Phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại tỉnh hòa bình

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------------------------

QUÁCH NGỌC TÙNG

PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG
SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI CỘNG
SINH TRÊN CÂY QUẾ TẠI TỈNH HÒA BÌNH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội - 2014


Quách Ngọc Tùng - K16

MỞ ĐẦU
Vi khuẩn gây bệnh cókhả năng kháng thuốc kháng sinh làvấn đề nghiêm
trọng vàthu hút mối quan tâm rất lớn của cộng đồng. Vìvậy, việc nghiên cứu,
lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ưu tiên hàng đầu của các
nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới. Cho đến nay, các nhà
khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để
phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng như các loại thuốc khác nhằm chăm
sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng phụ tới sức khỏe của người
bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra [3].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh thực vật làmột nguồn tự nhiên quan
trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật vàcác bệnh khác. Chẳng hạn,
cây quế (Cinamomum loureiri) chứa dược chất trong tinh dầu của lá, vỏ cây và
quả với 90% là cinnamaldehyde có hoạt tí

nh kháng khuẩn cao đối với cả vi
khuẩn Gram (+) vàvi khuẩn Gram (-) [5]. Carvacrol trong tinh dầu bạc hàphá
hủy màng ngoài của tế bào vi khuẩn Gram (-) làm tăng tính lưu động của màng
tế bào, dẫn đến sự thay đổi tí
nh thẩm thấu của màng tế bào... [24]. Ngoài giátrị
khoa học, thành phần của cây mang lại, cây dược liệu còn làmôi trường cho các
xạ khuẩn nội cộng sinh (sống trong các loại môthực vật) cókhả năng sinh tổng
hợp chất kháng sinh [49]. Theo nghiên cứu của Berdy, 2005 ước tí
nh khoảng
70% các kháng sinh cónguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong y học lâm sàng
hiện nay được sản sinh bởi xạ khuẩn [11]. Gần đây, một số công bố cho thấy các
hợp chất chuyển hóa thứ cấp do xạ khuẩn nội cộng sinh tạo ra trên cây dược liệu
không chỉ cósố lượng phong phúmàcòn cósự đa dạng về chức năng như tính
kháng vi sinh vật, chống ôxi hóa, chống sốt rét vàkiểm soát sinh học...
Các cây dược liệu ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng [3]. Trong số đó,
cây quế là loài cây dược liệu cónhiều công dụng như kháng nấm, chống dị ứng,
ung thư dạ dày, chống oxy hóa... Ngoài giátrị khoa học do thành phần của cây
mang lại, qua khảo sát ban đầu cho thấy cây quế còn là môi trường cho các xạ
1
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

khuẩn nội cộng sinh cókhả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh, chất chống ung
thư. Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế
nói riêng và cây dược liệu nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Xuất
phát từ những định hướng trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Phân
lập, đánh giá đa dạng vàkhả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh
trên cây quế tại tỉnh HoàBì

nh”.
Đề tài đươ ̣c thực hiê ̣n ta ̣i phòng Công nghê ̣ lên men, Viê ̣n Công nghê ̣ sinh
học, Viê ̣n Hàn lâm Khoa ho ̣c và Công nghê ̣ Viê ̣t Nam, gồm 4 nội dung chiń h:
- Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trên các mẫu cây
quế thu thập tại tỉnh Hòa Bình.
- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ khuẩn nội
cộng sinh và xác định sự có mặt của ba gen mãhóa các enzyme tham gia
vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm polyketide synthases (PKS-I,
PKS-II) vànonribosomal peptide synthetase (NRPS).
- Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao.
- Nghiên cứu tách dòng và phân tích trình tự gen mã hóa PKS-I, PKS-II
của chủng xạ khuẩn được tuyển chọn.

2
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu
1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh
Hiện nay, nhiều công trì
nh nghiên cứu trên thế giới công bố về tương tác
giữa thực vật vàvi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò như tác nhân ức
chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, phân giải
phospho khó hoàtan, cố định nitơ tự do, tăng độ phìcủa đất... [17, 51]. Phần
lớn các VSV bao gồm vi khuẩn, nấm mốc vàxạ khuẩn được phân lập từ đất,
vùng rễ, bề mặt hoặc trong các môthực vật.

Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh được đưa ra khi Smith và cộng sự
(1957) phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế
nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây càchua không nhiễm bệnh
[57]. Từ đó, đã có nhiều định nghĩa khác nhau về VSV nội cộng sinh nhưng
định nghĩa của Bacon vàWhite (2000): ‘‘VSV nội cộng sinh lànhững VSV sinh
trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây
chủ’’ đã được các nhàVSV học thừa nhận [10]. Theo tài liệu, định nghĩa này
hàm chứa một ýrất quan trọng: VSV nội cộng sinh không những không gây ảnh
hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn
dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất... [8].
Trong số các VSV nội cộng sinh, xạ khuẩn được chúýbởi khả năng tổng
hợp kháng sinh ức chế VSV gây bệnh [38]. Song song với tác dụng dược lýthu
nhận từ xạ khuẩn nội cộng sinh, một số nhà sinh vật học đã nghiên cứu khả
năng kiểm soát sinh học (biocontrol) của xạ khuẩn nội cộng sinh trong suốt hai
thập kỷ qua [59, 60]. Xạ khuẩn đã được chứng minh khả năng tăng cường, thúc
đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả
năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [4]. Những hiểu biết
về sinh lývàmối tương tác phân tử giữa xạ khuẩn vàthực vật lànhững đặc tính
quan trọng để khai thác những đặc tí
nh cólợi của xạ khuẩn nội cộng sinh trong
kích thích sinh trưởng thực vật và lĩnh vực khác.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò quan trọng của xạ
khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự đa dạng của xạ khuẩn cộng sinh
trong môthực vật làrất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có
3
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của
đời sống. Các hợp chất có hoạt tí
nh sinh học từ xạ khuẩn nội cộng sinh được
chứng minh làrất đa dạng về mặt số lượng vàhoạt tính sinh học như: các chất
kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt
rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng... [10, 49]. Vìvậy, nghiên cứu sàng
lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung vàhoạt tí
nh kháng sinh nói
riêng từ xạ khuẩn cộng sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên
cứu triển vọng của các nhàkhoa học trên thế giới.
1.1.2. Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh
Xạ khuẩn cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi
trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng
mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí,nhiệt độ... Thêm vào đó, mật độ xạ
khuẩn nội cộng sinh nhì
n chung thấp vàphụ thuộc vào loại mô khác nhau trên
thực vật [49].
Theo các công trì
nh công bố, quátrì
nh phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh
cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Do đó,
phải khử trùng bề mặt mẫu vàcắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử
trùng trước khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) làmột trong những tác
nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt. Mẫu thực vật được
ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng 3-20
phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vôtrùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn
dư. Ngoài ra, hydro peroxide vàclorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất
khử trùng bề mặt hiệu quả [42]. Năm 1992, Sardi vàcộng sự công bố sử dụng
hơi của propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vìhóa chất khử trùng dạng lỏng
[60]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lýbề mặt chỉ với ethanol

