NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG đẠM THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) đỂ NUÔI CẤY VI SINH VẬT

BỘ G
I
Á
O DỤC VÀ
đÀO
T
Ạ
O
TRƯỜNG
đẠI
HỌC CẦN
T
H
Ơ
KHOA KHOA HỌC -
V
I
ỆN NC&PT CÔNG NGHỆ
S
I
N
H

H
ỌC
ee
LUẬN VĂN TỐT NG
H
I
Ệ
P

đẠI
H
ỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ
S
I
N
H

H
ỌC
NG
H
I
ÊN
CỨU ỨNG DỤNG
đẠM
THỦY
P
H
Â
N
TỪ TRÙN QUẾ
(
P
e
r
i
o

nyx

e
x
c
a
v
a
t
u
s
)
đỂ
NUÔ
I
CẤY
VI
S
I
N
H

VẬ
T
C
Á
N

BỘ

H

Ư

Ớ
NG

D ẪN:
S
I
N
H

V
I
ÊN THỰC
H
I
ỆN
Ths. PHAN
THỊ BÍCH
T
R
Â
M
CN.
NGUYỄN THỊ XUÂN DUNG N
g
uy

ễ
n Thị Xuân Thanh
V
i
ệ
n NC và PT
Công Nghệ
S
i
nh Học Lớp
Công Nghệ
S
i
nh Học
T
r
ư
ờ
n
g

đ
ạ
i
Học Cần Thơ Khóa 31
Cần Thơ, Năm
2009
MỤC LỤC
DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH
Ả

NH
TÓM
LƯỢC
......................................................................................................1
PHẦN
I:
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................2
PHẦN
II:
L
Ư
Ợ
C
KHẢO TÀI LIỆU...................................................................3
I. TRÙN QUẾ ...............................................................................................3
1. Vị trí phân
loại
...........................................................................................3
2. Đặc tính sinh
học
.......................................................................................3
3. Đặc tính sinh
lý
..........................................................................................4
4. Công dụng của trùn quế..............................................................................5
II. VI SINH VẬT............................................................................................5
1. Dinh
dưỡng
của vi sinh vật.........................................................................5
a.

Nguồn carbon
và
năng
l
ư
ợ
ng
.....................................................................7 b.
Nguồn
Nitrogen .........................................................................................7 c.
Nguồn
khoáng
............................................................................................8 d.
Các yếu tố
sinh trưởng
...............................................................................8
2. Các yếu tố lý, hóa học
ảnh hưởng
lên vi sinh
v
ậ
t
........................................10
a. Ảnh
hưởng
của
nhiệt độ
.............................................................................10
b. Ảnh
hưởng

của
oxi
.....................................................................................10
c. Ảnh
hưởng
của
ẩm độ
................................................................................11
d. Ảnh
hưởng
của ánh sáng ............................................................................11 e.
Ảnh
hưởng
của
pH
.....................................................................................11 f.
Ảnh
hưởng
của áp suất thẩm thấu...............................................................12
3. Các giai
đoạn
phát triển của vi sinh
vật
......................................................13
a. Giai
đoạn chậm
..........................................................................................13 b.
Giai
đoạn
log..............................................................................................13 c.

Giai
đoạn
quân bình ...................................................................................13 d.
Giai
đoạn chết
............................................................................................14
4.
Cách đo sự tăng trưởng
của vi sinh
v
ậ
t
.......................................................14
a. Đếm trực
tiếp
.............................................................................................14
b.
Phương pháp gián
tiếp................................................................................14
III. TÌNH HÌNH NGHIÊN
C
Ứ
U
TRONG VÀ
NGO
ÀI
NƯỚC NHÓM
ENZYME PROTEASE .................................................................................15
1.
Trong nước

................................................................................................15
2.
Ngoài nước
................................................................................................16
PHẦN III
:
PHƯƠNG
TIỆN
PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU .........................18
I.
PHƯƠNG
TIỆN NGHIÊN CỨU ..................................................................18
1. Nguyên liệu................................................................................................18
2. Thiết bị và dụng cụ.....................................................................................18
3. Hóa chất ....................................................................................................18
II.
PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................19
1. Chuẩn bị
mẫu
và xác định thành
phần đạm
nguyên
liệu
.............................19
a. Chuẩn bị
m
ẫ
u

.............................................................................................19
b. Xác định thành
phần đạm
nguyên
li
ệ
u
........................................................19
2. Sử dụng sản
phẩm
thủy phân của trùn quế
để
nuôi vi sinh
vật
....................20
a. Thí nghiệm 1: xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp
cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH
5

..........................................20
b. Thí nghiệm 2: theo dõi sự phát trển của vi khuẩn E. Coli DH
5

theo
thời
gian...............................................................................................................20
c. Thí nghiệm 3: xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi
trường YEB nuôi cấy Saccharomyces
cerevisiae
...........................................21

d. Thí nghiệm 4: Theo dõi sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae theo thời
gian...............................................................................................................22
PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................23
1. Thành
phần đạm
nguyên
liệu
........................................................................23
2. Sử dụng sản
phẩm
thủy phân của trùn quế
để
nuôi vi sinh
v
ậ
t
.......................23
a. Kết quả xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi
trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH
5

.......................................................23
b. Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH
5

theo thời
gian
.....24
c. Kết quả xác định lượng đạm amin từ trùn quế thay thế pepton thích hợp cho
môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae .....................27

d. Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae theo
thời gian .......................................................................................................28
3. Hiệu quả kinh tế giữa
bột đạm
từ trùn quế và bột pepton Hà
Lan
..................31
PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ
NGH
Ị
...............................................................33
I. Kết
luận
........................................................................................................33
II. Đề nghị .........................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM
KH
Ả
O
PHỤ
L
Ụ
C
DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
Danh sách bảng
Bảng 1: Nguồn và vai trò của các nguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn.................6
Bảng 2:
Nguồn
carbon và
nguồn năng lượng

cần thiết ở một số nhóm vi sinh vật....7
Bảng 3: Một số vitamin và vai trò của chúng trong
hoạt động
tế bào .......................9
Bảng 4: Kết quả
đo protein
và
đạm
amin của dịch
đạm
thủy phân và
pepton
...........23
Bảng 5: Kết quả
đo
độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy E.
coli DH
5

