THỬ NGHIỆM NUÔI TRỨNG HEO IN VITRO

THỬ NGHIỆM NUÔI TRỨNG HEO IN VITRO
Tóm tắt. Nhân bản vô tính (cloning) đã ra đời từ khá lâu là một kỹ thuật không còn xa lạ với công nghệ y
sinh học ngày nay. Từ đó có rất nhiều phương pháp để nâng cao hiệu quả nhân bản nói chung và nhân bản
heo nói riêng, trong đó có phương pháp IVM (in vitro maturation) là phương pháp dùng để nuôi chín trứng
trong ống nghiệm với tỉ lệ chín trứng cao và đạt chất chất lượng trứng tốt. Ở đây tôi sử dụng TCM – 199:
môi trường nuôi chín trứng, sử dụng môi trường thương mại do Nhật sản xuất, thành phần gồm các muối
vô cơ cùng một số acid amin. Để nâng cao hiệu quả nuôi chín trứng, ở đề tài này tôi sử dụng đĩa 4 ngăn
thay vì đĩa 4 giếng. Trong đĩa 4 giếng, mỗi vi giọt có thể tích 100µl, nuôi từ 10-15 trứng với tổng số trứng
nuôi là 791, số trứng chín 422 chiếm 52,26±6,27(%). Trong đĩa 4 ngăn, mỗi vi giọt có thể tích 10µl, nuôi 1
trứng với tổng số trứng nuôi là 770, số trứng chín 447 chiếm tỉ lệ 58,40±5,50(%). Với tỉ lệ trứng chín này
nếu có điều kiện tôi sẽ tiến hành bước tiếp theo tạo phôi heo.
Từ khóa: TCM-199, pig cloning, IVM.
1. Mở đầu
Heo là đối tượng thực hiện nhân bản
vô tính có nhều tiềm năng ứng dụng
trong thực tiễn như tạo ra những đàn heo
nhiều thịt, ít mỡ, chất lượng cao; với độ
tương đồng về cơ quan rất cao so với
người, heo là đối tượng lý tưởng cho việc
cung cấp các cơ quan dị ghép cho người,
thông qua việc biến đổi di truyền ( kết
hợp với knock-out gen gây phản ứng thải
loại trong dị ghép giúp tạo ra những cơ
quan sẵn sang phục vụ cho quá trình dị
ghép); hay tạo heo mang gen người sản
xuất các protein người trong thịt hay sữa.
Ngoài ra, còn giúp bảo tồn giống lợn ỉ
quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng.
Đây còn là tiền đề để tiếp tục phát triển
kỹ thuật nhân bản ở các loài khác, cung
cấp nguồn tế bào gốc đầy tiềm năng từ

phôi nhân bản.
Công đoạn đầu tiên của nhân bản heo
là nuôi chín trứng heo trong ống nghiệm.
Ngoài các yếu tố nhiệt độ, lưu lượng khí
thì môi trường là thành phần quan trọng
ảnh hưởng đến kết quả nuôi chín trứng.
Trong luận văn này tôi sử dụng môi
trường nuôi chín trứng là TCM-199. Môi
trường phức tạp TCM-199 đệm
bicarbonate hoặc HEPES và có bổ sung
các loại huyết thanh khác nhau và/ hoặc
gonadotropin và/hoặc hormone steroid là
môi trường nuôi cấy mô được sử dụng
rộng rãi trong các nghiên cứu nuôi trứng
heo chín nhân tạo. Các tế bào sinh dưỡng
1
nang có mặt trong môi trường có thể ảnh
hưởng đến khả năng của trứng.
Ở đây, tôi khảo sát ảnh hưởng của
đặc tính đĩa nuôi trong quá trình IVM, đó
là sử dụng loại đĩa khác: đĩa 4 ngăn và
thể tích giot nuôi cùng số trứng trong một
cũng khác. Tỷ lệ trứng chín khi nuôi trên
đĩa 4 giếng là 52,26 ± 6,27% cao hơn so
với tác giả Huỳnh Thị Lệ Duyên (2003)
là 16% nhưng lại thấp hơn so với các tác
giả Mariana Groke Marques và cs.,
(2006) là 65%; Kazuhiro và cs., (1999) là
68%. Kết quả xử lý thống kê cho thấy khi
thực hiện IVM trong đĩa 4 ngăn ta thu

được tỷ lệ trứng chín đạt được nhiều hơn
và sự đạt được này có ý nghĩa thống kê.
Do đó, tôi thực hiện IVM trong đĩa 4
ngăn để chuẩn bị nguồn trứng cho thao
tác. Tham khảo các kết quả từ các tài liệu
liên quan đến nuôi chín trứng cho nhân
bản và kết quả thực nghiệm từ sinh viên
Lâm Tuấn Anh cho thấy môi trường có
bổ sung hormone (PMSG và hGC), kết
hợp với chuyển trứng sau 20-22 giờ nuôi,
cho tỷ lệ trứng chín cao (73,74 ± 6,24%),
chín về nhân và tốt về hình thái của tế
bào chất. Do đó, chúng tôi sử dụng kết
hợp cách nuôi trong đĩa 4 ngăn, thay đổi
thành phần trong môi trường nuôi ( bổ
sung PMSG và hGC) cùng với việc
chuyển trứng sau 20-22 giờ nuôi, để
chuẩn bị nguồn trứng tốt cho chuyển
nhân.
2. Nguyên liệu và phương pháp
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Đối tượng thí nghiệm
Trong thí nghiệm này, đối tượng
được sử dụng là buồng trứng heo, lấy từ
công ty TNHH một thành viên Việt Nam
Kỹ nghệ súc sản ( VISSAN). Địa chỉ 240
Nơ Trang Long, phường 13, quận Bình
Thạnh, thành phố Hồ Chí Minh.
Hình 1: Buồng trứng heo
2.1.2. Dụng cụ

2
Hình 2: Một số hình ảnh dụng cụ: A.
Dây truyền nước biển, B. Ống mao quản,
C.
Kim tiêm 18G, D. Syringe 5ml, E.
Đĩa 4 ngăn Φ90, F. Đĩa 4 giếng, G. Đĩa
petri nhựa Φ35
2.1.3.Hóa chất, môi trường
Môi trường thu nhận và rửa trứng
mDPBS
Môi trường nuôi chín trứng (IVM):
TCM-199 sử dụng môi trường thương
mại do Nhật sản xuất, thành phần gồm
các muối vô cơ cùng một số acid amin.
2.2. Phương pháp
2.2.1. Thu nhận buồng trứng
Buồng trứng được lấy từ lò mổ
về, chứa trong dung dịch nước muối sinh
lý có bổ sung kháng sinh, giữ ấm ở nhiệt
độ 37 – 38
o
C. Rửa buồng trứng hai lần
bằng nước muối sinh lý có bổ sung kháng
sinh, trước khi đưa vào khu vực thao tác.
Cần lưu ý là buồng trứng luôn được ủ
trong bể ổn nhiệt ở 37
o
C.
2.2.2. Phân loại trứng
Những trứng sau khi thu được phân

chia và sắp xếp sao cho hợp lí quan sát
dưới kính hiển vi. Trứng được phân loại
gián tiếp từ trước(Johnston et al., 1989).
Miêu tả tóm tắt, trứng cấp 1: tốt nhất,
trứng được bao quanh ít nhất 2 lớp tế bào
cumulus, tối và tế bào chất đồng nhất.
Trứng cấp 2: tạm được, lớp tế bào
cumulus không hoàn chỉnh, tối nhạt và tế
bào chất đều. Những trứng thu được rửa
lại 2 lần trong m-DPBS, rửa tiếp 2 lần
bằng môi trường nuôi. Sau đó chuyển
vào đĩa môi trường nuôi IVM1 đã được
chuẩn bị sẵn trước đó. Nuôi trong tủ ấm
38,5
o
C, 5%CO2 trong 20 – 22 giờ, sau đó
chuyển sang đĩa nuôi IVM2 không bổ
sung 2 loại hormone hCG và PMSG tiếp
tục nuôi trong 20 – 22 giờ ở 38,5
o
C, 5%
CO2.
3
Hình 3: Trứng được chọn để IVM
2.2.3. Nuôi chín trứng
Chuẩn bị môi trường cho việc nuôi
trứng: môi trường mDPBS để thu và rửa
trứng và môi trường IVM. Khảo sát hai
phương pháp nuôi trứng trong hai loại đĩa
khác nhau. Đĩa 4 giếng: mỗi vi giọt có

thể tích 100µl, nuôi từ 10 – 15 trứng. Đĩa
4 ngăn, Φ90: mỗi vi giọt có thể tích 10µl,
nuôi một trứng trong một giọt. Môi
trường được phủ dầu khoáng, ủ trong tủ
ấm trước khi cho trứng vào nuôi tối thiểu
2 giờ. Thực hiện thu trứng trong tủ cấy
vô trùng. Buồng trứng được chọn là
những buồng trứng với các nang từ 3 – 7
mm, nang đồng đều, màu sắc hơi hồng,
không chọn các buồng có nang quá nhỏ
hay quá to, bị thâm đi. Buồng tứng được
đặt trong đĩa Φ35 có sẵn một ít dung dịch
mDPBS, dùng syringe 5ml và kim 18G
hút các nang trứng. Sử dụng pipette
Pastuer và pipette mouth để thu trứng.
Pipette Pastuer cần được kéo đúng kích
thước để đảm bảo không quá nhỏ làm
mất các lớp cumulus bao quanh trứng,
nhưng cũng không được quá to tránh hút
nhiều môi trường khác vào môi trường
nuôi. Chỉ các trứng có từ 3 lớp cumulus
trở lên mới được chọn cho IVM. Những
trứng thu được, được rửa lại 2 lần trong
mDPBS, rửa tiếp hai lần bằng môi
trường nuôi. Sau đó chuyển vào vi giọt
trong đĩa môi trường nuôi đã được chuẩn
bị từ trước. Chuyển trứng sau mỗi 20 –
22 giờ nuôi. Đánh giá, chọn lựa, xử lý
trứng cho cloning sau 40-44 giờ nuôi.
Hình 4: Trứng chín có xuất hiện thể cực

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thống kê được xử lý bằng hệ
thống Student t-test.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Kết quả nuôi chín trứng trong hai
loại đĩa khác nhau
4
Chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ trưởng
thành của trứng trong điều kiện in vitro,
sử dụng cùng một loại môi trường nhưng
dụng cụ nuôi khác nhau. Trong đĩa 4
giếng, mỗi vi giọt có thể tích 100µl, nuôi
từ 10-15 trứng.Trong đĩa 4 ngăn, mỗi vi
giọt có thể tích 10µl, nuôi 1 trứng.
Kết quả thể hiện trong bảng 4.1, bảng 4.2
và biểu đồ 4.1 dưới đây:
Bảng 4.1. Kết quả IVM sử dụng đĩa 4 giếng
Lô thí
nghiệm
Số trứng
nuôi (n)
Số trứng có thể cực
n %
1 98 47 47,96
2 31 13 41,94
3 100 50 50,00
4 76 45 59,21
5 81 42 51,85
6 89 51 57,30
7 78 43 55,13

8 48 21 43,75
9 88 49 55,68
10 102 61 59,80
Tổng 791 422
Trung bình (%) 52,26 ± 6,27
Bảng 4.2. Kết quả IVM sử dụng đĩa 4 ngăn
Lô thí
nghiệm
Số trứng
nuôi (n)
Số trứng có thể cực
n %
1 81 42 51,85
2 34 21 61,76
3 83 49 59,04
4 89 60 67,42
5 92 51 55,43
6 90 48 53,33
7 76 39 51,32
8 50 31 62,00
9 79 51 64,56
10 96 55 57,29
Tổng 770 447
Trung bình (%) 58,40 ± 5,50
Dựa theo kết quả trung bình vừa
tính toán ở trên, ta có thể thấy phần trăm
trứng chín ở các lô thí nghiệm nuôi chín
trứng trong đĩa 4 ngăn (58,40 ± 5,50%)
cao hơn đĩa 4 giếng (52,26 ± 6,27%).
Bảng 4.3. So sánh thống kê giữa hai cách IVM

trong 2 loại đĩa
Phần trăm số trứng
chín khi IVM trong
đĩa 4 giếng
Phần trăm số trứng
chín khi IVM trong
đĩa 4 ngăn
52,26 ± 6,27 58,40 ± 5,50
Dựa trên kết quả thống kê với độ
tin cậy 95%, P < 0,05, do đó sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, phần trăm
trứng chín khi IVM trong đĩa 4 ngăn cao
hơn trong đĩa 4 giếng.
3.2. Biện luận
Tỷ lệ trứng chín khi nuôi trên đĩa
4 giếng là 52,26 ± 6,27% cao hơn so với
5