nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố hóa học đến tạo phôi soma thông nhựa (pinus merkusii jungh et de vries) trong điều kiện in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

PHẠM CHÍ NHÂN
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
YẾU TỐ HÓA HỌC ĐẾN TẠO PHÔI SOMA
THÔNG NHỰA (PINUS MERKUSII JUNGH
ET DE VRIES) TRONG ĐIỀU KIỆN IN
VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

PHẠM CHÍ NHÂN
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
YẾU TỐ HÓA HỌC ĐẾN TẠO PHÔI SOMA
THÔNG NHỰA (PINUS MERKUSII JUNGH
ET DE VRIES) TRONG ĐIỀU KIỆN IN
VITRO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số

: 604230
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN
Thành phố Hồ Chí Minh - 2012


LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến:
TS. Vương Đình Tuấn, người Thầy đã trực tiếp và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo,
động viên và đóng góp ý kiến quý báu, sâu sắc.
Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, các cô, chú, anh chị ở Viện nghiên cứu khoa học
lâm nghiệp Nam bộ, phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã quan tâm, giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp tại phân viện.
Xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh,
Phòng Sau đại học ,
Ban chủ nhiệm khoa Sinh học
Quý Thầy, Cô đã tham gia giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu và đã tạo
điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn các anh chị, các bạn học viên cao học khóa 19 luôn đồng hành trong quá
trình học tập cũng như chia sẻ nhiều tài liệu học tập có giá trị.
Cảm ơn gia đình và những người thân yê luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ những
lúc khó khăn.
Tất cả là nguồn động viên, tiếp thêm nghị lực để tôi hoàn thành chương trình học và
thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn./.

Tp. Hồ Chí Minh, năm 2012.
Phạm Chí Nhân.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................2
4. Thời gian thực hiện ..............................................................................................2
Chương 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. Giới thiệu về cây thông nhựa ............................................................................3
1.1.1. Vị trí phân loại:...........................................................................................3
1.1.2. Phân bố: ......................................................................................................3
1.1.3. Đặc điểm.....................................................................................................4
1.1.4. Giá trị kinh tế của thông nhựa ....................................................................6
1.2. Phôi vô tính .......................................................................................................7
1.2.1. Giới thiệu về phôi vô tính ...........................................................................7
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo phôi vô tính ..............................13
1.3. Tình hình nghiên cứu tạo phôi vô tính............................................................23
1.3.1. Tạo phôi vô tính ở cây rừng .....................................................................24
1.3.2. Tạo phôi vô tính ở chi Thông ...................................................................26
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................................................29
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu............................................................29
2.1.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................29
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................29
2.2. Vật liệu, dụng cụ và hóa chất..........................................................................29


2.2.1 Vật liệu ......................................................................................................29
2.2.2. Dụng cụ thí nghiệm ..................................................................................29
2.2.3. Hóa chất ....................................................................................................30
2.3. Phương pháp tiến hành ...................................................................................30
2.3.1. Nghiên cứu tăng sinh khối tế bào tiền phôi ..............................................30

2.3.2. Nghiên cứu thành thục hóa khối tiền phôi và tạo phôi soma ...................33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................39
3.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu hiệu quả của L- glutamine đến tăng sinh khối tế
bào tiền phôi...........................................................................................................39
3.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu hiệu quả NAA, BA đến tăng sinh khối tế bào tiền
phôi ........................................................................................................................44
3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng adenine sulfate đến thành thục hóa tiền
phôi ........................................................................................................................48
3.4. Thí nghiệm 4: nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến thành thục hóa tiền phôi
...............................................................................................................................51
3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của một số nồng độ và loại đường đến thành thục
hóa tiền phôi...........................................................................................................54
3.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của phối hợp PEG với đường đến thành thục hóa
tiền phôi .................................................................................................................57
3.7. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của một số nồng độ than hoạt tính đến thành thục
hóa tiền phôi...........................................................................................................59
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................62
4.1. Kết luận ...........................................................................................................62
4.2. Một số kiến nghị .............................................................................................62


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ABA: Abscisis acid
BA: 6- benzyl adenine
BAP : 6-benzylaminopurine
BM: basal medium
2,4- D: 2,4- diclorophenoxyacetic
LM: Lindemann(1970)
LVM: Litvay medium (1985)
MS: Murashige và Skoog (1962)

NAA: Naphthalene acid acetic
PEG: polyethylene glycol
TDZ: Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)
cs: cộng sự


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu hiệu quả L- glutamine đến
tăng sinh khối tế bào tiền phôi.