..............................................................................................................24
Bảng 6: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy
Saccharomyces cerevisiae .......................................................................................28
Bảng
7: Giá
thành
1 lít
môi trường
LB.....................................................................31
Bảng
8: Giá

thành
1 lít
môi trường
YEB
..................................................................32
Danh sách hình ảnh
Hình 1. Trùn
quế
.....................................................................................................3
Hình 2. Môi
trường lỏng trước
và sau khi nuôi vi khuẩn E. coli DH
5

16
gi
ờ
........24
Hình 3. Sự
tăng trưởng
của vi khuẩn E. coli DH
5


trên
hai môi
trường
đạm pepton
và
đạm

trùn quế thủy phân theo thời gian ................................................................25
Hình 4. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5X sau 16
gi
ờ
.............................................26
Hình 5. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH
5

sau 24 giờ .............................................26
Hình 6. Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH
5

sau 36 giờ .............................................27
Hình 7. Môi
trường trước
và sau khi nuôi Saccharomyces cerevisiae 24 giờ..........28
Hình 8. Sự
tăng trưởng
của nấm men Saccharomyces cerevisiae trên 2 môi
trư
ờ
ng
đạm pepton
và
đạm
thủy phân trùn quế theo thời gian .............................................29
Hình 9. Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae sau
24giờ
..........................................30
Hình 10. Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisia sau 36

gi
ờ
.........................................30
1
TÓM
L
ƯỢ
C
Đề tài được thực hiện nhằm mở ra một hướng ứng dụng mới của sản phẩm tự
thủy phân từ trùn quế. Sản phẩm được thử nghiệm thay thế nguồn đạm pepton ở
các mức độ 0, 25, 50, 75 và 100% trên hai môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn
Escherichia coli DH 5 và môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces
cerevisiae.
Kết quả cho thấy, với cùng một lượng đạm amin bổ sung vào môi trường nuôi
cấy, nghiệm thức thay thế hoàn toàn đạm trùn quế 100% đạt kết quả cao nhất trên
cả hai chủng vi sinh vật. Đồ thị tăng trưởng theo thời gian trên hai môi trường
đạm thủy phân từ trùn quế 100% và đạm pepton Hà Lan 100% tương tự nhau. Ở
giai đoạn log, cả hai môi trường LB và YEB dịch đạm trùn quế thủy phân được
thay thế 100% sự tăng sinh khối từ bằng đến cao hơn so với nuôi cấy trên môi
trường chứa đạm pepton và đạt đến OD
600nm
cao nhất sau 18 giờ tăng trưởng.
Trên môi trường thạch, với thành phần đầy đủ chất dinh dưỡng trong dịch đạm
thủy phân trùn quế cũng đã cho kích thước khuẩn lạc lớn hơn khi nuôi cấy trên
môi trường chứa đạm pepton.
Giá thành 1 lít môi trường nuôi cấy chứa đạm trùn quế thủy phân giảm một nửa
so với dùng đạm pepton Hà Lan. Vì thế việc sử dụng nguồn đạm thủy phân từ
trùn quế để thay thế bột pepton mang lại hiệu quả kinh tế đồng thời nâng cao giá
trị thương phẩm của loài trùn đất đang được nuôi công nghiệp hiện nay.
2

PHẦN I: ĐẶT VẤN
ĐỀ
Ngày nay vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong đời sống hàng ngày, từ
các ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, nông nghiệp chế tạo phân bón sinh
học đến sản xuất các enzyme thông dụng, vacxin phòng bệnh, kháng sinh và các
dược phẩm quan trọng. Đặc biệt trong bảo vệ môi trường người ta đã sử dụng vi
sinh vật làm sạch môi trường, xử lý các chất thải độc hại. Trong đó nhu cầu về
dinh dưỡng cho chúng như các nguồn carbon, nitơ, khoáng chất…là rất cao. Đặc
biệt chúng chỉ sử dụng các nguồn thức ăn đơn giản như glucose, đường đôi, acid
amin và pepton mạch ngắn để giúp cho sự phát triển và tăng sinh khối tế bào,
trong số đó nguồn đạm pepton có giá thành khá cao từ 1.000.000-3.000.000
đồng/1kg.
Hiện nay, trùn quế đã được nuôi rất phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu
Long và các vùng lân cận Thành phố Hồ Chí Minh.

(chiếm
-
việc tận dụng hệ
, 2006). Do
vậy,
tôm sú (Phạm Thị Quỳnh Trâm, 2008). Nhằm làm phong phú hơn cho sản phẩm
tự phân giải từ trùn quế, dịch đạm từ trùn quế do có khá đầy đủ các acid amin cần
thiết nên việc sử dụng chúng làm nguồn đạm thay thế pepton trong môi trường
nuôi cấy một số chủng vi sinh vật thông dụng là điều có thể.
Với lý do đó chúng tôi đã thực hiện đề tài “
Nghiên cứu ứng dụng nguồn
đạm
thủy phân từ trùn quế
(Perionyx excavatus )
để nuôi cấy