không hiệu quả với qua trì
nh phân lập VSV nội cộng sinh. Nếu tăng gấp hai
hoặc ba lần các bước khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp ethanol vàmột số chất
khử trùng khác thìkhông phân lập được xạ khuẩn nội sinh. Hiệu quả khử trùng
bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween
20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của chất khử trùng với bề mặt thực
vật [12].
4
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp,
nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Trong quá trình phân lập, các nhà
nghiên cứu thường gặp phải làVSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên làvi
khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh
trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng như tìm kiếm loài xạ
khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi trường thạch
humic acid-vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men, môi trường
S… [14, 35, 38]. Ngoài ra, bổ sung các hợp chất kháng sinh như acid nalidixic
vàtrimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide để ức chế vi khuẩn, nấm nội cộng
sinh vànâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vìxạ khuẩn phát
triển chậm hơn so với vi khuẩn vànấm [29, 49].
1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật
Phần lớn xạ khuẩn nội công sinh có thể sống trong các mô thực vật và
không gây bệnh hoặc tác động bất lợi tới quátrì
nh phát triển bình thường của
cây. Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh còn được nhiều nhàkhoa học nghiên cứu về
khả năng sinh kháng sinh, chất kháng ung thư, enzyme, chất kích thích sinh

trưởng thực vật, ức chế vàkiểm soát bệnh thực vật...
1.1.3.1. Kháng ung thư, kháng viêm
Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất cóhoạt tính kháng, ức
chế tế bào ung thư từ xạ khuẩn nội cộng sinh đang là hướng nghiên cứu mới của
các nhàkhoa học trên thế giới. Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội cộng
sinh cómối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ. Một số giả thuyết nhận định
rằng gen liên quan tới tổng hợp các hợp chất có hoạt tí
nh sinh học được tiếp
nhận từ quá trình trao đổi chất giữa VSV vàthực vật thông qua hệ thống chuyển
gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Nhờ đó các nhàVSV học đã mở ra
triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá
trì
nh nuôi cấy VSV, vídụ như chất kháng tế bào ung thư paclitaxel phổ biến
trên cây thông đỏ (Taxus sp.) được tách chiết từ xạ khuẩn Kitasatospora sp. và
một số nấm cộng sinh khác [38].
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh
mới trên xạ khuẩn nội cộng sinh cótỷ lệ khácao so với xạ khuẩn phân lập từ đất
hoặc bề mặt thực vật. Chẳng hạn kháng sinh mới có tên naphthomycin K (dẫn
xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phát
5
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội cộng sinh trong cây mỹ đăng mộc
(Maytenus hookeri) - loại cây thuốc có tác dụng điều trị ung thư, hoạt huyết...
Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây
độc ức chế dòng tế bào P388 vàA-549 ở nồng độ ức chế lần lượt là0,07 và3,17
µM, nhưng không có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và vi khuẩn lao

[39, 68].
Ngoài ra, năm chất mới thuộc phân lớp 16 của nhóm macrolide được tách
chiết vàcho kết quả ức chế mạnh dòng tế bào MDA-MB-435 trong điều kiện in
vitro [68]; hai chất mới thuộc nhóm macrolide thu nhận từ Streptomyces sp.
ls9131 gần đây được phân lập trên cây mỹ đăng mộc (M. hookeri), trong đó hợp
chất dimeric dinactin có tác động kháng ung thư mạnh vàhoạt tí
nh kháng nhiều
loại vi khuẩn gây bệnh cao [39].
Trước đây, hai hợp chất 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin và 5, 7dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư
mạnh, thường thu nhận từ nhiều loài thực vật khác nhau. Nhưng gần đây, nhiều
công trì
nh công bố rằng hai hợp chất này cũng được tì
m thấy trong S.
aureofaciens CMUAc130 nội cộng sinh [61, 62]. Hoạt tí
nh kháng ung thư của
hai chất trên không chỉ hì
nh thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 vàtác
nhân hoại tử khối u (TNF-α), mà còn cảm ứng nitric oxide synthase và
cyclooxygenase-2 trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào RAW
264,7. Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất vàức chế sự hì
nh thành
TNF-α [61].
Do vậy, hiện nay xạ khuẩn nội cộng sinh lànguồn tiềm năng cần được
quan tâm nhằm khai thác các chất có hoạt tí
nh sinh học mới và thúc đẩy tìm
kiếm các loại thuốc mới.
1.1.3.2. Kiểm soát sinh học
Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội cộng sinh đã thu hút sự chú ý
của các nhàVSV bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh do đặc
tí

nh cộng sinh vàtổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh. Nhiều
nghiên cứu chứng minh đặc tí
nh bảo vệ cây chủ của xạ khuẩn nội cộng sinh
chống lại các VSV gây bệnh từ đất như Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae,
Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var. tritici, F.

6
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

oxysporum, Pythium aphanidermatum vàColletotrichum orbiculare [12, 18, 22,
23].
Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi
chất như chất kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone... Ngoài ra, các
chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kí
ch
thích các thụ thể tế bào. Vídụ như chủng S. galbus R-5 không chỉ sinh
cellulase, pectinase màcòn sản xuất actinomycin X2 và fungichromin giúp tăng
cường sức đề kháng trong cây đỗ quyên, tăng cường sản sinh jasmonate kích
thích hệ thống miễn dịch [55].
Conn và cộng sự (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm
Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây
Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh Erwinia
carotovora vàF. oxysporum; kích hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid jasmonic,
acid salicilic vàetylen [16]. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội cộng sinh với các
cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tí
nh sinh học được sinh ra bởi xạ
khuẩn nội cộng sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu cótiềm năng ứng dụng

trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng.
1.1.3.3. Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội cộng sinh
Ngoài đóng vai trò quan trọng trong chu trì
nh tuần hoàn vật chất thông
qua các enzyme thủy phân ngoại bào vàkhả năng sinh chất kháng sinh đã được
khoa học biết đến từ lâu. Gần đây, các nghiên cứu trên xạ khuẩn còn phát hiện
ra nhiều sản phẩm trao đổi chất của nhóm VSV này có ý nghĩa rất quan trọng
đối với sức khỏe con người.
Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất pháhủy tế bào hồng cầu
của động vật (như haemolysin ở Rhodococcus equi). Các nhàkhoa học đã phát
hiện tiềm năng rất lớn của các hợp chất này trong xạ khuẩn cótác dụng làm tan
những phần máu đông tụ ở những người bị bệnh tim mạch. Trong phòng thí
nghiệm, việc sàng lọc các chất cóhoạt tí
nh chống đông máu (phá hủy hồng cầu)
từ xạ khuẩn được tiến hành trên mẫu máu động vật như máu ngựa, máu thỏ
[51].
Một vídụ khác làviệc tạo ra các hợp chất cókhả năng chống lại các tác
nhân gây oxy hóa, làm tăng tuổi thọ của tế bào. Nguyên lý hoạt động của các
7
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

chất chống ôxy hóa tìm thấy ở xạ khuẩn cũng tương tự như axit ascorbic
(vitamin C) hay tocopherol (vitamin E), tức làtrung hòa thể oxy hóa rất cao của
các hợp chất oxy hóa (được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào hay
dưới tác dụng của tia cực tím) vàlàm giảm tác dụng oxy hóa của chúng [60].
Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Sri đã phân lập 65 xạ khuẩn nội cộng
sinh trên 13 cây dược liệu chữa bệnh tiểu đường như cây lô hội (Alloe vera),

dây ký ninh (Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata),
nghệ xanh (Curcuma aeruginosa), rau má (Centela asiatica)... Trong đó, các
chủng thể hiện hoạt tính alpha glucosidase ức chế quátrì
nh thủy phân tinh bột
thành glucose thẩm thấu vào ruột non. Kết quả nghiên cứu trên đã tuyển chọn
được chủng BWA65 có hoạt tính ức chế alpha glucosidase gấp hơn hai lần so
với chất cóhoạt tính tương tự thu được từ dịch chiết cây dây kýninh [58].
Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với sự
sinh trưởng vàcạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường tự nhiên còn chưa rõ
ràng nhưng tác dụng mà chúng mang lại trong lĩnh vực y dược, dược phẩm,
nông nghiệp đã được chứng minh. Chính vìlý do này, các nhàkhoa học hiện
nay rất quan tâm tới việc sàng lọc các hợp chất cóhoạt tí
nh sinh học cao từ xạ
khuẩn nói chung vàxạ khuẩn nội cộng sinh nói riêng.
1.1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh
1.1.4.1. Tì
nh hì
nh nghiên cứu trên thế giới
Trong vài thập kỷ qua đã chứng kiến nhiều thành tựu trong tìm kiếm các
loài xạ khuẩn vàcác hợp chất mới cóhoạt tí
nh sinh học từ xạ khuẩn trong môtế
bào thực vật. Do tiềm năng ứng dụng lớn của xạ khuẩn nội cộng sinh nên đối
tượng VSV này đang được quan tâm vànghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới
như: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản… Sơ lược về tì
nh
hì
nh nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật trong hơn 10 năm gần đây
được thể hiện trong bảng 1.1 [49].

8

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội
cộng sinh trên thực vật
Loài thực vật

Chi xạ khuẩn

Tài liệu
tham khảo

Cây trồng
Lúa mì
(Triticum aestivum)
Dưa leo
(Cucumis sativus)
Ngô(Zea mays)

Streptomyces, Microbispora,
Micromonospora, Nocardioides
Streptomyces

[18]
[55]

Microbispora, Streptomyces,
Streptosporangium

[9]

Cơm cháy
(Sambucus adnata)
Riềng nếp
(Alpinia galangal)

Glycomyces

[49]

Streptomyces, Nocardia, Microbispora,
Micromonospora

[62]

Mộc lan (Kennedia
nigricans)
Sầu đâu

Streptomyces

[14]

Streptomyces, Streptosporangium,
Microbispora, Streptoverticillium,
Saccharomonospora, Nocardia

[30]

Cây dƣợc liệu

(Azadirachta
indica)

Sự đa dạng của xạ khuẩn cộng sinh trong môthực vật rất phong phúhứa
hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tí
nh sinh học do các chủng xạ
khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực đời sống. Tuy nhiên, so với sự đa dạng
của giới thực vật, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực
vật vẫn còn rất hạn chế.
Trong hơn 10 năm gần đây (2001-2012), các nhà khoa học thuộc Viện
VSV học Vân Nam, Trung Quốc đã không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ưu
hóa các điều kiện phân lập và đưa vào bảo tàng giống hơn 5.000 chủng xạ
khuẩn nội cộng sinh phân lập từ hơn 100 loài thực vật [49]. Các hợp chất
chuyển hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn này sinh ra cũng được chứng minh
làrất đa dạng về mặt số lượng vàhoạt tí
nh sinh học như các chất kiểm soát sinh
9
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

học, chất kháng VSV, kháng tế bào ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất
diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng… Khi nghiên cứu về đa dạng sinh học xạ
khuẩn nội sinh, nhóm nghiên cứu của TS. Chen thuộc Viện VSV học Vân Nam,
Trung Quốc đã khẳng định xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu tại rừng
nhiệt đới vô cùng phong phú. Theo đó, TS. Chen đã thu nhận 2174 chủng xạ