31

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu hiệu quả NAA, BA đến
tăng sinh khối tế bào tiền phôi.

32

Bảng 2.3. Nồng độ Adenine sulfate trong thí nghiệm nghiên cứu
ảnh hưởng adenin sulfate đến thành thục hóa tiền phôi.

34

Bảng 2.4. Nồng độ ABA dùng trong nghiên cứu ảnh hưởng của ABA
đến thành thục hóa tiền phôi.

35

Bảng 2.5. Loại đường và nồng độ đường dùng trong nghiên cứu ảnh hưởng
của một số nồng độ và loại đường đến thành thục hóa tiền phôi.

35

Bảng 2.6. Nồng độ đường và loại đường trong nghiên cứu ảnh hưởng
của phối hợp PEG với đường đến thành thục hóa tiền phôi.

36

Bảng 2.7. Lượng than hoạt tính sử dụng trong nghiên cứu ảnh hưởng
của một số nồng độ than hoạt tính đến thành thục hóa tiền phôi.

37

Bảng 3.1. Sinh khối tăng trung bình của dòng 6 khi khảo sát hiệu quả
của L- glutamine

38

Bảng 3.2. Sinh khối tăng trung bình của dòng 31 khi khảo sát hiệu quả
của L- glutamine

38

Bảng 3.3. Sinh khối tăng trung bình của dòng 44 khi khảo sát hiệu quả
của L- glutamine

39

Bảng 3.4. Sinh khối tăng trung bình của dòng 54 khi khảo sát hiệu quả
của L- glutamine

39

Bảng 3.5. Sinh khối tăng trung bình của dòng 2 khi khảo sát hiệu quả
của L- glutamine

40

Bảng 3.6. Sinh khối tăng trung bình của dòng 29 khi khảo sát hiệu quả
của L- glutamine
Bảng 3.7. Sinh khối tăng trung bình của dòng 6 khi khảo sát hiệu quả

40


của BA và NAA

43

Bảng 3.8. Sinh khối tăng trung bình của dòng 31 khi khảo sát hiệu quả
của BA và NAA

43

Bảng 3.9. Sinh khối tăng trung bình của dòng 44 khi khảo sát hiệu quả
của BA và NAA

44

Bảng 3.10. Sinh khối tăng trung bình của dòng 54 khi khảo sát hiệu quả

của BA và NAA

44

Bảng 3.11. Sinh khối tăng trung bình của dòng 2 khi khảo sát hiệu quả
của BA và NAA

45

Bảng 3.12. Sinh khối tăng trung bình của dòng 29 khi khảo sát hiệu quả
của BA và NAA

45

Bảng 3.13. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 2 dưới ảnh hưởng
của các nồng độ adenine sulfate

47

Bảng 3.14. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 6 dưới ảnh hưởng
của các nồng độ adenine sulfate

47

Bảng 3.15. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 2 dưới ảnh hưởng
của các nồng độ adenine sulfate

47

Bảng 3.16. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 2 dưới ảnh hưởng

của các nồng độ ABA

50

Bảng 3.17. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 6 dưới ảnh hưởng
của các nồng độ ABA

51

Bảng 3.18. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 2 dưới ảnh hưởng
của các nồng độ ABA

51

Bảng 3.19. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 2 dưới ảnh hưởng
của loại đường và nồng độ đường

53

Bảng 3.20. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 6 dưới ảnh hưởng
của loại đường và nồng độ đường

53

Bảng 3.21. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 29 dưới ảnh hưởng
của loại đường và nồng độ đường

54

Bảng 3.22. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 2 dưới ảnh hưởng
của loại đường và PEG

56

Bảng 3.23. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 6 dưới ảnh hưởng
của loại đường và PEG

56

Bảng 3.24. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 29 dưới ảnh hưởng
của loại đường và PEG

57

Bảng 3.25. Số lượng phôi soma trung bình của dòng 2 dưới ảnh hưởng của than
hoạt tính

59


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ phân bố thông nhựa ở Việt Nam

4

Hình 1.2. Thông nhựa (Pinus merkusii jungh et de Vries)

5

Hình 1.3. Cành mang quả thông nhựa

6

Hình 1.4. Quả thông non xẻ đôi và phôi non tách từ
quả non để nuôi cấy tạo phát sinh phôi

10

Hình 1.5. Tiền phôi thông nhựa

11

Hình 1.6. Hạt nhân tạo và hạt nhân tạo nảy mầm ở địa lan Cymbidium spp.

12

Hình 3.1. Tế bào tiền phôi 1 tuần sau cấy
( với các nồng độ L – glutamine lần lượt là 0, 10, 300, 500 và 700 mg/l)

42

Hình 3.2. Phôi soma trên môi trường có maltose 90 g/l và sucrose 90 g/l

55

Hình 3.3. Thành thục tạo phôi soma trên môi trường LVM bổ sung
than hoạt tính 10 g/l.

DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, viatmin của môi trường LVM
Phụ lục 2. Thống kê kết quả thí nghiệm 1 – Dòng 6
Phụ lục 3. Thống kê kết quả thí nghiệm 1 – Dòng 31
Phụ lục 4. Thống kê kết quả thí nghiệm 1 – Dòng 44
Phụ lục 5. Thống kê kết quả thí nghiệm 1 – Dòng 54
Phụ lục 6. Thống kê kết quả thí nghiệm 1 – Dòng 2
Phụ lục 7. Thống kê kết quả thí nghiệm 1 – Dòng 29
Phụ lục 8. Thống kê kết quả thí nghiệm 2 - Dòng 6
Phụ lục 9. Thống kê kết quả thí nghiệm 2 - Dòng 31
Phụ lục 10. Thống kê kết quả thí nghiệm 2 - Dòng 44
Phụ lục 11. Thống kê kết quả thí nghiệm 2 - Dòng 54
Phụ lục 12. Thống kê kết quả thí nghiệm 2 - Dòng 2
Phụ lục 13. Thống kê kết quả thí nghiệm 2 - Dòng 29
Phụ lục 14. Thống kê kết quả thí nghiệm 3 - Dòng 2
Phụ lục 15. Thống kê kết quả thí nghiệm 3 - Dòng 6
Phụ lục 16. Thống kê kết quả thí nghiệm 3 - Dòng 29
Phụ lục 17. Thống kê kết quả thí nghiệm 4 - Dòng 2
Phụ lục 18. Thống kê kết quả thí nghiệm 4 - Dòng 6
Phụ lục 19. Thống kê kết quả thí nghiệm 4 - Dòng 29
Phụ lục 20. Thống kê kết quả thí nghiệm 5 - Dòng 2 (Maltose)
Phụ lục 21. Thống kê kết quả thí nghiệm 5 - Dòng 2 (Sucrose)
Phụ lục 22. Thống kê kết quả thí nghiệm 5 - Dòng 6 (Maltose)
Phụ lục 23. Thống kê kết quả thí nghiệm 5 - Dòng 6 (Sucrose)
Phụ lục 24. Thống kê kết quả thí nghiệm 5 - Dòng 29 (Maltose)
Phụ lục 25. Thống kê kết quả thí nghiệm 5 - Dòng 29 (Sucrose)
Phụ lục 26. Thống kê kết quả thí nghiệm 6 - Dòng 2 (Maltose)
Phụ lục 27. Thống kê kết quả thí nghiệm 6 - Dòng 2 (Sucrose)

Phụ lục 28. Thống kê kết quả thí nghiệm 6 - Dòng 6 (Maltose)
Phụ lục 29. Thống kê kết quả thí nghiệm 6 - Dòng 6 (Sucrose)
Phụ lục 30. Thống kê kết quả thí nghiệm 6 - Dòng 29 (Maltose)
Phụ lục 31. Thống kê kết quả thí nghiệm 6 - Dòng 29 (Sucrose)
Phụ lục 32. Thống kê kết quả thí nghiệm 7 - Dòng 2
Phụ lục 33. Thống kê kết quả thí nghiệm 7 - Dòng 6
Phụ lục 34. Thống kê kết quả thí nghiệm 7 - Dòng 29


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây thông nhựa (Pinus merkusii jungh et de Vries) là loại cây chịu được đất
nghèo xấu, khô hạn, có thể trồng trên đất nghèo dinh dưỡng. Cây sinh trưởng trên
cả đất cát, đất đỏ, đất nhẹ, dễ thoát nước, đất phong hoá từ đá mẹ sa thạch, sa phiến
thạch. Thông nhựa có thể mọc trên đất đồi núi trọc, cằn cỗi, sỏi đá, nghèo kiệt, khô
hạn, là cây phủ xanh đồi trọc.
Thông nhựa là nguồn cung cấp tùng hương (colophan) và tinh dầu thông
(turpentine oil) chủ yếu. Tinh dầu được sử dụng rộng rãi trong công nghệ hoá mỹ
phẩm, là nguyên liệu để chế terpineol, terpin, borneol, camphor tổng hợp, sản xuất
sơn, véc-ni, xi…. Colophan được dùng nhiều trong công nghiệp cao su, hóa dẻo, vật
liệu cách điện, keo dán, sản xuất các chất tẩy rửa,… đặc biệt là trong công nghiệp
sản xuất giấy. Trong y dược, tinh dầu thông được sử dụng làm thuốc chữa viêm
thấp khớp, ho, làm thuốc kích thích, giảm mệt mỏi, thuốc diệt khuẩn, sát trùng,…
Thông nhựa là nguồn cung cấp nhựa và gỗ có giá trị cao. Các sản phẩm tùng
hương, tinh dầu thông được sử dụng và mua bán trên thị trường thế giới chủ yếu là
từ loài thông nhựa. Diện tích trồng thông nhựa ở nước ta cũng như các nước trong
vùng Đông Nam Á đang ngày càng được mở rộng. Tổng sản lượng nhựa thông các

loại ở Việt Nam còn thấp, hiện mới đạt khoảng 3.500 tấn/năm, trong đó có tới 2/3
dùng để xuất khẩu.
Nhu cầu về tùng hương và tinh dầu thông trên thị trường thế giới ngày càng
tăng, cung không kịp cầu. Thông nhựa lại là đối tượng quan trọng để trồng rừng
trên các diện tích đất trống, đồi núi trọc đã thoái hoá, nghèo kiệt, khô cằn. Cần có
biện pháp bảo tồn các diện tích rừng thông nhựa tự nhiên, đồng thời mở rộng diện
tích trồng mới kết hợp trong chương trình trồng mới 5 triệu hecta rừng. Nhựa thông
là mặt hàng lâm sản ngoài gỗ có nhiều triển vọng ở nước ta.
Để đáp ứng được nhu cầu to lớn đó chúng ta phải tạo ra giống thông có năng
suất, sản lượng nhựa tốt bằng cách ứng dụng công nghệ sinh học tạo giống thông
tốt. Một trong những tiền đề là phải xây dựng được hệ thống tái sinh cây giống in


2

vitro. Ở Việt Nam hiện nay chưa có đề tài nào nghiên cứu về vấn đề này. Do đó, đề
tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố hóa học đến tạo phôi soma thông
nhựa (Pinus merkusii jungh et de Vries) trong điều kiện in vitro” được thực hiện
nhằm mục đích xây dựng được kỹ thuật nhân giống cây thông nhựa thông qua phôi
soma góp phần ứng dụng nhân giống cây ở quy mô công nghiệp.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm được một số yếu tố hóa học có hiệu quả tốt trong tạo phôi vô tính 3 gia đình
thông nhựa trong điều kiện in vitro.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tăng sinh khối tế bào tiền phôi.
- Nghiên cứu thành thục hóa khối tiền phôi và tạo phôi soma.
4. Thời gian thực hiện
Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học của Phân
viện nghiên cứu khoa học Lâm nghiệp Nam bộ từ tháng 8/2010 đến tháng 03/2012.

3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây thông nhựa
1.1.1. Vị trí phân loại:
Cây thông nhựa thuộc:
Giới: Plantae
Ngành: Pinophyta
Lớp: Pinopsida
Bộ: Pinales
Họ: Pinaceae
Chi: Pinus
Loài: P. merkusii jungh et de Vries
Cây thông nhựa còn được gọi với các tên khác như: thông ta, thông hai lá,
thông Sumatra, thông Bắc bộ, thông yên lập, thông hoàng mai…
1.1.2. Phân bố:
Thông nhựa (Pinus merkusii jungh et de Vries) có phân bố trải rộng theo
phía Nam đường xích đạo và là cây đặc hữu của vùng khí hậu nhiệt đới Đông Nam
Á: Trung Quốc (đảo Hải Nam), Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia, Myanma,
Indonesia và Philippine. Ở Việt Nam, thông nhựa phân bố nhiều ở các tỉnh miền
Trung (Hà Tĩnh, Nghệ An, Quảng Bình, Quảng Trị) và một số tỉnh Đông Bắc bộ
(Quảng Ninh, Vĩnh Phú) và ở miền Nam (Kon Tum, Lâm Đồng). Thông nhựa vùng
thấp gặp ở các tỉnh Bắc bộ và Bắc Trung bộ ở độ cao thấp (dưới 200 m). Thông
nhựa vùng cao (hình tròn) gặp ở các tỉnh Tây Nguyên và thỉnh thoảng ở Tây Bắc,
Tây Bắc Trung bộ. Độ cao thường gặp từ 200 m đến 1200 m.
Theo số liệu báo cáo của Bộ NN&PTNT (năm 2005) tổng diện tích rừng thông toàn
quốc khoảng 194.721 ha, trong đó diện tích thông nhựa khoảng 90.000 ha, phân bố
thành những vùng rộng hay những nhóm nhỏ ở nhiều tỉnh của Việt Nam chủ yếu
tập trung ở hai tỉnh Kon Tum và Lâm Đồng, miền Trung (Hà Tĩnh, Nghệ An,

Quảng Bình, Quảng Trị) và một số ở các tỉnh Đông Bắc Bộ như Quảng Ninh, Vĩnh
Phú.


4

Hình 1.1. Sơ đồ phân bố thông nhựa ở Việt Nam
1.1.3. Đặc điểm
Thông nhựa thuộc loại cây gỗ lớn, cao 20 – 25 (-35) m, có thể cao đến 70m,
chiều cao dưới cành 15 - 20 (-25) m, đường kính thân có thể đạt đến 1,5 – 1,6 m.
Trong thân chứa nhiều nhựa có mùi hắc. Vỏ dày màu nâu xám ở phía gốc, màu đỏ
nhạt ở phía trên, thường nứt dọc sâu. Những cành lớn ở phía dưới thường gần nằm
ngang nhưng những cành ở phía trên mọc chếch. Lá hình kim, họp thành từng đôi,
dài 15 – 25 cm, mảnh, thô, cứng, màu xanh thẫm, gốc lá hình ống, có bẹ dài 1 – 2
cm, sống dai. Mặt cắt ngang lá có 2 - 3 ống nhựa ở giữa hoặc ở phía trong thịt lá.
Nón mọc đơn độc hoặc thành từng đôi, hình trứng thuôn, dài 5 - 11 cm, gần
như không cuống. Vẩy ở quả nón non năm thứ nhất không có gai, đến năm thứ hai
quả nón có dạng hình trứng thuôn hoặc hình trụ. Mặt vẩy hình thoi, cạnh sắc, mép


5

trên dày và hơi lồi, phía dưới dẹt, có 2 gờ ngang và dọc đi qua giữa. Hạt nhỏ, hình
trái xoan hơi dẹt, phẳng, có cánh mỏng dài 1,5 - 2,5 cm.

Hình 1.2. Thông nhựa (Pinus merkusii jungh et de Vries)
( />

6

Hình 1.3. Cành mang quả thông nhựa
( />Một trong những loài cây lá kim quan trọng nhất dùng để trồng rừng trên thế
giới, thông nhựa có khả năng phát triển trên những vùng đất nhiều sỏi, khô cằn, đất
bạc màu, đất nghèo dinh dưỡng. Thông nhựa là loài cây nhiệt đới nên chịu được khí
hậu nóng, khí hậu gần biển, khô hạn, pH thích hợp là 4,5 – 5, cây ưa sáng hoàn
toàn.
Bên cạnh những ưu thế về khả năng sinh trưởng, thông nhựa chịu sự tấn
công của dịch hại: Mycosphaeralla pini, côn trùng: Miliona basalis, Pineus pini
1.1.4. Giá trị kinh tế của thông nhựa
Thông nhựa (Pinus merkusii jungh et de Vries) là một loài cây rừng chủ yếu
ở nước ta. Có ý nghĩa quan trọng trong phủ xanh đất trống đồi trọc, tái tạo diện tích
rừng, chắn gió và cát, chống xói mòn cải tạo đất, chống cháy và bảo vệ môi trường
sinh thái. Thông thanh lọc không khí giúp cho người bệnh điều dưỡng, phục hồi
sức khỏe nên được trồng làm cây phong cảnh cho các khu vực nghỉ mát, an dưỡng,
danh lam thắng cảnh...(Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, nhóm tác giả, 2002).
Thân cây chứa nhiều nhựa, là sản phẩm chủ yếu có giá trị kinh tế cao.
Trong nhựa thông, colophan (tùng hương) chiếm tỷ lệ lớn nhất (60 - 80%), tiếp đến
là tinh dầu (16 - 35%). Thành phần chính của colophan là các acid nhựa: acid
palustric (38%), acid isopimaric (15%), acid abietic (16%), acid merkusic (10%),
acid sandaracopimaric (10%), acid denhydro - abietic (8%), acid neo - abietic (3%).
Tinh dầu thông là một hỗn hợp phức tạp, trong đó chủ yếu là các hợp chất terpen


7

hydrocarbon, nhiều nhất là các nhóm chất α-pinen + β-pinen (65 - 70%), δ-3-caren
(10 - 18%), camphor (2 - 3%), limonen (4 - 6%), myrcen và longifolen…Nhựa
thông có giá trị cao, cung cấp cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu, cần thiết cho
các ngành công nghiệp như dệt, sơn, giấy, thuộc da, mực in, dược, kĩ nghệ hương
liệu, chất dẻo, bảo vệ thực vật, nước hoa… Theo số liệu của tổ chức FAO (năm

1994) sản lượng nhựa thông thế giới đạt khoảng 1,2 triệu tấn, trong đó khoảng 60%
là colophan và 35% tinh dầu thông. Ngoài ra, gỗ thông nặng, có vòng tăng trưởng
hẹp, mịn, vân rõ, được sử dụng trong xây dựng, đồ mộc gia dụng, công nghệ giấy,
bao bì…
1.2. Phôi vô tính
1.2.1. Giới thiệu về phôi vô tính
1.2.1.1. Định nghĩa
Phôi vô tính, còn gọi là phôi soma hay phôi sinh dưỡng, phôi thể hệ, ở cây
có múi còn gọi là phôi nucellar hay phôi tâm. Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh
dưỡng hay phôi thể hệ đều là cùng một khái niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực
bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới những điều kiện thích hợp thì có thể
phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh.
1.2.1.2. Đặc điểm
Phôi vô tính do những tế bào sinh dưỡng biệt hóa thành phôi và trải qua
những giai đoạn phát triển tương tự như phôi hữu tính. Có thể nhân sinh khối phôi
vô tính bằng phương pháp nuôi cấy thích hợp. Bên cạnh đó, phôi vô tính chứa một
lượng chất dinh dưỡng tương tự với nội nhũ phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và chồi
đỉnh, nên có thể trực tiếp nảy mầm thành cây.
Các tế bào có khả năng sinh phôi, giống như các tế bào của mô phân sinh có
các đặc tính cơ bản sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến
dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, thể tích không bào
giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt là các
tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng lưới
nội chất nhỏ. Các tế bào có khả năng sinh phôi được phân biệt rõ ràng với các tế


8

bào không có khả năng sinh phôi dựa trên những đặc tính trên. (Dương Tấn Nhựt,
2007); (Bùi Trang Việt, 2000).

Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lí nhưng không có
quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ tinh
giữa giao tử đực vả giao tử cái. Về nguyên tắc, tất cả những cây con được tái sinh
bằng con đường này thì đều có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng
cha mẹ, nếu tế bào này được chuyển gen thì các cây tái sinh là cây chuyển gen
(Nguyễn Văn Uyển, 1992).
Phôi vô tính có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh mang đầy đủ những
đặc tính di truyền và những tính trạng sinh học khác của cây mẹ, không mang theo
các bệnh virus mà cây mẹ mắc phải. Do vậy, cây tạo từ phôi vô tính gần như sạch
bệnh hoàn toàn.
1.2.1.3. Sự phát sinh phôi vô tính
Phát sinh phôi vô tính là kiểu mẫu của tính toàn thế, có thể khảo sát toàn bộ
quá trình biệt hóa của tế bào cũng như cơ chế biểu hiện tính toàn năng của tế bào
thực vật. Sự hình thành phôi vô tính được coi như là một con đường phát triển riêng
biệt, khác hẳn với con đường phát sinh cơ quan chồi và rễ. Trong đó, một tế bào sẽ
phát triển thành một cấu trúc có mô phân sinh chồi và rễ đầy đủ và không có kết nối
với hệ thống mao mạch của mô mẹ ban đầu. Sự tạo phôi vô tính là một quá trình
nguyên vẹn và vì vậy sự phát sinh chồi chỉ là một biến đổi của quá trình cảm ứng và
phát triển của phôi. Với quan niệm như trên thì sự tạo phôi có thể được coi như là
kết quả của một chuỗi các sự kiện phát sinh cơ quan cạnh tranh nhau (Brown và
cộng sự, 1995).[Dương Tấn Nhựt, 2007]
Không như những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính toàn thế của tế bào
không chỉ có ở các tế bào của phôi hợp tử mà các tế bào sinh dưỡng cũng có mang
tính toàn thế. Sự linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt hóa
hoàn toàn vẫn có thể trở về giai đoạn sinh phôi dưới những điều kiện nhất định. Sự
lặp lại toàn bộ chương trình phát sinh cơ thể thông qua việc khởi đầu sự tạo phôi đòi
hỏi sự tái thiết lập biểu hiện của những gen cần thiết. Sau khi đã hoàn toàn thoát


9

khỏi chức năng trước đó của các tế bào đã biệt hóa, các tế bào sinh dưỡng mang
tính toàn thế dưới tác động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng thái biến
dưỡng tương tự như tế bào trứng đã thụ tinh (Dénes và cộng sự, 1995).
Williams và Maheswaran (1986) đã cho rằng phôi vô tính có thể được hình
thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào. Thông qua một quá trình phân
chia có thứ tự, ở phôi sẽ diễn ra sự biệt hóa, trưởng thành và phát triển thành cây
con. Cây có thể phát triển từ một hay từ một cụm tế bào phôi.
Sự sinh phôi từ một tế bào soma được định nghĩa là một quá trình mà trong
đó một hay vài tế bào soma, trong các điều kiện thực nghiệm, có thể tham gia vào
sự phân chia theo một trật tự nhất định để cho một phôi, theo kiểu giống hay gần
giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Các giai đoạn tạo phôi vô tính: cảm ứng tạo phát sinh phôi, tăng sinh khối,
tạo phôi và nảy mầm. Trong giai đoạn tạo phôi và nảy mầm, phôi chia làm ba giai
đoạn nhỏ: hình cầu (phôi nhỏ, hình tròn, tụ lại thành cụm), hình tim (chuẩn bị cho
sự phát triển lá mầm), hình thủy lôi (thuôn dài, có rãnh, có những tế bào cần thiết
cho sự phát triển mô phân sinh rễ).
Sự hình thành phôi vô tính thông qua hai con đường: phôi phát sinh trực tiếp
không thông qua giai đoạn tạo mô sẹo và hình thành tế bào phôi vô tính gián tiếp
thông qua mô sẹo (Quiroz-Figueroa và cs, 2006). Mẫu cấy có thể là thân, lá, lá
mầm, rễ hay nội nhũ, nhân. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, những tế bào ở những
mô liên quan đến quá trình sinh sản như hạt phấn, chồi mầm hay những tế bào còn
non có khả năng tạo phôi vô tính cao hơn những tế bào ở những mô trưởng thành.
Trong con đường hình thành phôi vô tính trực tiếp không thông qua mô sẹo,
tế bào ở giai đoạn trước khi hình thành tế bào phôi vô tính gọi là tế bào tiền phôi
(pre-embryogenic determined cell – PEDC). Các tế bào tiền phôi này trải qua các
giai đoạn và hình thành tế bào phôi vô tính trực tiếp. Với con đường tạo phôi trực
tiếp, có thể tạo phôi vô tính từ những tế bào biểu bì của lá và trụ dưới lá mầm, mẫu
rễ, cành non, chồi; phôi hữu tính; protoplast (Coste và cộng sự, 2011). Mẫu cấy
được đưa vào môi trường dinh dưỡng thích hợp, sau đó hình thành những tế bào

10

phôi từ một tế bào hay một nhóm nhiều tế bào. Tiếp theo là giai đoạn trưởng thành,
nảy mầm và cuối cùng tạo cây hoàn chỉnh.
Với con đường tạo phôi gián tiếp, mẫu cấy được đưa vào môi trường tạo mô
sẹo, những mô sẹo này hình thành những tế bào có khả năng phát sinh phôi
(induced embryogenic determined cell – IEDC). Sau đó, tương tự như việc tạo phôi
trực tiếp, những tế bào phôi này trưởng thành, nảy mầm và tạo cây hoàn chỉnh.
Phương pháp này được dùng rất phổ biến trong tạo phôi vô tính ở thực vật. Nồng độ
chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện nuôi cấy rất cần thiết cho sự tạo thành mô
sẹo và quyết định những tế bào này bước vào con đường phát sinh phôi.
Đối với con đường tạo phôi trực tiếp, việc tái lập trình ảnh hưởng không
đáng kể nhưng với con đường tạo phôi gián tiếp, tế bào cần tái lập trình để tái biệt
hóa hình thành tế bào phôi (Quiroz-Figueroa và cs, 2006). Hai sự kiện quan trọng
quyết định liên quan đến chương trình sớm của quá trình phát triển: cảm ứng biệt
hóa tế bào của những tế bào tiền phôi: cần sự có mặt của auxin (tăng sinh khối tế
bào tiền phôi) và biểu hiện trình tự phát triển ở các tế bào tiền phôi: phải giảm thấp
hay không có auxin, nếu tiếp tục sử dụng có thể ngăn cản sự tạo phôi. Do đó, hai
loại môi trường cần thiết trong nuôi cấy phôi là môi trường cần cho sự phát sinh tế
bào phôi và môi trường để những tế bào này phát triển thành những tế bào có khả
năng tạo phôi.

1


11

2

Hình 1.4. Quả thông non xẻ đôi (1) và phôi non tách từ quả non (2) để nuôi cấy
tạo phát sinh phôi. ((Phân Viện NCKH Lâm nghiệp Nam bộ).

1

4

2

3

Hình 1.5. Tiền phôi thông nhựa (Phân Viện NCKH Lâm nghiệp Nam bộ)
1 & 2: tạo phát sinh phôi từ phôi non.
3 & 4: nhân nhanh khối sinh khối tiền phôi (embryogenic tissue).


12

1.2.1.4. Ứng dụng của phôi vô tính
Kỹ thuật nhân giống in vitro dựa trên việc tạo phôi vô tính cho phép
sản xuất những cây trồng với đặc điểm di truyền xác định và sạch bệnh (Traore và
cs, 2006). Phương pháp nhân giống bằng phôi vô tính cho hệ số nhân giống cao.
Các mô và tế bào sinh dưỡng nuôi cấy in vitro có thể tạo phôi vô tính một cách trực
tiếp hoặc thông qua giai đoạn trung gian là mô sẹo. Tế bào mô sẹo có thể phân chia
theo cấp số nhân và khi phân hóa thành phôi vô tính sẽ tạo ra số lượng lớn phôi vô
tính khổng lồ trong thời gian ngắn. Ở cây cà phê, có thể tạo được khoảng 600.000
phôi vô tính từ một gram sinh khối ban đầu trong vài tháng với tỷ lệ tái sinh từ phôi
vô tính đạt 47% (Ducos và cs, 1993). Khả năng công nghiệp hóa và tự động hóa quy
trình nhân giống quy mô lớn, đặc biệt là ứng dụng phương tiện bioreactor. Bên cạnh
đó, quá trình tạo phôi vô tính được điều khiển nên cho phép thu phôi ở những giai

đoạn đặc biệt phục vụ cho những mục đích nghiên cứu khác.

a


13

b
Hình 1.6. hạt nhân tạo (a) và hạt nhân tạo nảy mầm (b) ở địa lan
Cymbidium spp.
( />/Default.aspx )
Phôi vô tính do đồng nhất về mặt di truyền, có thể phát triển thành cây hoàn
chỉnh nên được xem là một công cụ hữu ích cho các nghiên cứu chuyển gen. Ngoài
ra có thể bảo tồn giống lâu dài bằng phương pháp trữ đông. Phôi vô tính có thể nảy
mầm và phát triển thành cây nên kỹ thuật hạt nhân tạo được nghiên cứu và ứng
dụng thành công ở nhiều nước. Hạt nhân tạo có thể bảo quản và lưu giữ dài hạn.
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo phôi vô tính
Các tế bào sinh dưỡng dưới ảnh hưởng của nhiều điều kiện hình thành những
tế bào phôi, những tế bào này qua hàng loạt biến đổi về hình thái, sinh hóa cuối
cùng hình thành phôi vô tính. Quá trình tạo phôi vô tính trải qua ba giai đoạn chủ
yếu nên các yếu tố ảnh hưởng tùy từng giai đoạn phát triển của phôi.
1.2.2.1. Giai đoạn cảm ứng tạo phát sinh phôi
Đây là bước đầu tiên trong quá trình hình thành phôi vô tính từ vật liệu ban
đầu. Giai đoạn này chủ yếu phụ thuộc vào tuổi mẫu cấy, kiểu gen cây mẹ (Li và