpuscular volume (Thể tích hồng cầu trung bình)

MLPA

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NST

Nhiễm sắc thể

nt

Nucleotide

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

pg

picogram (1 pg = 10-12 g)

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt bởi
enzyme giới hạn)

RNA

Ribonucleic Acid

5


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong cơ thể con người, máu là thành phần có vai trò rất quan trọng. Máu có chức
năng dinh dưỡng, hô hấp, bảo vệ, đào thải các sản phẩm chuyển hóa, tham gia điều hòa thân

nhiệt, điều hòa hoạt động các cơ quan nhờ hệ thống hormone và enzyme. Máu có vai trò
quan trọng như thế đối với sự sống nhưng cũng có nhiều căn bệnh liên quan đến máu như
ung thư máu, thiếu máu hồng cầu hình liềm, máu khó đông,…Những căn bệnh này ảnh
hưởng lớn đến sức khỏe, cuộc sống con người, đặc biệt là những người có hoàn cảnh khó
khăn về kinh tế, chi phí cho việc điều trị cao đã trở thành gánh nặng cho gia đình họ.
Trong số những căn bệnh về máu thì bệnh thiếu máu α thalassemia là một căn bệnh
thiếu máu tan máu do di truyền khá phổ biến, đây là rối loạn di truyền đơn gen thường gặp
nhất, bệnh di truyền theo quy luật alen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh α thalassemia
được phát hiện ở 60 nước, tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở vùng Địa Trung Hải, vùng Bắc và Tây
Phi, Trung Đông, Nam Á và Đông Nam Á. Mỗi năm, trên thế giới có khoảng 100.000 em bé
sinh ra mắc bệnh. Các nhà khoa học tiên đoán thalassemia sẽ trở thành bệnh lý toàn cầu. Cơ
chế gây bệnh là do đột biến gen α globin nằm trên cánh ngắn NST 16 quy định, đột biến gen
gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α globin, ảnh hưởng đến sự tổng hợp hemoglobin [5],
[41], [50]. Hemoglobin là protein của hồng cầu, có chức năng vận chuyển oxy cho cơ và
máu. Hemoglobin là phân tử tetramer chứa bốn chuỗi globin (bản chất là polypeptid) và bốn
nhóm ngoại hem, mỗi chuỗi globin kết hợp với một hem tạo một tiểu đơn vị của
hemoglobin. Mọi hemoglobin bình thường được hình thành từ hai chuỗi α globin liên kết
với hai chuỗi “không α” globin. Ở người trưởng thành, dạng phổ biến nhất của hemoglobin
là HbA1, gồm tổ hợp của 2 chuỗi α globin (141 acid amin) và 2 chuỗi β globin (146 acid
amin) gọi là dạng α2β2. Máu người trưởng thành còn chứa một lượng ít HbA2 (khoảng 2%)
là sự tổ hợp của 2 chuỗi α globin và 2 chuỗi δ globin gọi là dạng α2δ2 [59]. Bệnh α
thalassemia là rối loạn di truyền do đột biến gen α globin, dẫn đến giảm hoặc mất tổng hợp
chuỗi α globin, trong khi đó quá trình tổng hợp chuỗi β globin vẫn diễn ra bình thường.
Bình thường 2 loại chuỗi α globin và β globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1, như vậy bệnh
nhân α thalassemia sẽ có sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin. Loại chuỗi β globin được
tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ tích tụ trong tế bào hồng
cầu và gây phá hủy hồng cầu [59].
6