khuẩn trên các môi trường khác nhau từ 90 loại cây dược liệu tại rừng nhiệt đới
Xishuangbanna và xác định được có19 loài xạ khuẩn mới [15].
Cũng từ những chủng xạ khuẩn được phân lập trên các cây dược liệu tại
vùng Vân Nam, Trung Quốc nói trên, rất nhiều hợp chất mới đã được phát hiện
như: 9-hydroxybafilomycin D, 29-hydroxybafilomycin D, bafilomycin D,
bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycin B1, bafilomycin B2, bafilomycin
C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide, bafilomycin C2 amide; caryolane1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, Tripstretine … [11].
1.1.4.2. Tì
nh hì
nh nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về VSV nội cộng sinh nói chung
và xạ khuẩn nói riêng. Một số nghiên cứu khác về vi khuẩn, nấm nội sinh có thể
được tóm tắt như sau:
Nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Lê Mai Hương tại Viện Hóa hợp chất
thiên nhiên đã thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ (Taxus sp.) ở
Việt Nam và tách chiết một chất gần giống 10-deacetil baceatin III (10-DAB)chất chuyển hóa thành taxol. Từ lõi cây, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6
chủng nấm, trong đó một chủng thuộc loài Mucor circinolloides var. tieghem.
Chất tách chiết từ dịch lên men của chủng nấm nội cộng sinh có đặc điểm gần
giống với 10-DAB từ cây thông đỏ. Từ kết quả đó, có thể khẳng định những sản
phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học không chỉ được tạo ra từ cây chủ mà
còn có thể tạo ra bởi VSV nội cộng sinh [3].
Từ 54 mẫu cây lúa (Oryza sativa L.) trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy
Hòa, PhúYên, nhóm nghiên cứu của TS. Cao Ngọc Điệp đã phân lập 191 chủng
vi khuẩn nội cộng sinh, trong đó 27 chủng thuộc các chi Burkholderia,
10
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

Enterobacter, Bacillus có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp indol3-acetic acid (IAA) tốt [7].
Năm 2013, Hoàng Hoa Long và cộng sự đã phân lập chủng vi khuẩn
Bacillus sp. B55 trên cây thuốc lá (Nicotiana attenuata) làm tăng khả năng sống
sót và kích thích sinh trưởng của cây chủ trong điều kiện tự nhiên có thể thông
qua một số cơ chế như tổng hợp IAA, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid
deaminase (ACCd) và hòa tan phosphat vô cơ. Ngoài ra, đặc tính kích thích sinh
trưởng cây chủ của chủng vi khuẩn này có quan hệ mật thiết đối với mật độ
chúng bên trong mô cây chủ [6].
Theo thống kê của Viện Dược liệu, Việt Nam đã phát hiện 4.000 loài cây
thuốc, trong đó có nhiều loại dược liệu quý được thế giới công nhận như cây
hồi, quế, atiso, sâm Ngọc Linh... Cho đến nay, trên thế giới và Việt Nam chưa
có công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh, cũng như về đánh giá đa dạng xạ
khuẩn trên cây quế.
1.2. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật
Xạ khuẩn sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả vàhạt)
của cây chủ vàchủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào.
Đáng chú ý, thực vật có khoảng 300.000 loài trên trái đất, mỗi loài thực vật là
nơi cư trú của rất nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh tạo nên sự đa dạng sinh học
[59]. Tuy nhiên, chỉ cómột phần nhỏ thực vật liên quan đến xạ khuẩn nội cộng
sinh đã được nghiên cứu nên cơ hội để tì
m ra các loài mới vàsản phẩm cóhoạt
tí
nh sinh học cónguồn gốc từ tự nhiên làrất lớn. Những nghiên cứu gần đây đã
khẳng định sự đa dạng vàphong phú của xạ khuẩn nội cộng sinh vàcác hợp
chất có hoạt tí
nh sinh học [12]. Xạ khuẩn nội cộng sinh đã và đang được các
nhàkhoa học trên thế giới nghiên cứu về tiềm năng ứng vàứng dụng trong lĩnh
vực y học, nông nghiệp vàcông nghiệp [40].
Hiện nay, xạ khuẩn nội cộng sinh được phân lập từ nhiều loài cây trồng
như lúa mì, gạo, khoai tây, càrốt, càchua, cây gỗ, nho, rêu và dương xỉ... [30,

49, 50]. Cũng như xạ khuẩn phân lập từ đất, tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh thuộc

11
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

chi Streptomyces chiếm hơn 50%, tiếp theo là các chi Microbispora,
Micromonospora, Nocardioide, Nocardia vàStreptosporangium [49].
Các nghiên cứu về đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh được công bố bởi các
nhóm nghiên cứu khác nhau từ Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ... Tan vàcộng sự
(2006) đã phân lập được 619 chủng xạ khuẩn từ các loại cây càchua khác nhau
vàtất cả các chủng đó đều thuộc chi Streptomyces [64]. Từ 36 cây dược liệu ở
Thái Lan, nhóm nghiên cứu của Taechowisan đã phân lập được 330 chủng xạ
khuẩn thuộc 4 chi khác nhau (Streptomyces, Microbispora, Nocardia,
Micromonospora) [63]. Inderiati và Muliani (2008) đã phân lập được các chủng
xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces từ cây thuốc lá[59]. Hơn nữa, Verma vàcộng
sự (2009) cho thấy Streptomyces sp. chiếm khoảng 50% trong tổng số 55 chủng
thu nhận từ cây sầu đâu (Azadirachta indica A. Juss) tại Ấn Độ [30]. Tổng hợp
các nghiên cứu trên cho thấy Streptomyces sp. cókhả năng thích ứng, phát triển
mạnh hơn so với các xạ khuẩn thuộc chi khác.
Trái với kết quả trên, nhóm nghiên cứu của giáo sư Li thuộc Viện VSV
học Vân Nam, Trung Quốc đã kết luận Microbispora chiếm 67% trên tổng số 81
chủng xạ khuẩn từ rễ cây bắp cải Trung Quốc (Brassica rapa), tiếp theo là
Streptomyces ssp. (12,0%) và Micromonospora ssp. (11,0%). Takahashi và
Omura (2003) phân lập 33 chủng Microbispora, 32 chủng Streptomyces và10
xạ khuẩn hiếm khác từ lárụng thuộc chín chi của thực vật bậc cao [49]. Theo
Kizuka vàcộng sự (1998), tỷ lệ phân lập Microbispora từ thực vật cao hơn đất
nhiều lần [33]. Như vậy, chi Streptomyces và Microbispora dường như sinh

trưởng trên môi trường đất vànội cộng sinh mặc dùchỉ cómột số lượng hạn chế
các loài cóthể tồn tại theo cả hai phương thức này.
Phần lớn tỷ lệ phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh từ rễ cao hơn các bộ phận
khác trong cây. El-Tarabily vàcộng sự (2006) ước tí
nh mật độ xạ khuẩn nuôi
cấy được trong dưa chuột (Cucummis sativus) và rễ của cây họ đậu (Glycine
max) đạt 105 CFU/g khối lượng củ/rễ tươi [23]. Tian vàcộng sự (2007) đã phân
tích 45 gen 16S rDNA và33 mẫu gen tách dòng từ xạ khuẩn phân lập trên rễ và
thân cây, thu được 9 chi xạ khuẩn khác nhau từ rễ và4 chi xạ khuẩn từ thân