vi
sinh
vật”
Mục tiêu của đề tài: So sánh hiệu quả sử dụng giữa nguồn đạm thủy phân từ trùn
quế với peptone thương mại hiện đang sử dụng trong nuôi cấy các chủng vi
khuẩn và nấm men phổ biến.
PHẦN II:
L
ƯỢ
C
KHÁO TÀI
L
I
Ệ
U
I. Trùn
qu
ế
1. Vị trí
phân
loại
Trùn quế thuộc:
Ngành: Giun đốt (Annelida).
Ngành phụ: Có đai sinh dục (Clillata).
Lớp: Giun ít tơ (Oligochaeta).
Họ: Megascolecidae.
Tên khoa học: Perionyx excavatus
2.
Đặc tính sinh
họ

c
Trùn quế có kích thước tương đối nhỏ, độ dài vào khoảng 10 –15 cm, thân hơi
dẹt, bề ngang của con trưởng thành có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, có màu từ đỏ đến
màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Cơ
thể trùn có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ.
Khi di chuyển, các đốt co duỗi kết hợp các lông tơ phía bên dưới các đốt bám vào
cơ chất, đẩy cơ thể di chuyển một cách dễ dàng.
Hình
1: Trùn
qu
ế
Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu Oxy và thải CO
2
trong môi
trường nước, điều này giúp cho chúng có khả năng sống trong nước nhiều lần,
thậm chí trong nhiều tháng.
Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm cho
việc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng ammoniac và urea. Trùn quế nuốt
thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày được nhiều nhà khoa học
ghi nhận là tương đương với trọng lượng cơ thể của nó. Sau khi qua hệ thống tiêu
hóa với nhiều vi sinh vật cộng sinh, phân được thải ra ngoài rất giàu dinh dưỡng
(hệ số chuyển hóa ở đây vào khoảng 0,7), những vi sinh vật cộng sinh có ích
trong hệ thống tiêu hóa này theo phân ra khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn hoạt
động ở “màng dinh dưỡng” trong một thời gian dài. Đây là một trong những
nguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao và có hiệu quả cải
tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường
3.
Đặc tính sinh
lý
Trùn quế rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độ

nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn. Nhiệt độ thích hợp nhất với Trùn quế
nằm trong khoảng từ 20 – 30
o
C, ở nhiệt độ khoảng 30
o
C và độ ẩm thích hợp,
chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh. Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng
hoạt động và có thể chết, hoặc khi nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đi
hoặc chết. Chúng có thể chết khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng
lại có thể tồn tại trong môi trường nước có thổi Oxy.
Trùn quế rất thích sống trong môi trường ẩm ướt và có độ pH ổn định, thích hợp
nhất vào khỏang 7,0 – 7,5, nhưng chúng có khả năng chịu đựng được phổ pH khá
rộng, từ 4 – 9, nếu pH quá thấp, chúng sẽ bỏ đi.
Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ
nào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm…).
Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn,
giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn.
Trong tự nhiên, Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rãnh, hoặc nơi có
nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy và thối rữa như trong các đống phân động vật, các
đống rác hoai mục. Chúng rất ít hiện diện trên các đồng ruộng canh tác dù nơi
đây có nhiều chất thải hữu cơ, có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất thải này thường
cao, không hấp dẫn và không đảm bảo điều kiện ẩm độ thường xuyên.
(Nguồn: )
4.
Công dụng của trùn qu
ế
Trùn quế dễ nuôi, chóng lớn và có tốc độ sinh sản nhanh. Hiện nay nuôi trùn quế
đã trở thành ngành chăn nuôi công nghiệp phục vụ cho trồng trọt, chăn nuôi,
dược phẩm, mỹ phẩm…
Trùn quế có hàm lượng đạm cao nên được xem là nguồn dinh dưỡng bổ sung quý

giá cho gia súc, gia cầm và thuỷ hải sản.
Trùn quế còn là nhà máy xử lý chất thải nông nghiệp và công nghiệp góp phần
bảo vệ môi trường sinh thái. Quá trình xử lý chất thải đó đã tạo ra một loại phân
hữu cơ vi sinh giàu đạm thích hợp cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là cây cảnh
và sản xuất rau sạch. Ngày nay người ta còn sử dụng phân trùn để xử lý ao tôm,
cá.
Trong y học cổ truyền Việt Nam, trùn vẫn được dùng trong một số bài thuốc
chữa sốt rét, sốt nóng, suy nhược cơ thể, cao huyết áp, tai biến mạch máu não…
Trùn quế còn chứa enzyme có thể thuỷ phân đặc hiệu sỏi fibrin với hoạt tính xúc
tác rất cao, có triển vọng khai thác để làm thuốc điều trị những căn bệnh đột quỵ,
tim mạch. Một số nơi còn sử dụng trùn quế làm thực phẩm, mỹ phẩm và thuốc
tây. (Nguồn: www . trunque . ne t )
II. Vi
sinh
vật
1.
Dinh dưỡng của
vi
sinh
vật
Để tăng trưởng, mỗi vi sinh vật phải tìm trong môi trường các chất dinh dưỡng
cần thiết cho sự tổng hợp các cấu tử tế bào cũng như nguồn năng lượng để hoạt
động. Các nguyên tố cần thiết chính gồm C, H, O, N, S, P, K, Mg, Fe, Ca, Mn và
các nguyên tố vi lượng như Zn, Cu, Co, Mo. Các nguyên tố này có trong nước,
các ion vô cơ, những phân tử nhỏ hay các đại phân tử. Nguồn và vai trò của các
nguyên tố chính trong tế bào vi khuẩn được trình bày trong bảng 1.
Bảng
1:
Nguồn và vai trò của các nguyên tố chính
t

r
on
g

tế bào
vi khuẩn.
Nguyên
t
ố
%
(theo t
r
ọn
g
lượng
k
h
ô)
Nguồn Vai trò
Carbon 50
CO
2
hay các hợp
chất hữu cơ
Thành phần chính trong vật liệu
tế bào
Oxygen 20 H
2
O, CO
2

, O
2
, các
hợp chất hữu cơ
Thành phần chính trong vật liệu
tế bào, nước trong tế bào và là
chất nhận điện tử trong phản ứng
hô hấp hiếu khí
Nitrogen 14 NH
3
, NO
3
-
, N
2
,
hợp chất hữu cơ
Thành phần của acid amin, acid
nhân, nucleotide và coenzyme
Hydrogen 8
H
2
O, H
2
, hợp chất
hữu cơ
Thành phần chính của các hợp
chất hữu cơ và nứơc trong tế bào
Phospho 3 Phosphate vô cơ Thành phần cấu tạo acid nhân,
nucleotid, phospholipid, acid

teichoic
Sulfur 1 SO
2
, H
2
S, SO,
hợp chất sulfur
hữu cơ
Thành phần của Cystein,
methionin, glutathion, nhiều
coenzyme
Potassium 1 Muối potassium Cation vô cơ của tế bào và
cofactor của một số enzyme
Magnesium 0,5 Muối
maggnesium
Cation vô cơ của tế bào và
cofactor của một số enzyme
khác
Calcium 0,5 Muối calcium Cation vô cơ của tế bào và
cofactor của một số enzyme và
cấu tử của nội bào tử
Sắt 0,2 Muối sắt Cấu tử của cytochrom và protein
có sắt và là cofactor cho một số
phản ứng có enzyme xúc tác.
(Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)
.
a.
Nguồn carbon
và
năng

lư
ợ
n
g
Vi sinh vật cần nguồn carbon thích hợp để tạo nên các cấu tử của tế bào cũng
như cung cấp năng lượng cho tế bào. Tuỳ theo nguồn carbon sử dụng mà người
ta chia vi sinh vật thành các nhóm như vi sinh vật quang tự dưỡng, quang dị
dưỡng, hoá tự dưỡng, hoá dị dưỡng. Nguồn carbon cung cấp năng lượng và tổng
hợp chất hữu cơ tế bào được trình bày trong bảng 2:
Bảng
2:
Nguồn carbon
và
nguồn năng lượng cần thiết
ở
một số nhóm
vi
sinh
vật
Loại vi
sinh
vật
Nguồn carbon cung
cấ
p
năng lượng tế
b
à
o
Nguồn carbon để

t
ổn
g
hợp các cấu tử tế
b
à
o
Vi sinh vật quang tự
dưỡng
Ánh sáng
CO
2
Vi sinh vật quang dị
dưỡng
Ánh sáng Hợp chất hữu cơ
Vi sinh vật hoá tự dưỡng
Hợp chất vô cơ, H
2
, NH
3
,
NO
2
-
, Fe
2+
, H
2
S
CO

2
Vi sinh vật hoá dị dưỡng Hợp chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ
Vi sinh vật hoá dị dưỡng
Hợp chất vô cơ, H
2
, NH
3
,
NO
2
-
, Fe
2+
, H
2
S
Hợp chất hữu cơ
(Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)
Nguồn carbon hữu cơ cần thiết cho các vi sinh vật hoá dị dưỡng rất đa dạng từ
các loại đường đơn như glucose, fructose, sucrose, tinh bột, glycogen, cellulose, và
acid nucleic đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như dầu mỏ, nhựa dẻo (plastic),
naphthalen, lipid và protein. Tùy theo loài vi sinh vật mà nguồn carbon thích hợp
thay đổi. Ví dụ, các loài vi khuẩn Pseudomonas có thể sử dụng đến 90 nguồn
carbon khác nhau, mỗi loài có thể sử dụng một số nguồn carbon khác nhau. Cũng
có loài vi khuẩn rất chuyên biệt như vi khuẩn Bacillus fastidiousus chỉ có thể sử
dụng urea làm nguồn carbon và nguồn năng lượng.
b.
Nguồn
n
itr

oge
n
Tùy theo loài vi sinh vật mà nguồn đạm hữu cơ và vô cơ cần thiết cho tế bào sẽ
khác nhau. Nguồn đạm mà vi sinh vật thường dùng nhất là protein, acid amin,
NH
3
, NH
4
+
và NO
3
-
N
2
trong không khí là nguồn dinh dưỡng nitơ của nhóm vi
sinh vật cố định nitơ.Vi sinh vật cần có đủ đạm để tổng hợp các acid amin,
protein, acid nhân, lipid, carbohydrate và các coenzyme cho cơ thể.
c.
Nguồn
kho
á
ng
Sulfur: thường được cung cấp từ các sulphate. Cần thiết để tế bào tổng hợp acid
amin, vitamin và các carbohydrate.
Phospho: thường được cung cấp dưới dạng vô cơ hay hữu cơ. Phospho cần thiết
cho các phản ứng tổng hợp acid amin, phospholipid, ATP, coenzyme và protein. Ở
nồng độ phospho thấp có thể giới hạn sự tăng trưởng của tế bào.
Sắt: cần cho chức năng của enzyme, hệ thống cytochrom.
Các nguyên tố khoáng khác như K, Na, Mg, Ca, Mn …cũng rất cần thiết đối với
vi sinh vật, thiếu nó vi sinh vật không thể sinh trưởng phát triển bình thường