Khi xã hội ngày càng phát triển thì có nhiều thành tựu mới được áp dụng trong y học
để tìm nguyên nhân và phương pháp điều trị hiệu quả nhằm cải thiện sức khỏe cho bệnh
nhân. Phát hiện đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa rất lớn đối với điều trị cũng như giúp chẩn
đoán trước sinh và tư vấn di truyền. Phát hiện sớm bệnh α thalassemia có thể giúp điều trị
sớm, tránh các biến chứng của bệnh và nguy cơ tử vong. Đột biến gây bệnh α thalassemia
thường gặp là đột biến mất đoạn gen α globin nên các kỹ thuật sinh học phân tử được sử
dụng để xác định đột biến ở bệnh nhân α thalassemia là kỹ thuật đơn PCR, multiplex PCR,
HPLC,…[17], [18], [24], [45], [53], [61].
Gần đây, kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ra đời
và được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán mất đoạn và lặp đoạn gen nói chung hay bệnh α
thalassemia nói riêng. Kỹ thuật MLPA có ưu điểm là dễ thực hiện, cho kết quả nhanh và có
độ chính xác cao [10]. Từ những ý nghĩa của việc phát hiện ra các đột biến gen gây bệnh α
thalassemia và mong muốn đưa một kỹ thuật sinh học phân tử khá mới vào việc xác định
các đột biến gen α globin ở Việt Nam nên chúng tôi đã chọn và thực hiện đề tài “Nghiên
cứu ứng dụng kỹ thuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification để chẩn đoán
đột biến mất đoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
1. Ứng dụng kỹ thuật MLPA giúp chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin gây bệnh
α thalassemia.
2. Xác định các kiểu đột biến mất đoạn gen α globin thường gặp trên bệnh nhân α
thalassemia ở Việt Nam và tỷ lệ của các kiểu đột biến đó.

3. Nội dung nghiên cứu
- Tiến hành các bước của kỹ thuật MLPA giúp chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α
globin trên các mẫu bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc bệnh α thalassemia dựa vào triệu
chứng lâm sàng, cận lâm sàng.
- Xác định các kiểu đột biến gen α globin trong các mẫu nghiên cứu và tỷ lệ của
chúng, căn cứ vào các tỷ lệ đó để xác định các dạng đột biến mất đoạn gen α globin thường
gặp ở Việt Nam.

4. Phạm vi nghiên cứu

7


Do hạn chế về thời gian, kinh phí nghiên cứu cũng như để có thể hoàn thành luận văn
được tốt trong khả năng kiến thức, nên đề tài này chỉ nghiên cứu về việc ứng dụng kỹ thuật
MLPA để chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia và xác định các
kiểu đột biến gen α globin thường gặp ở Việt Nam.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
Bệnh thiếu máu là một trong những căn bệnh ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cũng như
cuộc sống của con người. Bệnh α thalassemia là một trong số những căn bệnh thiếu máu
đang được chú ý nghiên cứu và sử dụng các biện pháp, kỹ thuật khác nhau để chẩn đoán,
phát hiện người mang gen đột biến đặc biệt là những người mang đột biến ở thể ẩn, thể nhẹ
(chỉ mất một, hai gen), tuy những người này không biểu hiện bệnh hoặc có biểu hiện rất nhẹ
nhưng họ có thể di truyền gen đột biến lại cho thế hệ sau và có thể gây ra bệnh nặng ở con
cháu của họ với nhiều biến chứng nguy hiểm, thậm chí tử vong. Gen đột biến từ những
người này có thể lan truyền trong cộng đồng, do vậy việc tìm hiểu, nghiên cứu, xác định các
dạng đột biến ở bệnh nhân α thlassemia ở Việt Nam là rất ý nghĩa. Có nhiều kỹ thuật sinh
học phân tử được sử dụng để xác định đột biến ở bệnh nhân α thalassemia nhưng gần đây kỹ
thuật MLPA ra đời với nhiều ưu điểm và được áp dụng rộng rãi ở các nước phát triển. Ở
Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán di truyền bệnh α thalassemia vẫn
còn hạn chế. Việc ứng dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen α globin
không chỉ có ý nghĩa rất lớn trong việc mang lại kết quả nhanh chóng, chính xác mà còn
giúp chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân. Việc xác định các kiểu đột biến gen α globin
thường gặp ở Việt Nam giúp cho chúng ta có cái nhìn bao quát về tình hình bệnh α
thalassemia tại nước ta, để có những dẫn chứng, dữ liệu cho các nghiên cứu tiếp theo cũng
như giúp ích cho việc dự báo, chẩn đoán, phát hiện sớm và điều trị được chính xác, hiệu quả

hơn, phát hiện các đột biến trên vùng gen α globin là cơ sở vững chắc cho chẩn đoán trước
sinh bệnh α thalassemia.