12
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

[49]. So với thân vàlá, tập hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ nhì
n chung
đa dạng hơn.
Cho đến nay, hơn 40 loài xạ khuẩn mới đã được tìm thấy bằng nhiều
phương pháp phân lập vàphân loại khác nhau, bao gồm 4 chi mới thuộc nhóm
Plantactinospora, Actinophytocola, Phytohabitans và Jishengella. Tì
nh hì
nh
phân lập các chủng xạ khuẩn mới trên cây dược liệu thể hiện ở bảng 1.2 [49].
Bảng 1.2. Xạ khuẩn mới được phân lập từ các cây dược liệu
Mãsố của gen
16S rDNA
Xạ khuẩn
trên GenBank

AJ784008
DQ343154
GU227146
DQ460469
EU200682
EU814511
EU429322
FJ805428
DQ473536

Micromonospora
coriariae
Pseudonocardia
oroxyli
Pseudonocardia
artemisiae
Glycomyces
sambucus
Glycomyces
scopariae
Streptomyces
mayteni
Actinoallomurus
acaciae
Nocardia
callitridis
Leifsonia
ginsengi

Cây dƣợc liệu

Trình tự gen
16S rDNA đƣợc
so sánh (%)

Mãtang (Coriaria
M. endolithica
myrtifolia)
(98,94%)
Núc nác (Oroxylum
P. halophobica
indicum)
(97,8%)
Thanh hao hoa vàng
P. saturnea
(Artemisia annua L.)
(96,6%)
Cơm cháy (Sambucus
G. lechevalierae
adnata Wal)
(97,2%)
Cam thảo nam (Scoparia G. algeriensis
dulcis)
(97,4%)
Dóbầu (Maytenus
G. algeriensis
austroyunnanensis)
(97,1%)
Keo látràm (Acacia
A. caesius

Auriculiformis)
(99,3%)
Thông đỏ (Callitris
N. nova
preissii)
(97,4%)
Nhân sâm (Ginseng)
L. poae
(97.6%)

Những hiểu biết về đa dạng của xạ khuẩn nội cộng sinh không chỉ giúp
sàng lọc những chủng có lợi mà còn giúp các nhà khoa học hiểu rõ vai trò
chúng trong hệ sinh thái. Strobel vàDaisy (2003) cho rằng sự đa dạng lớn nhất
của xạ khuẩn nội cộng sinh diễn ra ở khu vực nhiệt đới vàkhu vực cónhiệt độ
13
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

ấm [59]. Janso và Carter (2010) công bố kết quả phân lập 123 xạ khuẩn nội
cộng sinh từ các loài cây nhiệt đới thu từ một số địa điểm ở Papua New Guinea
và Đảo Mborokua, quần đảo Solomon. Nhóm nghiên cứu đã tìm thấy 17 chi xạ
khuẩn khác nhau khi phân tích trì
nh tự gen 16S rDNA vàphát hiện chi mới như
Sphaerisporangium vàPlanotetraspora. Phân tích cây phát sinh loài cho thấy,
nhiều

chủng

xạ

khuẩn

mới

thuộc

chi

Thermomonosporaceae

và

Micromonosporaceae [49].
Tổng hợp các nghiên cứu cho thấy rừng nhiệt đới sở hữu sự đa dạng sinh
học lớn nhất trên thế giới về tài nguyên thiên nhiên vàVSV nội cộng sinh. Tại
rừng nhiệt đới Xishuangbanna của Trung Quốc đã có 2174 xạ khuẩn nội cộng
sinh được phân lập từ những cây thuốc với các phương pháp phân lập khác nhau
dựa trên quátrì
nh tiền xử lýmẫu, môi trường phân lập. Các chủng này đại diện
cho 10 Bộ phụ khác nhau và 32 chi, phát hiện ít nhất 19 loài mới [28, 49].
Trong đó, một chi mới vàhai loài mới được phân lập trên cây dóbầu (Maytenus
austroyunnanensis). Rõ ràng, tại rừng nhiệt đới có nguồn xạ khuẩn phong phú
và đa dạng hơn nhiều so với các khu vực khác vàhứa hẹn lànguồn phát hiện
các chủng xạ khuẩn mới. Xạ khuẩn nội cộng sinh rất đa dạng và mức độ đa
dạng cóthể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu vàcác loài thực vật khác nhau. Sự
đa dạng về chi và số lượng xạ khuẩn nội cộng sinh phần lớn phụ thuộc vào
phương pháp phân lập.
1.3. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây

dƣợc liệu
1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh
Chất kháng sinh đã được phát hiện vàứng dụng để chữa bệnh cho con
người. Nhờ kháng sinh mà chúng ta đã đẩy lùi được nhiều bệnh vàdịch bệnh
nguy hiểm như: tả, đậu mùa, thương hàn… Phần lớn các chất kháng sinh được
sử dụng trong y học cónguồn gốc từ xạ khuẩn. Trong số 8.000 chất kháng sinh
đã được biết đến trên thế giới thìtrên 80% làdo xạ khuẩn sinh ra.
14
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

Nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt lànhững loài được phân lập
từ cây dược liệu cókhả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như
vi khuẩn, nấm và virus. Như vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh cótiềm năng để phát
triển các loại thuốc kháng sinh mới (Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh
Xạ khuẩn

Cây dƣợc liệu

Kháng sinh

Hoạt tính

Streptomyces sp.
NRRL 30562
Streptomyces sp.
NRRL 30566

Streptomyces sp.
CS
Streptomyces
albidoflavus
Streptomyces sp.
TP-A0556
Streptomyces sp.
TP-A0595
Micromonospora
lupini
Streptomyces sp.
TP-A0456

Hoa mộc lan (Kenndia
nigriscans)
Cơm vàng (Grevillea
pteridifolia)
Mỹ đăng mộc
(Maytenus hookeri)
Vẹt dù(Bruguiera
Gymnorrhiza)
Thanh mộc (Aucuba
japonica)
Hẹ (Allium
tuberosum)
Đậu lupin (Lupinus
Angustifolius)
Liễu sam (Cryptomeria
japonica)