được. Các nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết cho vi sinh vật như Co, Mo, Cu,
Zn…
d. Các
yếu tố sinh
tr
ư
ở
n
g
Là các chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của một loài vi sinh vật nào đó
mà nếu thiếu thì tế bào không tự tổng hợp được nó. Có 3 nhóm yếu tố tăng
trưởng chính là:
+ Acid amin: cần cho sự tổng hợp protein
+ Purin và pyrimidin: cần cho sự tổng hợp acid nhân
+ Vitamin: cần cho hoạt động của các enzyme và coenzyme. Các vitamin
cần thiết cho nhu cầu dinh dưỡng của một số vi sinh vật được trình bày trong
bảng 3.
Bảng
3:
Một số vitamin và vai trò của chúng
t
r
o
n
g

hoạt động tế
b
à
o

Vitamin Coenzyme có
thành
phần
vita
m
i
n
Vai
trò
Acid folic Tetrahydrofolat (FH4) Chuyển các đơn vị có một cacbon
và cần cho sự tổng hợp thymin,
purin, serin, methionin và
pantothenat
Biotin (vitamin
H)
Biotin Các phản ứng sinh tổng hợp cần
sự cố định CO
2
Acid lipoic Lipoamid Chuyển các nhóm acyl trong sự
oxit hóa các acid keto
Acid mercapto-
ethalsulfonat
Coenzyme M
Sản xuất CH
4
bởi các vi sinh vật
sinh mêtan
Acid nicotinic NAD
+
và NADP

+
Vận chuyển điện tử trong các
phản ứng khử hydro
Acid
pantothenic
Coenzyme A và protein
chuyên chở acyl
Oxit hóa các acid keto và chuyên
chở nhóm acyl trong biến dưỡng
Pyridoxin (B
6
)
Pyridoxal photphat Chuyển amin, khử amin, khử
carboxyl và kết hợp các acid amin
Riboflavin (B
2
)
Flavin mononucleotid
(FMN) và flavin adenin
dinucleotid (FAD).
Các phản ứng oxy hóa khử
Thiamin (B
1
)
Thiamin pyrophotphat
(TPP)
Khử carboxyl các acid keto và
phản ứng xúc tác chuyển amin.
Vitamin
B

12
Cobalamin Chuyển nhóm methyl
Vitamin K Quinon và naptho-
quinon
Vận chuyển điện tử
(Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)
2.
Các
yếu tố
lý,
hóa học ảnh hưởng lên
vi
sinh
vật
a.
Ảnh hưởng của nhiệt
đ
ộ
Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc không những đối với sự sinh sản của vi sinh vật
mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng (do ảnh hưởng đến tốc độ của các phản
ứng hóa học và sinh hóa học).
Căn cứ vào nhiệt độ tối ưu của sự phát triển, người ta phân biệt thành các loại vi
sinh vật sau:

Những vi sinh vật ưa ấm trung bình (Mesophiles) ưa thích ở nhiệt độ trung
bình khoảng 20
o
C - 40
o
C (tối ưu 30

o
C – 37
o
C)

Những vi sinh vật ưa lạnh (Psychrophiles) có nhiệt độ tối ưu cho sự sinh
trưởng phát triển ở khoảng 10
o
C, nhưng chúng có thể phát triển ở 0
o
C,

Những vi sinh vật ưa mát (Psychrotrophes) rất gần gũi với những vi sinh
vật ưa ấm trung bình, chúng có nhiệt độ tối ưu ở khoảng 25
o
C, nhưng cũng có thể
thích nghi ở 0
o
C.

Các vi sinh vật ưa nhiệt (Thermophiles) sinh sản tốt ở nhiệt độ khoảng 45
o
C
và 55
o
C

Những vi sinh vật ưa (nóng) ở nhiệt độ cao (Thermophiles extremes hay
Hyperthermophiles) có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở khoảng 70
o

C hay hơn nữa.
b.
Ảnh hưởng của
oxy
Tuỳ theo khả năng sử dụng oxy phân tử mà người ta phân biệt thành các nhóm:
+ Các vi sinh vật hiếu khí đòi hỏi oxy tự do để phát triển
+ Các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc chỉ có thể phát triển trong điều kiện không
có oxy không khí (bởi vì chúng không có catalase, superoxyde dismutase, do đó
không có thể loại bỏ được các sản phẩm oxy hóa độc hại cho tế bào như nước
oxy già (H
2
O
2
) và các ion superoxyde )
+ Các vi sinh vật hiếu khí, kị khí hoặc kị khí không bắt buộc có thể
sinh
trưởng phát triển khi có hoặc không có oxy tự do
+ Các vi sinh vật vi hiếu khí chỉ có thể phát triển trong môi trường có nồng
độ oxy phân tử thấp.
Một số nấm men có thể sinh trưởng và phát triển chậm trong môi trường gần như
kị khí, khi đó chúng tiến hành lên men. Có vài loài nấm mốc, như Penicilium
requeforti là những cơ thể hiếu khí nhưng có thể chịu sống trong môi trường có
hàm lượng oxy thấp. Các vi khuẩn thì gồm nhiều loại, trải ra từ kị khí đến hoàn
toàn hiếu khí.
c.
Ảnh hưởng của ẩm
đ
ộ
Nước chiếm hơn phân nửa trọng lượng tế bào vi sinh vật, vì vậy đa số vi sinh vật
chỉ phát triển được khi môi trường có nước. Tuy nhiên, có một số nấm có khả

năng hấp thu nước từ không khí như các loại nấm phát triển trên quần áo hay
trong các dụng cụ quang học. Các vi sinh vật có kích thước nhỏ, vỏ dày, hình cầu
chịu đựng được sự khô khan trong môi trường hơn các vi sinh vật hình que, vỏ
mỏng. Ví dụ, loài Treponema palladium hình que có vỏ mỏng gây bệnh lậu
thường chết nhanh chóng trong môi trường khô trong khi đó loài Mycobacterium
tuberculosis gây bệnh lao thường sống rất lâu trong môi trường khô.
Một số vi sinh vật khác thành lập các cơ quan đặc biệt như bào tử ở rong, nấm, vi
khuẩn hay nang ở nguyên sinh động vật…để chống lại sự khô khan của môi
trường. Dựa vào các đặc điểm này người ta có thể giữ vật chất lâu dài bằng cách
làm lạnh thật nhanh mẻ cấy rồi sấy khô trong chân không, khi cần thì đem cấy
vào môi trường thích hợp,
d.
Ảnh hưởng của
ánh sáng
Vi khuẩn quang dưỡng, rong có thể biến đổi ánh sáng thành năng lượng cần thiết
cho hoạt động của tế bào. Tuy nhiên, đối với phần lớn vi sinh vật khác ánh sáng
có những tác hại như làm tê liệt các enzyme, làm xáo trộn phản ứng tổng hợp các
enzyme hay acid nhân, gây ra đột biến hay làm cho tế bào tổng hợp độc tố. Các
độc tố này làm hủy hoại tế bào tiết ra nó. Trong các loại ánh sáng, tia X và tia tử
ngoại (UV) có tác hại nhất.
e.
Ảnh hưởng của
pH
Các loài vi sinh vật có pH tối hảo riêng để tăng trưởng và phân cắt ở cường độ
cao nhất. Thông thường vi khuẩn phát triển ở pH từ 5-8 trong khi các loài nấm
mốc lại thích hợp ở môi trường acid (pH= 4-5). Người ta chia vi sinh vật làm 3
nhóm căn cứ vào độ pH thích hợp để chúng phát triển.
+ Vi sinh vật ưa acid: phát triển ở pH=1-5,5
+ Vi sinh vật trung tính: phát triển ở pH= 5,5-8
+ Vi sinh vật ưa kiềm: phát triển ở pH =8,5-11,5

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng kháng được điều kiện acid và kiềm của môi
trường chung quanh tế bào. pH bên ngoài tế bào có thể rất biến động nhưng pH
bên trong tế bào thì cố định.
Trong việc bảo quản thức ăn, người ta muối thức ăn và cho thêm một ít acid vào.
Acid sẽ có tác dụng ngăn cản vi sinh vật phát triển nên thức ăn không bị hỏng.
Tuy nhiên, pH thấp chỉ có tác dụng với vi khuẩn mà thôi còn các loại nấm mốc
thì không có tác dụng vì chúng thích hợp với môi trường acid.
f.
Ảnh hưởng của áp suất thẩm
thấu.
Nồng độ của muối khoáng trong môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tăng
trưởng của vi sinh vật.Thông thường vi sinh vật có thể phát triển ở các nồng độ
muối khoáng rất khác nhau. Khi nồng độ muối khoáng bên ngoài tế bào cao hơn
bên trong tế bào thì nước từ tế bào sẽ thoát ra ngoài môi trường làm tế bào bị co
lại và ngược lại khi nồng độ muối khoáng trong tế bào cao hơn môi trường, nước
từ môi trường sẽ đi vào tế bào làm tế bào trương to. Trong trường hợp này vỏ tế
bào sẽ giúp giữ cho tế bào không bị vỡ ra. Một số vi khuẩn có thể chịu được
nồng độ muối khoáng cao như trường hợp của Staphylococcus aureus có thể chịu
được nồng độ muối của môi trường bên ngoài tế bào lên đến 3M. Có loài nấm
men Saccharomyces có thể chịu được nồng độ đường cao.
Căn cứ trên nhu cầu về muối cần thiết cho sự tăng trưởng, người ta chia vi sinh
vật làm 3 loại:
- Vi sinh vật không chịu mặn, phát triển ở môi trường không có hay rất ít muối
như trường hợp vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas
- Vi sinh vật ưa mặn: cần muối để phát triển. Vi sinh vật nhóm này có thể chia
làm 3 loại:
+ Vi sinh vật ưa mặn ít: phát triển tốt trong môi trường có nồng độ muối
từ 1-6%
+ Vi sinh vật ưa mặn trung bình: phát triển tốt ở môi trường có nồng độ
muối từ 6-15%

+ Vi sinh vật rất ưa mặn: phát triển ở môi trường có nồng độ muối rất cao
từ 15-30% như các Halobacterium salanarum
Vi sinh vật phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối trung bình và ở môi
trường không có muối thì phát triển tốt nhất. Các vi sinh vật này được gọi là vi
sinh vật chịu được mặn, ví dụ vi khuẩn Staphylococcus aureus
Ngoài ra, các nhóm vi sinh vật có thể phát triển được ở môi trường có nồng độ
đường cao.
3. Các
giai đoạn phát triển của
vi
sinh
vật
Vi sinh vật hấp thu thức ăn trong môi trường để tăng trưởng. Sự tăng trưởng của
một tế bào vi sinh vật là sự gia tăng khối lượng của các cấu tử trong tế bào làm
cho tế bào gia tăng kích thước và trọng lượng. Đến cuối giai đoạn tăng trưởng thì
tế bào phân cắt cho ra tế bào con. Tế bào vi sinh vật có thể sinh sản bằng nhiều
cách như phân đôi, nảy chồi, bào tử…Sự tăng trưởng này được biểu diễn theo hệ
thống thập phân, log
2
hay log
10
. Cách tăng trưởng này gọi là tăng trưởng nhảy vọt
hay tăng trưởng theo log. Đường biểu diễn này được gọi là đường tăng trưởng
biểu diễn số tế bào mẻ cấy theo thời gian. Đường biểu diễn theo log là một
đường có độ dốc (hệ số góc) chính là cường độ tăng trưởng, độ dốc càng lớn
cường độ tăng trưởng càng nhanh.
Các tập đoàn vi khuẩn có đường tăng trưởng giống nhau và gồm có 4 giai đoạn:
a. Giai
đoạn
chậm

Trong giai đoạn này sự tăng trưởng và phân cắt của tế bào rất chậm. Do đó
đường biểu diễn có độ dốc nhỏ. Giai đoạn này được giải thích là khi chuyển vi
khuẩn từ môi trường cũ sang môi trường mới có thành phần thức ăn khác nhau
hay từ mẻ cấy già sang mẻ cấy mới điều chế vi khuẩn cần có thời gian để tổng
hợp các enzyme, coenzyme…để thích hợp với môi trường mới và nếu môi
trường mới giống môi trường cũ thì giai đoạn chậm không xảy ra.
b. Giai
đoạn
l
o
g
Khi vi khuẩn bắt đầu thích hợp với môi trường mới thì cường độ tăng trưởng
nhanh, đường biểu diễn có độ dốc lớn. Cường độ này tùy thuộc vào thành phần
môi trường và điều kiện ủ.
c. Giai
đoạn quân
bình
Khi thức ăn trong môi trường giảm và do sự tích tụ chất độc do vi khuẩn tiết ra,
số tế bào mới sinh bằng số tế bào chết đi nên đường biểu diễn nằm ngang.
d. Giai
đoạn
ch
ết
Cứ theo đà tiến triển trên, thức ăn ngày càng kiệt quệ, lượng chất độc tích tụ gia
tăng, số tế bào chết cao hơn tế bào sống, đây là giai đoạn chết. Tuy nhiên, người ta
có thể giữ mãi giai đoạn log bằng cách hàm cho hàm lượng thức ăn trong môi
trường không giảm. Đây là một mẻ cấy liên tục.
4. Cách
đo sự tăng trưởng của
vi

sinh
vật
Sự tăng trưởng của vi sinh vật chính là sự gia tăng trọng lượng của từng cá thể vi
sinh vật và sự gia tăng số lượng của tập đoàn vi sinh vật. Đối với sự gia tăng
trọng lượng ta không thể nào xác định một cách chính xác được vì cần phải có
hơn 10
10
tế bào vi sinh vật. Ngoài ra, sự gia tăng trọng lượng này không thể phản
ánh cường độ tăng trưởng của mẻ cấy. Đối với các vi sinh vật có kích thước lớn
người ta có thể đo sự tăng trưởng của chúng bằng cách lấy một thể tích dung dịch
nhất định có chứa vi sinh vật đem sấy ở 80
0
C trong 48 giờ rồi cân trọng lượng
khô. Thông thường, sự tăng trưởng của vi sinh vật có thể xác định bằng cách đếm
số tế bào
a.
Đếm trực
tiếp
Phương pháp Breed: lấy một thể tích nhất định vi sinh vật trải lên một diện
tích nhất định kính mang vật, nhuộm đơn, quan sát dưới kính hiển vi. Phương
pháp này khó thực hiện vì trải không đều.
Phương pháp dùng hộp đếm: các hộp đếm có kích thước và hình dạng thay
đổi tùy theo từng loại vi sinh vật muốn đếm. Thể tích mỗi ô vuông của hộp đếm
đã được biết trước. Điểm bất lợi là không thể phân biệt tế bào nào sống hay chết
và số tế bào phải cao.
b.
Phương pháp gián
tiếp:
Đếm sống: môi trường được pha loãng nhiều lần rồi chuyển đến đĩa petri và
trộn lẫn với môi trường chứa agar ở khoảng 45

o
C, để nguội, môi trường đặc lại,
đem ủ trong tủ ủ và đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào trong dung dịch muốn
đếm. Phương pháp này gọi là phương pháp đếm sống vì chỉ có vi sinh vật sống
mới phát triển thành khuẩn lạc. Phương pháp này mất nhiều thời gian.
Phương pháp đếm điện tử: Người ta dung máy đếm điện tử. Nguyên tắc là
sự thay đổi đột ngột của điện trở được ghi thành một chấn động. Điện trở ở
một
khe
có chất lỏng chảy qua, số tế bào vi sinh vật làm điện trở gia tăng. Điểm bất
lợi là chấn động được tạo ra với cả hạt bụi nên máy phải thật sạch.
Phương pháp quang học: Dùng quang phổ kế. Chiếu một chùm tia sáng qua
một ống nghiệm chứa vi khuẩn, độ đục của môi trường làm giảm cường độ của
chùm tia sáng và được ghi nhận trên một khung chia thành đơn vị OD. Vì số ánh
sáng tương ứng với mật số tế bào nên người ta so sánh với đường biểu diễn
chuẩn để suy ra mật số tế bào trong một đơn vị thể tích.
III. Tình
hình nghiên cứu trong
và
ngoài nước nhóm enzyme
p
r
o
tease
Hiện nay, ở nước ta và trên thế giới đã có nhiều công trình công bố về việc
nghiên cứu sử dụng sản phẩm từ enzyme protease.
1.
Trong
nư
ớc

của thịt cá nếu chỉ do một loại enzyme duy nhất tác động thì không bao giờ hoàn
toàn, nếu có tác động của các loại enzyme khác thêm vào thì quá trình a
sẽ nhanh hơn.
cá trong quá trình lên men nước mắm có bổ sung 10% nấm sợi Aspergillus
oryzae 22 tuần xuống còn 14 tuần,
tăng hàm lượng đạm tổng số, đạm amin, giảm lượng đạm amôn, có khả năng áp
dụng để sản xuất nước mắm nhanh.
Nguyễn Mỹ Tín và Nguyễn Văn Bá (1998) nghiên cứu quá trình lên men nước
mắm cá trích có bổ sung 10% chế phẩm protease nấm sợi, kết quả trong hai
tháng đầu mật số vi sinh vật ưa muối trong nước bổi cao hơn so với nước bổi
không bổ sung nấm sợi. Đạm tổng số và đạm amin tăng cao, đồng thời giảm
đáng kể lượng đạm amôn.
Vũ Ngọc Bội và Đồng Thị Thanh Thu (2003) nghiên cứu thu nhận protease từ
canh trường nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis
(Saurida tumbil) và thử nghiệm sản
xuất nước mắm từ cá cơm thường (Stolephorus commersonii
tốt nhất ở nhiệt độ 50 C, pH tự nhiên của cơ chất,
nồng độ protease 0,3%, lượng nước bổ sung 20% và có bổ sung 3% muối ăn
hoặc 8% ethanol hay 4% sorbitol để ức chế quá trình gây thối, trong đó sử dụng
sorbitol cho bột đạm có hàm lượng acid amin cao hơn, mùi thơm hơn và đạt tiêu
chuẩn về vi sinh vật. Sử
dụng

protease

B.

subtilis

, sản phẩm có hàm lượng và thành

phần acid amin cao hơn phương pháp truyền thống và các phương pháp bổ sung
các enzyme thương mại : NFĐ, Neutrase, Flavourzyme.
và ctv. (2005) nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ một
số nguồn khác nhau và ứng dụng để sản xuất chitin từ phế liệu tôm và cải tiến
quy trình sản xuất nước chấm từ đậu nành. Kết quả cho thấy nguồn thu nhận có
hiệu quả nhất là vi sinh vật. Từ đó đã xây dựng được quy trình thu nhận chế
phẩm

protease

từ

Bacillus

subtilis

cồn tốt nhất ở nhiệt độ 50
5 giờ. Sản xuất
nước chấm bằng phương pháp kết hợp enzyme-acid cho phép giảm lượng acid sử
dụng, rút ngắn chu kỳ sản xuất và hạ giá thành sản phẩm.
2.
Ngoài
nư
ớc
Nielsen

P.M.

el

al
. Kết quả cho thấy phương pháp OPA dễ thực hiện, cho kết quả
nhanh và chính xác hơn, phạm vi áp dụng rộng hơn và ít độc hại hơn so với
phương pháp TNBS (trinitro-benzene-sulfonic acid).
Hrčková Martina et al
nhau: Flavourzyme, Novozym và Alc
5% bằng ba enzyme protease khác
(19%),
(12,9%).
Salem F. M. A. et al. (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm
papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ đầu quá
trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và
shark). Kết quả cho thấy với 0,3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất
so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao
hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%.
Aspmo Stein Ivar et al
55
của nó hoặc bổ sung một trong số bảy enzyme protease thương mại
.
Nakajima Nobuyoshi et al

Lumbricus

rubellus.

-
-
.
PHẦN III:
PHƯƠNG

TIỆN VÀ
PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN
CỨU
I.
Ph
ư
ơ
n
g

tiện nghiên
cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme - Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học
1. Nguyên liệu
Trùn quế đã đông khô trữ lạnh ở -20
o
C.
2.
Thiết
bị và
dụng
cụ
Một số thiết bị như: tủ ủ (Ehret), máy quang phổ kế (U-1500, Hitachi), máy ly
tâm (Centaur 2, U.K), máy khuấy từ (Heidolph, Germany), máy đo pH (inoLab),
bếp điện, cân phân tích, buồng cấy vi sinh vật, máy lắc ủ (Heidolph, Germany),
nồi khử trùng.…..
Một số dụng cụ như: bình tam giác, dĩa petri, beaker, bình định mức, ống đong,
ống nghiệm, micropipet, que cấy…

3. Hóa
ch
ất
BSA (Biovin Serum Albumin) (Merck), NaCl (Merck), Borax (Disodium
tetraborate) (TQ), SDS (Sodium dodecyl sulfat) (Merck), OPA (Ortho-
phthaldialdehyde) (Merck), DTT (Dithiothreitol) (Merck), Serine (Merck), Ethanol
(Merck), HCl (Merck), Coomassie Blue G-250 (Merck), Acid phosphoric
85% (Merck).
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: pepton (Hà Lan), dịch chiết thịt bò, dịch chiết
nấm men, agar, natri clorua, đường…
- Môi trường Luria Broth (LB):
Pepton 10 gam
Yeast extract 5 gam
NaCl 10 gam
Agar 15-20 gam (nếu dùng môi trường đặc)
Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH 7,2.
- Môi trường nuôi cấy nấm men (YEB):
Dịch chiết thịt bò 5 gam
Dịch chiết nấm men 1 gam
Pepton 5 gam
Đường 5 gam
Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH = 6
Môi trường đạm dịch trùn quế thủy phân được tính để thay thế dựa trên lượng
đạm amin của 10 hoặc 5 gam pepton tùy theo môi trường nuôi cấy.
II.
Ph
ư
ơ
n
g

pháp nghiên
cứu
1. Chuẩn
bị
mẫu
và
xác định thành phần đạm nguyên
liệu
a.
Chuẩn
bị mẫu
- Sử dụng trùn quế đã rửa sạch, sấy đông khô (độ ẩm < 5%) và trữ lạnh ở -20
o
C.
Đem xay mịn bằng máy xay sinh tố rồi tiến hành tự thủy phân với các điều kiện
tối ưu cho quá trình tự thủy phân đã được nghiên cứu theo Phạm Thị Quỳnh
Trâm (2008).
- Tiến hành: Cân 26,52 gam trùn quế sấy đông khô đã xay mịn, bổ sung 173,48
ml nước cất, dịch thủy phân đạt nồng độ protein 9%. Thuỷ phân trong 24 giờ ở
nhiệt độ 55
o
C.
Cân lượng pepton Hà Lan (độ ẩm < 6 %) tương đương trùn quế sấy đông khô pha
trong cùng lượng nước cất. Tiến hành xác định hàm lượng protein hòa tan và
đạm amin.
b. Xác
định thành phần đạm nguyên
liệu
Hàm lượng đạm tổng số

Phương pháp: dùng phương pháp Kjeldahl (Phụ lục 1)
Hàm lượng protein hòa tan
Phương pháp: đo hàm lượng protein nguyên liệu theo phương pháp Bradford
(Phụ lục 2)
Hàm lượng đạm amin