8


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cấu tạo của hồng cầu
Hồng cầu là những tế bào không nhân, không có bào quan, chỉ có màng tế bào, khung
tế bào, hemoglobin và các enzyme thủy phân glycogen.
Màng hồng cầu có nhiều lỗ nhỏ đường kính khoảng 0,5 nm. Mặt trong có một lưới sợi
của bộ xương tế bào. Có hình dáng và kích thước ổn định. Có khả năng đàn hồi. Trên bề
mặt của màng có nhiều oligosaccharid kết hợp với lipid (gluco-lipid), oligosaccharid kết
hợp với protein (glycoprotein) tạo nên những kháng nguyên nhóm máu đặc biệt (kháng
nguyên hệ ABO, Rh,...).
Bào tương hồng cầu: chứa 66% nước và 34% chất khô. Hemoglobin chiếm 95% chất
khô, còn lại là chất khác (ure, glucid, lipid). Mỗi hồng cầu có khoảng 350 triệu phân tử
hemoglobin (Hb).
Hemoglobin là một hợp chất protein, dễ hoà tan trong nước. Hb có thể kết hợp với oxy
và CO2 để thực hiện chức năng vận chuyển khí [1].
1.1.1. Thành phần Hem
Thành phần Hem: Mỗi phân tử hemoglobin có 4 nhân Hem, Hem được cấu tạo từ một
vòng protoporphyrin và ở giữa là một nguyên tử sắt hóa trị 2. Nhân protoporphyrin gồm 4
vòng pyrol, gắn với nhau qua cầu nối methylen (-CH=), có một số nhóm thế methyl (-CH3),
vinyl (-CH=CH2) và propionat (-CH2-CH2-COOH) trong công thức cấu tạo. Nguyên tử sắt
nằm ở trung tâm, tham gia 2 liên kết cộng hóa trị với 2 nguyên tử nitơ của nhân pyrol và 2
liên kết phối trí với 2 nguyên tử nitơ của hai nhân pyrol còn lại [7].

Hình 1.1. Thành phần Hem trong cấu tạo của hồng cầu

9


1.1.2. Thành phần globin

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của hemoglobin với các chuỗi globin
Phần globin có bản chất protein. Ở người, phần globin được cấu tạo bởi 4 chuỗi
polypeptid (chuỗi globin), giống nhau từng đôi một. Mỗi chuỗi polypeptid gắn với 1 Hem.
Vì vậy mỗi phân tử Hb có 4 chuỗi polypeptid và 4 hem có khả năng vận chuyển được 4
phân tử oxy. Trong quá trình phát triển của cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptid có sự
chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn. Phân tích cấu trúc của các
loại Hb khác nhau ở người, người ta chia chuỗi polypeptid ra các loại sau đây: chuỗi α,
chuỗi β, chuỗi δ, chuỗi γ, chuỗi ε, chuỗi ζ [30].

Hình 1.3. Sơ đồ các gen tổng hợp globin
Các chuỗi epsilon (ε), chuỗi zeta (ζ), chuỗi gamma (γ) chỉ tồn tại ở những tuần đầu của
thời kỳ bào thai, sau đó nhanh chóng được thay thế bằng chuỗi α, chuỗi β, chuỗi δ. Các
chuỗi này tồn tại suốt cuộc đời ở các mức độ khác nhau. Ở người trưởng thành gặp chủ yếu
10


là chuỗi α, chuỗi β, một số ít chuỗi δ. Các loại chuỗi β, chuỗi δ, chuỗi γ,…(gọi là các chuỗi
“không α” globin) thường kết hợp từng cặp với chuỗi α.
Các chuỗi polypeptid được cấu trúc từ các acid amin và sắp xếp theo một trình tự chặt
chẽ. Khi có sự thay thế một acid amin nào đó trong chuỗi polypeptid thì sẽ làm thay đổi tính
chất lý, hóa của phân tử Hb và tạo nên các Hb bất thường. Hậu quả là gây thiếu máu. Bình
thường mỗi phân tử Hb có 4 chuỗi polypeptid (globin) [30]. Các loại Hb khác nhau có các
thành phần chuỗi polypeptid khác nhau và thời kì xuất hiện của chúng được biểu thị qua
bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các loại hemoglobin và thời kì xuất hiện

Loại Hb

Thành phần

Thời kì xuất hiện

globin

Bào thai 6 tuần, Hb ở người trưởng thành (95 -

HbA1

α 2 β2

HbA2

α 2 δ2

HbF

α2 γ 2

Hb Gower 1

ζ 2ε2

Phôi thai 2 - 3 tuần

Hb Gower 2

α2 ε2

Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1

Hb Portland

ζ 2 γ2

Phôi thai 2 - 3 tuần

98% )
Thai gần sinh, Hb ở người trưởng thành (2 3%)
Hb chủ yếu ở thai nhi (5 tuần), ở người trưởng
thành có nhưng rất ít

Ở máu của người trưởng thành, dạng phổ biến nhất của Hb là HbA1, ngoài ra còn chứa
một lượng ít HbA2 (khoảng 2 - 3 %) [5], [19].

1.2. Bệnh thalassemia và α thalassemia
1.2.1. Bệnh thalassemia
Bệnh thalassemia là bệnh thiếu máu di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường. Nguyên
nhân là do rối loạn tổng hợp của một hoặc nhiều chuỗi globin. Khi mất cân bằng tổng hợp
chuỗi globin sẽ tổng hợp Hb không hiệu quả, cấu tạo bất bình thường của hemoglobin trong
hồng cầu sẽ ảnh hưởng đến sự sản xuất hồng cầu, dẫn đến tình trạng thiếu máu, thiếu oxy
trong cơ thể và ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của các cơ quan khác. Hàng năm có
hàng ngàn trẻ sinh ra bị bệnh thiếu máu thalasemia, đây là bệnh phổ biến trên thế giới, tần
11


suất mắc bệnh ở nam và nữ là như nhau. Bệnh rất phổ biến ở các nước và khu vực như: Việt

Nam, Hi Lạp, Trung Đông, Nam Á, Đông Nam Á và châu Phi [30], [54].
Bệnh thalassemia được phân loại thành hai thể là α thalassemia và β thalassemia phụ
thuộc vào việc bệnh nhân thiếu các phần tử cấu tạo hemoglobin. Bệnh thiếu máu β
thalassemia là rối loạn di truyền do giảm hoặc vắng mặt sự tổng hợp chuỗi β globin, thiếu
máu α thalassemia do giảm hoặc vắng mặt sự tổng hợp chuỗi α globin. Hậu quả là giảm Hb
trong các tế bào hồng cầu, giảm sản xuất hồng cầu và dẫn đến thiếu máu [5], [18].
1.2.2. Bệnh α thalassemia
1.2.2.1. Nguyên nhân gây bệnh, vị trí, cấu trúc của gen mã hóa chuỗi α globin
Bệnh α thalassemia do đột biến gen α globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16
(16p13.3) (hình 1.4), gây ra sự giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α globin [26], [27], [50].

Hình 1.4. Vị trí của gen α globin trên nhiễm sắc thể số 16
Hemoglobin ở người trưởng thành bình thường có 2 chuỗi α globin và 2 chuỗi β
globin. Chuỗi α globin gồm: 141 acid amin, chuỗi β globin gồm 146 acid amin
Chuỗi α globin được tổng hợp từ gen α globin nằm trên nhiễm sắc thể 16, trong đó mỗi
nhiễm sắc thể mang 2 gen HBA1 (α1) và gen HBA2 (α2) có cấu trúc tương đồng với nhau.
Như vậy người bình thường có 2 cặp gen α globin [5], [19].
HBA1 chứa 3 exon và 2 intron, vị trí trên nhiễm sắc thể 16 từ cặp base 226.678 đến
227.519 [71]. HBA2 chứa 3 exon và 2 intron, vị trí trên nhiễm sắc thể 16 từ cặp base
222.845 đến 223.708 [72]. Số lượng của protein α globin phụ thuộc vào số gen hoạt động.
Người càng có ít gen α globin hoạt động thì càng mắc thể bệnh α thalassemia nặng hơn [30],
[56].
Cụm gen α globin nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể 16, có chiều dài khoảng 30
kb, chứa các gen từ đầu 5’ đến 3’ như sau: gen mã hóa chuỗi globin của phôi thai (zeta ζ2);
ba gen giả Ψζ1 , Ψα2, Ψα1; hai gen mã hóa chuỗi globin người lớn α2, α1 và một gen chưa rõ
chức năng là θ. Sự biểu hiện của các gen này được điều hòa bởi các yếu tố đặc hiệu định vị
ở -10 kb (HS-10), -33 kb (HS-33), -40 kb (HS-40) và -48 kb (HS-48) ở phía đầu 5’
(upstream) của gen ζ globin. Các nghiên cứu cho thấy, yếu tố HS-40 đóng vai trò chủ chốt
12

trong việc điều hòa sự tổng hợp chuỗi α globin, nó được xem là vị trí kết hợp của các nhân
tố phiên mã, đột biến vùng này sẽ làm cho gen α globin không biểu hiện và gây ra bệnh α
thalassemia (hình 1.5) [5], [19], [20], [30], [47].

Hình 1.5. Cấu trúc cụm gen α globin
Hai gen α1, α2 globin nằm kế nhau trên nhiễm sắc thể số 16, có cấu trúc tương đồng
nhau và cùng mã hóa cho chuỗi α globin. Gen được chia làm 3 vùng trong đó các đoạn X,
Y, Z tương đồng nhau giữa 2 gen α1, α2 (hình 1.6). Vùng nối 2 đoạn Z dài 3,7 kb, khi đột
biến vùng này thường gây bệnh α+ thalassemia và là dạng đột biến -α3,7. Vùng nối 2 đoạn X
dài 4,2 kb, đột biến xảy ra ở đây cũng gây thể bệnh α+ thalassemia và là dạng đột biến -α4,2
(hình 1.7) [30].

Hình 1.6. Cấu trúc các đoạn của gen α globin

13


Hình 1.7. Đột biến mất đoạn -α3,7 và -α4,2
1.2.2.2. Các đột biến gây bệnh α thalassemia
Triệu chứng lâm sàng do α thalassemia gây ra lần đầu tiên được ghi nhận vào giữa
những năm 1950 và đầu những năm 1960, kết hợp với những bất thường về hemoglobin
(HbH, Hb Bart’s) [9], [49].
Bất thường gây bệnh α thalassemia phổ biến là đột biến mất đoạn. Hơn 95% bệnh
nhân α thalassemia mang đột biến mất đoạn liên quan đến một hoặc hai gen α globin [60].
Nếu đột biến gây mất một phần hoặc toàn bộ một gen α thì sẽ gây dạng α+ thalassemia .
Nếu đột biến mất cả 2 gen thì sẽ gây dạng α0 thalassemia [23]. Các dạng đột biến mất đoạn
được thể hiện trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Các dạng đột biến mất đoạn gây bệnh α thalassemia
DẠNG ĐỘT BIẾN

Mất đoạn một phần hoặc toàn bộ của 1
gen α

KIỂU HÌNH

VÍ DỤ

α+ thalassemia

-α3,7, -α4,2

Mất đoạn một phần hoặc toàn bộ của
cả 2 gen α nhưng không mất đoạn

α thalassemia
0

vùng HS-40
Đột biến mất cả 2 gen α và HS-40 (dài
100-250 kb)
Mất đoạn lớn của 16p13.3 (1-2 Mb)
gồm cả 2 gen α và HS-40

--SEA, --THAI, --MED , -FIL

, -α(20.5)

α0 thalassemia

--DUTCH

α0 thalassemia

--BO

14


Mất đoạn gen α1 globin và 18–20 kb
(downstream) của gen α1
Đột biến ở đầu 5’ (upstream) mất đoạn
lớn vùng điều hòa HS-40

α0 thalassemia

(α)-ZF
(α α)RA, (α α)TAT , hiện

α0 thalassemia

diện 2 gen nhưng
không chức năng.

Bảy dạng đột biến mất đoạn thường gặp nhất là: -α3,7, -α4,2, --SEA, --THAI, --FIL, -α(20,5), -MED

[18], [61].
Ở Đông Nam Á, dạng đột biến α thalassemia phổ biến nhất là mất đoạn --SEA, đoạn này

dài khoảng 20,5 kb, làm mất cả 2 gen α globin nhưng không mất gen ζ globin. Mất đoạn
đồng hợp dạng này (--SEA/--SEA) là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra hội chứng phù thai (Hb

Bart’s). Tỷ lệ người mang đột biến --SEA ở Đông Nam Á cao và tỷ lệ này khác nhau tùy theo
vùng. Ở Việt Nam đột biến mất đoạn gây bệnh α thalassemia thường gặp là dạng --SEA
(Đông Nam Á), dạng -α 4,2, -α 3,7(hình 1.8) [34], [70].

Hình 1.8. Sự phân bố các dạng đột biến mất đoạn gen α globin trên thế giới
Có ít nhất khoảng 40 đột biến mất đoạn khác nhau trong cụm gen α globin (hình 1.9 và
hình 1.10) và kích thước của đoạn bị mất ảnh hưởng đến triệu chứng lâm sàng, nếu đoạn bị
mất càng lớn thì triệu chứng càng nghiêm trọng [19], [60].

15


Hình 1.9. Các dạng đột biến mất đoạn thường gặp trong cụm gen α globin

Hình 1.10. Các đột biến mất đoạn khác (mất hai gen) gây α0 thalassemia
Ngoài các đột biến mất đoạn ra thì cụm gen α globin còn có các dạng đột biến khác,
các dạng đột biến đó được trình bày trong bảng 1.3 [23], [33], [63].
Bảng 1.3. Các dạng đột biến không mất đoạn gây bệnh α thalassemia
DẠNG ĐỘT BIẾN
Đột biến tại vị trí gắn
đuôi polyA

KIỂU HÌNH

VÍ DỤ
Trình tự gắn đuôi của gen α2 là

α+ thalassemia nặng

AATAAA bị đột biến thành

AATAAG

16


Đột biến ở bộ ba mở

α+ thalassemia nặng

Gen α2: ATGACG, GTG

Đột biến khung

α+ hoặc α0 thalassemia

Mất 4 nucleotide ở codon 30/31

Đột biến vô nghĩa

α+ hoặc α0 thalassemia

đầu

Mã 116: GAG đột biến thành
TAG tạo mã kết thúc.

Đột biến ở bộ ba kết
thúc dẫn đến sự kéo
dài bất thường của

Đột biến Hemoglobin Constant

α+ thalassemia

Spring: TAACAA

phân tử mRNA và
chuỗi α globin

1.2.2.3. Liên quan giữa kiểu gen và triệu chứng lâm sàng
Đột biến gen α globin có thể gây mất đoạn một gen hoặc cả hai gen, ảnh hưởng đến
một hoặc cả hai nhiễm sắc thể 16. Kiểu gen của người bình thường (αα /αα ). Tùy thuộc vào
số gen bị đột biến, bệnh α thalassemia được chia làm các thể sau [5], [30], [60].
α thalassemia thể ẩn (-α/αα ): Mất một gen α globin, là người bình thường mang gen
đột biến, không có biểu hiện lâm sàng, là người lành mang gen thầm lặng.
α thalassemia thể nhẹ (--/αα ), (-α/-α): Mất hai gen α globin, là người mắc α
thalassemia thể nhẹ, có biểu hiện thiếu máu nhược sắc, MCV và MCH giảm (hình 1.11)

Hình 1.11. Đột biến mất gen α globin gây bệnh α thalassemia thể nhẹ
Bệnh Hemoglobin H (--/-α): Mất ba gen α globin (hình 1.12) hoặc mất hai gen α
globin kết hợp với một đột biến điểm, do vậy bệnh nhân chỉ có 1 gen hoạt động để sinh ra α
globin, dẫn tới tình trạng dư thừa chuỗi β globin và 4 chuỗi này kết hợp với nhau sẽ hình
thành một loại hemoglobin được gọi là hemoglobin H – HbH (β4). Có biểu hiện thiếu máu
nhược sắc ở mức độ nhẹ đến trung bình, MCV và MCH giảm. Mức độ cần truyền máu thay
17


đổi tùy từng bệnh nhân. Có thể kèm theo các biến chứng khác như: lá lách to, sỏi mật, tăng
nguy cơ nhiễm trùng, vàng da,…đặc biệt trong các trường hợp thiếu máu nặng cần truyền
máu thường xuyên [35], [36], [39], [44], [58].

Hình 1.12. Đột biến mất gen α gây bệnh hemoglobin H, hemoglobin Bart’s
Hemoglobin Bart’s (--/--): Ở thể này, người bệnh mất hoàn toàn 2 cặp gen α globin,
thể bệnh nặng được gọi là bệnh phù thai (hình 1.12). Kết quả từ việc không nhận được gen α
globin nào từ cả cha và mẹ, không tổng hợp được chuỗi α globin. Thai nhi mắc hemoglobin
Bart’s thường có phù nhau thai, gan lách to, thai chết lưu trong tử cung (tuần 23 - 38 tuần)
hoặc chết sớm sau sinh (hình 1.14). Bình thường huyết sắc tố của thai nhi là HbF (α2γ2), đột
biến mất cả 2 cặp gen α globin nên thai nhi không tổng hợp được chuỗi α, dư thừa quá mức
chuỗi γ trong tế bào, bốn chuỗi γ tạo thành hemoglobin Bart’s có ái lực cao với oxy nên
không nhả được oxy cho tổ chức, do vậy thai nhi thiếu oxy và tử vong trong buồng tử cung
hoặc ngay sau khi sinh. Trẻ sơ sinh cũng có biểu hiện phù toàn thân và gan to, lách to, suy
tim. Thiếu máu thường rất nặng. Hồng cầu có hình thái nhỏ và nhược sắc, một số lượng lớn
hồng cầu non ra máu ngoại vi. Điện di hemoglobin cho thấy có lượng lớn Hb Bart's và
lượng nhỏ HbH. Đôi khi, trên kết quả diện di cũng có thể gặp một lượng nhỏ Hb Portland.
Các loại HbA và HbF hoàn toàn không thấy có trên kết quả điện di.
Các thể bệnh và triệu chứng lâm sàng điển hình của α thalassemia được thể hiện tóm
tắt trong bảng 1.4 và hình 1.13.

18


Bảng 1.4. Các thể bệnh và triệu chứng lâm sàng điển hình của α thalassemia
HỘI CHỨNG

Thể ẩn (silent carrier)

Thể nhẹ (minor)

CƠ SỞ PHÂN TỬ
Mất 1 gen (-α /αα ): dị hợp α

thalassemia

TRIỆU CHỨNG
LÂM SÀNG
Không có triệu
chứng bệnh
(asymptomatic)

Mất 2 gen (-- /αα ): dị hợp α

Thiếu máu nhẹ

thalassemia. Mất 2 gen (-α /-α ):

hoặc không triệu

đồng hợp tử

chứng
Thiếu máu nhược

Bệnh HbH

Mất 3 gen (-- /-α ), hoặc mất 2 gen
và đột biến điểm

sắc ở mức độ nhẹ
đến trung bình,
truyền máu, lách to,
sỏi mật

Phù thai Hb Bart’s

Mất 2 cặp gen

(hydrop fetalis)

(-- /-- ): đồng hợp

Chết trong tử cung
hay chết ngay sau

Hình 1.13. Các thể bệnh α thalassemia

19

sinh


Hình 1.14. Bệnh phù thai (Hemoglobin Bart’s) [29]
1.2.2.4. Chẩn đoán
Để chẩn đoán xác định bệnh α thalassemia, người ta thường sử dụng các phương pháp
phân tích triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng và thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử để
chẩn đoán xác định bệnh cũng như xác định dạng đột biến mà bệnh nhân mắc phải.
Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng thường được dùng để chẩn đoán bệnh nhân có
mắc bệnh α thalassemia hay không như hồng cầu nhỏ, nhược sắc, thiếu máu nhẹ đến trung
bình, bệnh nhân phải truyền máu với mức độ khác nhau. Có thể kèm theo các biến chứng
khác như: lách to, sỏi mật, tăng nguy cơ nhiễm trùng, vàng da, MCV < 80 fl, MCH < 27 pg
[29], [35], [55], [65].
Xét nghiệm sinh học phân tử phân tích gen HBA của bệnh nhân để chẩn đoán xác định

α thalassemia [14].
1.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử xác định đột biến gen HBA
1.2.3.1. Kỹ thuật multiplex PCR
Để phát hiện nhanh các đột biến mất đoạn, các nhà khoa học thường dùng phản ứng
multiplex PCR. Với việc sử dụng đồng thời 16 cặp mồi đặc hiệu, 7 dạng đột biến thường
gặp sẽ được phát hiện. Mỗi phản ứng multiplex PCR có thể tích 50 µl chứa 200 µM mỗi
dNTP, 1,5 mM MgCl2, 1X dung dịch đệm, 2,5 đơn vị enzyme Taq polymerase, 100 - 200ng
DNA và 16 cặp mồi. Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: đầu tiên là giai đoạn biến tính ở
95oC trong 5 phút, tiếp theo là 30 chu kì gồm biến tính 97oC trong 45 giây, gắn mồi ở 60oC
20


trong 75 giây, kéo dài ở 72oC trong 150 giây, cuối cùng ở 72oC trong 5 phút. Sau khi
khuếch đại sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, đột biến mất đoạn gen sẽ làm
giảm kích thước sản phẩm khuếch đại ngắn hơn so với bình thường [4], [18] (hình 1.15).

Hình 1.15. Kết quả phân tích đột biến của cụm gen α globin
bằng kỹ thuật multiplex PCR
A. Sơ đồ cụm gen α globin, vị trí của các mồi giúp xác định 7 dạng đột biến thường gặp, vị trí các hộp
X, Y, Z. B. Kết quả phản ứng multiplex PCR cho thấy các dạng đột biến.

1.2.3.2. Kỹ thuật C-ARMS-PCR
C-ARMS-PCR là kỹ thuật Multilpex PCR được sử dụng để sàng lọc các đột biến điểm
α thalassemia dạng Haemoglobin Constant Spring (HbCS), Haemoglobin Quong Sze
(HbQS) [65]. Phản ứng này dùng các mồi được tổng hợp ở hai dạng: mồi đặc hiệu có trình
tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến, chứa một nucleotide thay đổi ở đầu tận cùng 3’ và một
mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen. Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng
sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước (hình 1.16).

21

Hình 1.16. Phát hiện đột biến điểm α thalassemia bằng kỹ thuật C-ARMS-PCR
Cột 1: thang DNA 100 bp. Cột 2: cha bệnh nhân A, băng đột biến 183 bp đột biến HbCS. Cột 3: bệnh
nhân A 183bp đột biến HbCS. Cột 4: mẹ bệnh nhân A. Cột 5: nước. Cột 6: cha bệnh nhân B: 323bp băng
kiểm soát. Cột 7: bệnh nhân B băng đột biến 138bp HbQS. Cột 8: mẹ bệnh nhân B băng đột biến 138bp
HbQS. Cột 9: dấu hiệu khối lượng phân tử.

1.2.3.3. Kỹ thuật giải trình tự vùng gen α globin và phân tích kết quả
Giải trình tự gen được thực hiện trên máy ABI 3130. Kết quả được phân tích bằng
phần mềm Chromas và Chromas Pro, sau đó được đưa lên Ngân hàng gen (Gene Bank) để
so sánh với trình tự gen α thalasemia chuẩn [3]. Từ đó phát hiện các đột biến điểm chưa biết
và các biến thể của bệnh [25].

Hình 1.17. Kỹ thuật giải trình tự vùng gen α globin phát hiện đột biến
Bệnh nhân bị đột biến mất nucleotide T ở codon ATG

1.2.3.4. Kỹ thuật MLPA
Còn gọi là kỹ thuật khuếch đại đa đoạn dò. MLPA là một kỹ thuật dùng để xác định số
lượng bản sao của các trình tự DNA trong một phản ứng PCR, trong đó nhiều đoạn DNA
được khuếch đại chỉ bằng một cặp mồi duy nhất. MLPA được ứng dụng trong nhiều nghiên
cứu về bệnh lý di truyền, di truyền tế bào và nghiên cứu về ung thư, phát hiện các đột biến
gen đặc biệt là phát hiện đột biến mất đoạn, lặp đoạn,…một cách nhanh chóng và chính xác
[42], [64].
* Nguyên tắc của kỹ thuật MLPA
22


Kỹ thuật MLPA sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai hóa với phân tử DNA
đích đặc hiệu. Việc thiết kế các đoạn dò rất quan trọng. Mỗi đoạn dò gồm 2 đoạn có bản

chất là oligonucleotide (đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược).
+ Đoạn dò xuôi gồm có 2 phần:
Đầu 5’: trình tự giống nhau cho tất cả các đoạn dò, là vị trí gắn mồi Y (mồi xuôi) để
khuếch đại đoạn dò khi tiến hành các phản ứng PCR.
Đầu 3’: có trình tự đặc hiệu với đoạn DNA đích (trình tự lai) và sẽ lai (bắt cặp) với
DNA đích khi tiến hành phản ứng.
+ Đoạn dò ngược gồm 3 phần:
Đầu 3’: trình tự giống nhau cho tất cả các đoạn dò, là vị trí gắn với mồi X (mồi ngược)
để khuếch đại đoạn dò khi tiến hành các phản ứng PCR.
Đầu 5’: gắn đặc hiệu với trình tự của DNA đích khi tiến hành phản ứng lai.
Ngoài ra còn đoạn nối giữa đầu 5’ với đầu 3’: gọi là đoạn đệm được thiết kế dài ngắn
khác nhau ở các đoạn dò để giúp các đoạn dò có kích thước khác nhau, có thể tách ra khi
điện di. Đoạn đệm và trình tự gắn mồi không đặc hiệu với trình tự DNA đích nên không gắn
vào DNA đích khi lai (hình 1.18).

Hình 1.18. Cấu tạo đoạn dò

23