Munumbicins A-D

Kháng sinh

Kakadumycins

Kháng sinh

24-demethylbafilomycin A2
Antimycin A18

Kháng sinh,
Kháng ung thư
Kháng nấm

Demethylnovobioci
n
6-Prenylindole

Kháng VSV

Lupinacidins A, B

Kháng ung thư

Cedarmycins A, B

Kháng nấm

Kháng nấm

Cho đến nay, rất nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã được phát hiện như
munumbicin AD [14], lansai A–D [67], celastramycin AB [48], kakadumycin và
demethylnovobiocin [14, 30]. Chất 6-Prenylindole được tách chiết từ dịch lên
men chủng Streptomyces sp. TP-A0595 có hoạt tí
nh kháng nấm gây bệnh thối
cổ rễ gây ra bởi nấm Fusarium oxysporum. Những nghiên cứu trước đó, chất 6Prenylindole được biết đến khi được thu nhận chủ yếu từ lávàthân cây rêu tản
(Hepatopsidae sp.) [49]. Đây là một vídụ điển hì
nh về khả năng thu nhận các
hợp chất hoặc các dẫn xuất tương tự trong thực vật nhờ xạ khuẩn nội cộng sinh.
Streptomyces sp. Tc022 được phân lập từ rễ cây riềng nếp (Alpinia galanga) có
15
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

hoạt tí
nh ức chế mạnh Colletotrichum musae và Candida albicans. Khi tách
chiết từ môi trường nuôi cấy chủng Streptomyces sp. Tc022, thu được hợp chất
có thành phần chí
nh là actinomycin D-chất có hoạt tính kháng nấm rất mạnh
[62]. Năm 2006, Castillo và cộng sự đã phân lập hai kháng sinh mới có tên là
munumbicins E-4 vàE-5 từ Streptomyces sp. NRRL 30562 có hoạt tí
nh kháng
vi khuẩn Gram (+) vàGram (-) [14]. Gần đây, hợp chất saadamycin cókhả năng
kháng nấm gây bệnh hắc lào vàmột số nấm gây bệnh khác được tìm thấy trong
Streptomyces sp. Hedaya48 [21].
1.3.2. Các gen tham gia vào quátrình tổng hợp kháng sinh vàcác hợp chất
trao đổi thứ cấp

Polyketides là nhóm đại diện cho các sản phẩm tự nhiên (sản phẩm trao
đổi chất bậc hai) được sản xuất bởi như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn vàthực vật
[52]. Các kháng sinh dạng polyketide được sử dụng nhiều trong sản xuất thuốc
điều trị các bệnh lâm sàng như tetracycline, daunorubicin, erythromycin,
rapamycin vàlovastatin... Nhóm polyketide được tổng hợp nhờ quá trình ngưng
kết lặp lại nhiều lần các carbon mạch ngắn hoặc các nhóm acetate hay acyl
propionate đặc trưng là dẫn xuất từ malonyl hay methylmalonyl coenzyme A
thioester. Mặt khác, polyketide có thể định nghĩa là các liên kết dạng polyme
được cấu thành từ các đơn vị ketide, các hợp chất này được chia thành 2 loại
gồm: polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS)
[41].
1.3.2.1. Gen chức năng pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa vòng thơm
Các polyketide đa vòng thơm được hì
nh thành chủ yếu từ quá trình ngưng
kết acyl acetate và nhóm β−carbonyl. Sau khi tổng hợp, chuỗi polyketide được
sắp xếp lại thành các hợp chất đa vòng thơm. Oxytetracycline, actinorhodin và
anthracycline làcác nhóm hợp chất kháng sinh, kháng ung thư đa vòng thơm
được tạo thành từ quátrình trên [27]. Gen mãhóa enzyme chịu trách nhiệm sinh
tổng hợp polyketide đa vòng thơm chủ yếu làpolyketide synthase II (PKS-II).
Hỗn hợp polyketide được hì
nh thành dựa trên quá trình ngưng kết từ các đơn vị
16
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

acetate, propionate, acyl butyrate và khử nhóm β−carbonyl. Trong tổng hợp
polyketide, các polyketide khác nhau được hình thành từ một hoặc nhiều quá
trình ngưng tụ. Các chuỗi polyketide tiếp tục phát triển, kéo dài và đóng vòng

tạo thành sản phẩm cuối cùng thông qua 3 quá trì
nh khác nhờ sự hỗ trợ của
ketosynthase (KS), acyl transferase (AT) vàacyl carrier protein (ACP). Các gen
mãhóa enzyme chịu trách nhiệm sinh tổng hợp tạo sản phẩm cuối cùng gọi là
polyketide synthase I (PKS-I) [41].
1.3.2.2. Gen chức năng nrps
NRPS là nhóm enzyme có khối lượng phân tử lớn, cấu tạo chia làm 4
phần, bao gồm vùng A (adenyl hóa), vùng ngưng tụ hoặc kéo dài (C), vùng E
(epime hóa) vàTE (thioesterase), tham gia sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất
bậc hai không thông qua ribosom tạo dạng peptide. Hỗn hợp oligopeptide được
tạo thành bởi NRPS nhờ quá trình ngưng tụ các protein và acid amin phi
protein. Trong quátrì
nh tổng hợp, NRPS chịu trách nhiệm phát hiện, loại bỏ các
acid amin có những sai khác nhờ sự tương tác với vùng epime hóa nhờ
methyltransferase vàoxidase [41].
Nhóm enzyme NRPS được tìm thấy phổ biến trong nấm, xạ khuẩn, vi
khuẩn, trong đó NRPS tham gia tổng hợp peptide không thông qua ribosom, bao
gồm: kháng sinh (penicillin và cephalosporin), chất độc, siderophore, chất
kháng viêm, chất ức chế miễn dịch (cyclosporine A) [27].
Do vậy, nhằm dự đoán cấu trúc của chất kháng sinh, trình tự amino acid
của PKS-I, PKS-II, NRPS được phân lập và so sánh với enzyme có trì
nh tự
tương tự tham gia vào tổng hợp các hợp chất polyketide khác. Để khuếch đại
các gen trên, mồi suy biến (degenerate primers) được thiết kế, khuếch đại vùng
KS và A nhằm sàng lọc gen tham gia tổng hợp chất kháng sinh, kháng viêm
cũng như nghiên cứu đa dạng của gen pks-I, pks-II, nrps trong xạ khuẩn [27].
1.3.2.3. Đánh giá đa dạng gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS

17
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Quách Ngọc Tùng - K16

Nhằm đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp của các nhóm xạ khuẩn khác
nhau, oligonucleotide primer được thiết kế, khuếch đại vùng KS và A nhằm
sàng lọc gen kháng sinh về mặt di truyền vànghiên cứu đa dạng của gen pks-I,
pks-II, nrps. Sacido vàGenilloud (2003) đã nghiên cứu đa dạng của gen pks-I,
pks-II, nrps trong 210 chủng đại diện thuộc 33 chi xạ khuẩn (Bảng 1.4).
Bảng 1.4. Tần xuất xuất hiện gen pks-I, nrps trong các phân nhóm xạ khuẩn
khác nhau
Phân nhóm

Tổng số
chủng

Actinomycetales
Streptomycetaceae
Micromonosporaceae
Nocardiaceae
Pseudonocardiaceae
Nocardiopsaceae
Actinosynnemataceae
Thermomonosporaceae
Streptosporangiaceae
Glycomycetaceae
Geothermatophilaceae

210
33

65
22
37
6
13
8
20
3
3

Gen nrps

Gen pks-I

Số lƣợng
(chủng)

Tỷ lệ
(%)

Số lƣợng
(chủng)

Tỷ lệ
(%)

167
32
50
20

29
4
13
5
13
2
0

79,5
97,0
76,9
90,9
76,3
66,7
100
62,5
65,0
66,7
0

119
26
31
13
20
3
8
3
4
0

1

56,7
78,8
47,7
59,0
52,6
27,3
61,5
37,5
20,0
0
33,3

Theo đó, trì
nh tự gen nrps phân bố rộng rãi vàchiếm tỷ lệ cao nhất, đạt
79,5%; trì
nh tự pks-I chiếm tỷ lệ thấp hơn (56,7%). Trình tự pks-I, pks-II, nrps
được phát hiện ở hầu hết các chủng thuộc chi Streptomyces (khoảng 97% và
79%), nhưng sự phân bố của nhóm gen này biến động mạnh trong các chi còn
lại [53].
Gen nrps xuất hiện hầu hết trong các chủng thuộc nhóm
Micromonosporaceae (50-100%) nhưng đối với các chủng thuộc chi
Micromonospora và Catenuloplanes thìgen pks-I lần lượt đạt 68% và 60%.
Hơn nữa, gen pks-I không được tìm thấy trong chi Catellatospora. Ngược lại,
18
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

gen pks-I, pks-II, nrps được phát hiện trong họ Pseudonocardiaceae (chiếm
76,3% và 52,6%) với tỷ lệ cao trong các chi như: Amycolatopsis,
Saccharopolyspora vàSaccharomonospora. Ngoài ra, pks-I vànrps ít xuất hiện
trong chi Pseudonocardia mặc dùtỷ lệ các chủng được phân tích cao [53].
Trong các chủng thuộc họ Actinosynnemataceae, tỷ lệ pks-I, nrps được
phát hiện lần lượt đạt 100% và61,5% trên tổng số các chủng được kiểm tra,
mặc dù chỉ có một số đại diện là các chi Actinokineospora, Lechevalieria,
Saccharothrix, Lentzea, vàActinosynnema. Đặc biệt, pks-I vànrps phân bố với
tỷ lệ thấp trong các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae (khoảng 65% và
20%) và không xuất hiện ở các họ Nocardiopsaceae, Thermomonosporaceae,
Glycomycetaceae, vàGeodermatophilaceae.
Cả hai trì
nh tự này xuất hiện chủ yếu trong những chủng thuộc các chi
như Streptomyces hoặc các họ Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae và
Actinosynnemataceae. Các chi trên cógen mãhóa NRPS cókhả năng sinh tổng
hợp vancomycin hoặc các hợp chất polyketide như erythromycin hoặc spinosin.
Tuy nhiên, những trì
nh tự này cũng được phát hiện trong một số chủng không
sản xuất kháng sinh cũng như các chủng xạ khuẩn hiếm.
1.3.3. Chất kháng sinh và kháng ung thƣ nhóm anthracycline
Hiện nay, anthracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong
điều trị ung thư. Vào những năm 1960, anthracycline được phát hiện từ chất
màu của chủng xạ khuẩn S. peucetius, gồm 2 phân nhóm doxorubicin (DOX1)
vàdaunorubicin (DNR) [26].

19
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Quách Ngọc Tùng - K16

Hình 1.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hì
nh thuộc nhóm
anthracycline: DOX, DNR, EPI vàIDA
Về công thức cấu tạo, DOX vàDNR có cấu trúc gồm các aglyconic và
các gốc đường khác nhau (Hì
nh 1.1). Các aglyconic bao gồm vòng tetracyclic
liên kết với các nhóm quinone-hydroquinone trong vòng kýhiệu C vàB, trong
đó gốc methoxy thay thế C-4 trong vòng D vàmột gốc carbonyl được gắn vào
vị tríC-9, C-13. Các gốc đường khi gắn nhóm glycosyl và 3-amino-2,3,6trideoxy-L-fucosyl ở vị tríC-7 nằm trên vòng A được gọi làdaunosamine. Sự
khác nhau chí
nh giữa DOX và DNR là chuỗi của DOX bị kết thúc ở gốc
alcohol, còn DNR kết thúc ở gốc methyl. Chính sự khác biệt này tạo nên sự
khác nhau về phổ hoạt động của DOX vàDNR. DOX làthành phần thiết yếu
trong điều trị ung thư vú, hình thành các khối u, ung thư hạch bạch huyết. Trong
khi đó, DNR có tác dụng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tí
nh. Tuy nhiên, DOX
vàDNR gây tác dụng phụ như gây ra bệnh đau cơ tim mãn tính hay suy tim
[26].
Việc tìm kiếm chất anthracycline mới cóứng dụng trong thử nghiệm lâm
sàng đã thôi thúc các nhà khoa học biến đổi cấu trúc hóa học hoặc thay đổi vòng
20
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

tetracyclic, aminosugar. Kết quả đã tạo ra hai loại chất kháng ung thư tổng hợp
mới là Epirubicin (EPI) và Idarubicin (IDA). EPI là doxorubicin được epimer

hóa tại vị tríC-4 hydroxyl trên phân tử đường. EPI được sử dụng trong điều trị
ung thư dạ dày, ung thư vú, nội mạc tử cung, phổi, buồng trứng và ung thư
tuyến tiền liệt…
IDA làdẫn xuất của daunorubicin, bị khuyết thiếu nhóm methoxy tại vị
tríC-4 dẫn đến làm tăng khả năng hòa tan trong chất béo, dung môi cũng như
hoạt tính ức chế tế bào ung thư. So với DNR, IDA cónhiều ưu điểm hơn DNR
trong điều trị bệnh bạch cầu nguyên bào tủy cấp tí
nh. Hiện tại, cơ chế mànhóm
anthracycline ức chế tế bào ung thư vẫn chưa được làm sáng tỏ [26].
1.4. Cây quế vàtiềm năng khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế
Quế làtên gọi của nhiều loài trong chi Cinnamomum sp. thuộc lớp hai lá
mầm, ngành hạt kí
n, với đặc trưng là vỏ có dầu thơm, cay nồng, dùng làm
thuốc, hương liệu hay gia vị. Quế ưa khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sự
sinh trưởng, phát triển của quế là20-25oC. Hiện nay, nước ta có 4 vùng trồng
quế, mỗi vùng có những sắc thái riêng về tự nhiên về dân tộc vànguồn lợi thu
được từ quế, đó là: Vùng quế Yên Bái, vùng quế Quế Phong–Thường Xuân,
vùng quế TràMi–TràBồng, vùng quế Quảng Ninh.
Đông y coi quế làmột vị thuốc bổ, có nhiều công dụng, có khi chữa cả
đau mắt, hoi hen, bồi bổ cho phụ nữ sau sinh nở, bệnh đau bụng đi tả nguy hiểm
đến tí
nh mạng, bổ mệnh môn tướng hỏa, trị cố lãnh trầm hàn, dùng chữa chân
tay co quắp, lưng gối têmỏi, bụng quặn đau, kinh nguyệt bế, tiểu tiện bất lợi,
trên nóng dưới lạnh, chống ung thư, u khối. Ngoài ra, tinh dầu cây cótác dụng
khử nấm, đặc biệt nấm da. Dầu cây quế ở Pakistan, ngoài tác dụng ức chế nấm
Aspergillus niger, A. flavus, Candida albicans, còn rất hiệu nghiệm phòng bệnh
gây ra bởi nấm Fusarium oxysporum, Microsporum canis, Pseudallescheria
boydii, Trichophyton mantagrophytes, T. simii. Ở Ghana, dầu quế đã được dùng
để ức chế một số độc tố aflatoxin trên những bao chứa đậu phụng do các loài
nấm như Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. niger, A. candidus, A. tamarii, A.

21
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

ochraceous, Fusarum spp., Penicillum spp., Mucor ssp., Trichoderma sp.,
Rhizopus stolonifer sinh ra vìvậy nó đã được dùng làm gia vị và trong mỹ
phẩm. Ngoài ra, tinh dầu còn cótính chất chống đau, co mạch, làm tăng bài tiết,
tăng nhu động ruột, chống oxy hóa với hiệu quả 55,9% và66,9% khi dùng nồng
độ 100 và200 một phần triệu (ppm) [5].
Cho đến nay, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng
sinh trên cây quế được công bố trên thế giới cũng như Việt Nam. Do vậy,
nghiên cứu về VSV nói chung và xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Việt
Nam giúp cung cấp các số liệu tham khảo cho các nhà khoa học trong và ngoài
nước.

22
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Thu thập mẫu quế, chủng giống vi sinh vật vàplasmid
Bốn mẫu cây quế khác nhau được thu thập tại xãThung Nai, huyện Cao
Phong, tỉnh Hòa Bình, Việt Nam (tọa độ: 20°47’21’’N;105°21’20’’E) vào tháng
12/2013.
Các chủng vi sinh vật kiểm định: Salmonella enterica ATCC 14028,

Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea CNLM, Bacillus cereus ATCC
11778, Proteus vulgaris CNLM, Pseudomonas auroginosa CNLM, Candida
albicans ATCC 10231, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 nhận từ Bộ sưu tập giống VSV của Phòng Công nghệ
lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt
Nam.
Chủng Escherichia coli XL1-blue [∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMRmrr)173 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac] (Stratagene, Mỹ) vàvector tách
dòng pJET1.2/blunt (Thermo scientific, Mỹ) được sử dụng để nhân dòng gen.
2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu
Hóa chất: Cao malt (Himedia-Ấn Độ); Cao nấm men (Himedia-Ấn Độ);
Raffinose (Trung Quốc); Trehalose (Trung Quốc); Sodium dodecyl sulfate
(SDS); Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ); Phenol,
Methanol, Isoamylalcohol, EtBr, Glycerol, Ethanol, Chloroform, Ampicillin,
Acrylamide, (Merck, Đức); Agar (Fluka, Đức); d-NTP (Fermentas, Mỹ), bộ kit
tinh sạch DNA từ gel agarose và kit tinh sạch plasmid của Thermo scientific
(Mỹ)...
Enzyme: T4 DNA ligase; BglII; RNAase; Taq DNA polymerase (Thermo
scientific, Mỹ).

23
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Quách Ngọc Tùng - K16

Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Applied
Biosystems, Mỹ), máy ly tâm lạnh (Biofuge fresco, Kendro, Đức); máy điện di
DNA (Nhật), máy UV (PowerPac Basic, Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (BSI25R CPT, Mỹ) và một số thiết bị nghiên cứu khác.
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Các môi trường được sử dụng trong lưu giữ giống, phân lập và xác định

đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội cộng sinh (Phụ lục 1)
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Lấy mẫu cây quế
Các mẫu cây quế được lấy bằng dao đã khử trùng và lưu giữ trong các túi
nilon. Mỗi mẫu cây quế được chia thành 3 phần riêng: rễ, thân, lá đựng trong túi
nilông sạch có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu được bảo quản trong tủ
lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích trong vòng 20 ngày.
2.2.2. Phƣơng pháp xử lýbề mặt mẫu
Mẫu cây quế được rửa sạch dưới vòi nước để loại bỏ đất, tạp chất vàlàm
khômẫu tại nhiệt độ phòng trong 20 phút. Các mẫu được khử trùng bề mặt bằng
cách ngâm trong NaClO 5,0% (v/v) từ trong 5 phút. Rửa mẫu một lần bằng
Na2S2O3 2,0% (w/v) trong 1 phút để loại bỏ NaClO dư. Tiếp tục xử lýmẫu bằng
Ethanol 70% trong 10 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng để loại bỏ Ethanol.
Tiến hành nghiền mẫu trong tủ cấy vôtrùng [61].
Bổ sung các hợp chất kháng sinh như acid nalidixic (15 mg/mL) và
nystatin (15 mg/mL) vào 9 loại môi trường phân lập để nâng cao tí
nh chọn lọc
xạ khuẩn vàức chế phát triển của vi khuẩn vànấm cộng sinh.
2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội cộng
sinh được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch kết hợp hiệu chỉnh theo
phương pháp đã được mô tả trước đây [2, 20]. Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy
trên môi trường YIM38 ở nhiệt độ 30oC trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút
24
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật