Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất hydrazinobenzothiazolcurcumin và difluourophenylhydrazinocurmin từ curcumin

i
ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN
XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ
2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ CURCUMIN




Tác giả



ĐẶNG THỊ MỸ LỆ
ĐỖ THỊ XUÂN VUI




Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
Cấp bằng Kỹ sư ngành
Công nghệ hóa học





Giáo viên hướng dẫn
Th.S PHAN THỊ HOÀNG ANH
Th.S LÊ XUÂN TIẾN
Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN

Tháng 08/2009

ii

LỜI CẢM ƠN


iii
TÓM TẮT

Đề tài “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine
2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ
curcumin” được thực hiện tại phòng Thí nghiệm tổng hợp hữu cơ trường Đại Học
Bách Khoa TP. HCM, thời gian từ 02/2009 đến 08/2009.

Nội dung chính của đề tài là tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của dẫn
xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin
từ curcumin nhằm tìm kiếm một hoạt chất có tiềm năng sử dụ
ng trong lĩnh vực dược
phẩm.
Tiến trình thực hiện đề tài như sau:
1/ Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin từ bột curcuminoid
- Phân lập curcumin từ bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội).
- Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm chảy,
xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR.
Kết quả: Đã tổng hợp và phân lập thành công curcumin có độ tinh khiế
t >95% và có
thể dùng curcumin tinh khiết này cho các quá trình tổng hợp dẫn xuất tiế
p theo.
2/ Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất imine
– Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC),
2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC).
– Phân lập sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột.
– Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bảng mỏng TLC, đo điểm chảy.
– Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổIR, MS, NMR.
Kết quả: Đã tổng hợp và tìm được hệ dung môi thích hợp để phân lập thành công 2
dẫn xuất imine DFPHC, HBTC có độ tinh khiết > 95% để tiến hành khảo sát các hoạt
tính sinh học.

iv
3/ Khảo sát hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất imine - curcumin
– Hoạt tính kháng ung thư.
– Hoat tính kháng oxy hóa.
– Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.
– So sánh các hoạt tính sinh học của dẫn xuất đã tổng hợp được với hoạt

tính sinh học của curcumin.
Kết quả:
Trong luận văn này, hai dẫn xuất DFPHC và HBTC đều thể hiện hoạt tính
kháng oxi hoá trong thử nghiệm DPPH và MDA tuy nhiên hoạt tính thấp hơn Cur.
DFPHC và Cur đều thể hiệ
n hoạt tính kháng ung thư đối với dòng tế bào
Hep – G2.
Ngoài ra DFPHC và HBTC đều có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm nhưng
hoạt tính này không đáng kể với các chủng vi khuẩn, vi nấm đã khảo sát.



v
MỤC LỤC
Trang tựa ......................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ...................................................................................................................... ii
Tóm tắt ............................................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................................ v
Danh sách các từ viết tắt .............................................................................................. viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ ix
Danh sách các bảng ....................................................................................................... xi
Danh sách các sơ đồ ..................................................................................................... xii
Chương 1: MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................... 2
1.3. N
ội dung đề tài ......................................................................................................... 2
1.4. Yêu cầu ..................................................................................................................... 3
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4
2.1. Tổng quan về curcumin ............................................................................................ 4

2.1.1. Curcuminoid .......................................................................................................... 4
2.1.1.1. Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid .............................................................. 4
2.1.1.2. Phân lập các dẫn xuất curcuminoid .......................................................... 5
2.1.2. Curcumin ............................................................................................................... 6
2.1.2.1. Lý tính ................................................................................................................. 6
2.1.2.2. Hóa tính .............................................................................................................. 7
2.2. Hoạt tính sinh học của Cur và dẫn xuất của Cur. ................................................... 14
2.2.1. Hoạt tính kháng ung thư
...................................................................................... 15
2.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa ...................................................................................... 16
2.3. Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine Cur .................................................... 17
Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 23
3.1. Sơ đồ thực nghiệm .................................................................................................. 23
3.2. Phương pháp thực hiện ........................................................................................... 24
3.2.1. Phân lập curcumin ................................................................................................ 24

vi
3.2.1.1. Kết tinh lại ........................................................................................................ 25
3.2.1.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) ................................................................................... 26
3.2.1.3. Sắc ký cột ......................................................................................................... 27
3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất imne – curcumin. ........................................................... 29
3.2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2 hydrazinobenzothiazolcurcumin .................................... 29
3.2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất 2,4 diflorophenylhydrazinocurcumin ................................ 32
3.2.3. Phân tích cấu trúc của các dẫn xuất vừa tổng hợp .............................................. 35
3.2.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis). ...................................................................... 35
3.2.3.2. Phổ hồng ngo
ại (IR) ......................................................................................... 35
3.2.3.3. Khối phổ .......................................................................................................... 35
3.2.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ............................................................................ 35
3.2.4. Khảo sát hoạt tính sinh học ................................................................................ 35

3.2.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH ................... 35
3.2.4.2. Đánh giá hoạt tính chống peroxide hóa lipid - phương pháp MDA ................ 37
3.2.4.3. Đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn- phương pháp MIC ................... 38
3.2.4.4. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư .................................................................... 39
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 41
4.1. Phân lập curcumin .................................................................................................. 41
4.1.1. Kết tinh l
ại curcuminoid ...................................................................................... 41
4.1.2. Sắc ký cột ............................................................................................................. 42
4.1.3. Nhận danh cấu trúc hóa học ................................................................................ 43
4.1.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng của curcumin ........................................................... 43
4.1.3.2. Biện luận cấu trúc của curcumin ...................................................................... 44
4.2. Tổng hợp dẫn xuất 2-hydrazinobenzothiazolecurcumin ........................................ 46
4.2.1. Theo dõi phản ứng ............................................................................................... 46
4.2.2. Sắc ký cột ............................................................................................................. 47
4.2.3. Nhận danh cấu trúc .............................................................................................. 48
4.2.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng ................................................................................. 48
4.2.3.2. Biện luận cấu trúc của HBTC ........................................................................... 48
4.3.2. Sắc ký cột ............................................................................................................. 52
4.3.3. Biện luận cấu trúc ................................................................................................ 53

vii
4.3.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng ................................................................................. 53
4.3.3.2. Biện luận cấu trúc của DFPHC ........................................................................ 53
4.4. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học ........................................................................ 56
4.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa ....................................................................................... 56
4.4.1.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro- phương pháp DPPH .................... 56
4.4.1.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá tiền in vitro phương pháp MDA ................ 58
4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào ...................................................................................... 60
4.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm ..................................................................... 61

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 62
5.1. Kết luận ................................................................................................................... 62
5.2. Kiến nghị. ............................................................................................................... 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 64
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 67


viii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT


Cur : Curcumin
DMC : Demethoxycurcumin
BDMC : Bisdemethoxycurcumin
HC : Hydrazinocurcumin
IOZ : Isoxazolcurcumin
HBTC : 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin
DFPHC : 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin
OD : Mật độ quang
HTCO : Hoạt tính kháng oxi hoá
CS : là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của hoạt chất được
thử tính theo % so với chất đối chứng
IC
50
: Nồng độ hoạt chất để ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư
hoặc gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration)
IC
70
: Nồng độ hoạt chất để ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư

hoặc gốc tự do
MIC : Nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm có khả năng ngăn cản sự phát
triển của vi khuẩn, vi nấm (minimum inhibitory concentration)
HPLC : Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography)
IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
MS : Khối phổ (Mass spectrometry)
NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy)
TLC : Sắc ký bả
n mỏng (Thin layer chromatography).

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid .................................................... 4
Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur
........................................ 6
Hình 2.3: Các dạng ion của Cur theo pH
.............................................................................. 8
Hình 2.4: Sự phân huỷ của Cur trong môi trường kiềm
...................................................... 9
Hình 2.5: Phản ứng cộng H
2
của Cur
................................................................................... 10
Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá
................................................................................ 11
Hình 2.7: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng (k
obsd
) giữa acetone và hydroxylamine

vào
pH môi trường.
................................................................................................................ 12
Hình 2.8: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazolecurcumin
.................................... 12
Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch
................................................................... 13
Hình 2.10: Phức Cur với kim loại
........................................................................................ 13
Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do
....................................................................... 14
Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u
....................... 16
Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur
...................................................... 17
Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC
....................................................................................... 18
Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC
.................................................................................... 18
Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ hydrazinoCur với các chủng tế bào ung thư

khác
nhau (theo phương pháp MTT)
............................................................................................ 18
Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN
............ 19
Bảng 2.4 : Giá trị IC
50
của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC
................ 20

Hình 2.18: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine từ Curcuminoid ........................ 20
Hình 2.19: 3-nitrophenylpyprazolecurcumin ................................................................ 21
Hình 2.20: Hydrazinocurcumin ..................................................................................... 21
Hình 2.21: Công thức cấu tạo của CSC
............................................................................... 21
Hình 3.1: Phương pháp tính R
f
............................................................................................. 27
Hình 3.2 : Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá
............................... 36
Hình 3.3: Cơ chế tạo màu của MDA
................................................................................... 37
Hình 4.1: Bản mỏng kiểm tra hỗn hợp curcuminoid sau các lần kết tinh
....................... 41

x
Hình 4.2: TLC phân đoạn tinh thu được từ sắc ký cột
...................................................... 42
Hình 4.3: (A) Sắc ký cột phân lập Cur (B) Cur: cur thu được qua sắc ký cột.
........ 42
Hình 4.4: Tinh thể Cur
........................................................................................................... 43
Hình 4.5: Phổ UV-vis (trong ethanol) của Cur
................................................................... 43
Hình 4.6: Curcumin, C
21
H
20
O
6

(M=368).
.......................................................................... 45
Hình 4.7: TLC theo dõi phản ứng
........................................................................................ 46
Hình 4.8: Sắc ký cột thô
........................................................................................................ 47

Hình 4.9: Sắc ký cột tinh
....................................................................................................... 47
Hình 4.10: (A) TLC của HBTC so với Cur (silica gel ,CH
2
Cl
2
:CH
3
OH: 97:3 v/v)
...... 48
Hình 4.11: Cấu trúc của HBTC, C
28
H
23
SN
3
O
4
(M=497)
.................................................. 49
Hình 4.12: TLC theo dõi điểm dừng phản ứng
......................................................................
Hình 4.13: Sắc ký cột thô

...................................................................................................... 52

Hình 4.14: Sắc ký cột tinh
.................................................................................................... 52
Hình 4.15: (A) Dạng tinh thể của DFPHC và
..................................................................... 53
(B) TLC của DFPHC (silica gel, CH
2
Cl
2
:CH
3
OH: 98:2 v/v)
....................... 53
Hình 4.16: Cấu trúc của DFPHC, C
27
H
22
N
2
F
2
O
4
(M=476)
.............................................. 54
Hình 4.17: Hoạt tính kháng oxy hoá của HBTC, DFHTC, Cur theo phương pháp
DPPH
....................................................................................................................................... 57

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid
.......................................................... 4
Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất Curcuminoid
.......................................... 5
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur
......................................... 7
Bảng 2.4 : Giá trị IC
50
của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC
................ 20
Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại
...................................................................................... 25
Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi
......................................................................... 26
Bảng 3.3: Bảng nồng độ các dung dịch thử DPPH
............................................................ 36
Bảng 4.1: Kết quả định lượng của quá trình kết tinh
......................................................... 41
Bảng 4.2: Tính chất vật lý đặc trưng của Cur
..................................................................... 44
Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của curcumin
........................................................................ 45
Bảng 4.4: Tính chất vật lí đặc trưng của HBTC
................................................................. 48
Bảng 4.5: Dữ liệu phổ NMR của HBTC
............................................................................. 49

Bảng 4.6: Tính chất vật lý đặc trưng của DFPHC
............................................................. 53
Bảng 4.7: Dữ liệu phổ NMR của DFPHC
.......................................................................... 54
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của HBTC, DFPHC, Cur

theo
phương pháp DPPH
............................................................................................................... 56
Bảng 4.9: Hoạt tính kháng oxy hoá của vitamin C theo phương pháp DPPH
............... 56
Bảng 4.10: Giá trị IC
50
trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá DPPH
.................... 57
Bảng 4.12: Hoạt tính kháng oxy hoá của Trolox theo phương pháp MDA
................... 58
Bảng 4.13: Giá trị IC
50
trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá MDA
..................... 59
Bảng 4.14: Kết quả xác định giá trị IC
50
trong khảo sát hoạt tính kháng ung thư của
DFPHC, Cur với 3 dòng tế bào Hep-G2, Lu và RD ...................................................... 60
Bảng 4.15: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của HBTC, DFPHC, Cur đối với một số
chủng vi khuẩn, vi nấm
......................................................................................................... 61

xii

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ thực nghiệm tiến hành nghiên cứu.
........................................................ 23
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin
............................................................................. 24
Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC)
................. 29
Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp 2,4-Diflorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC)
.......... 32

1






Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Từ lâu curcumin đã được biết đến như là một hoạt chất có nguồn gốc từ thực
vật đóng vai trò quan trọng trong nền công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm.
Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng tỏ curcumin có nhiều hoạt tính sinh học quan
trọng như: kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng nhiều chủng tế bào ung thư, chống đột
biến, giả
m cholesterol, chống đông máu, chữa được một số bệnh như: Alzheimer, đái

tháo đường, viêm khớp, HIV-AIDS... Mặt khác curcumin lại là hoạt chất không gây
độc cho người và động vật ngay cả khi dùng với liều lượng lớn (10g/ngày). Chính vì
những đặc tính trên mà hiện nay curcumin đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà
nghiên cứu khoa học trên thế giới đặc biệt là trong lĩnh vực dược phẩm.
Hiện nay có nhiều phương pháp để nâng cao hoạt tính sinh học cho curcumin.
Tuy nhiên mộ
t trong những phương pháp cho nhiều kết quả khả quan là tạo dẫn xuất
imine cho curcumin. Qua các nghiên cứu gần đây cho thấy các dẫn xuất imine này làm
tăng đáng kể hoạt tính sinh học của curcumin và thể hiện tiềm năng được ứng dụng
rộng rãi trong ngành dược.
Nhận thấy được những ưu điểm và tiềm năng của nhóm dẫn xuất này chúng tôi
thực hiện đề tài: “Điều ch
ế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine
2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ
curcumin”.


2
1.2. Mục tiêu đề tài
- Tổng hợp các dẫn xuất imine: 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và
2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin.
- Khảo sát các hoạt tính sinh học của các dẫn xuất vừa tổng hợp.
•
Hoạt tính kháng ung thư.
•
Hoạt tính kháng oxy hóa.
•
Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.
1.3. Nội dung đề tài
Từ các mục đích đã đưa ra đề tài sẽ được triển khai theo các nội dung cơ bản

sau:
a. Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin.
– Phân lập curcumin từ bột curcuminoid.
– Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm
chảy, xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR.
b. Tổng hợp và xác
định cấu trúc của các dẫn xuất
– Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC)
2,4 - Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC).
– Phân lập các sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột.
– Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bản mỏng (TLC).
– Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổ MS, IR và NMR.
c. Khảo sát các hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất
imine - curcumin
–
Hoạt tính kháng ung thư.
– Hoat tính kháng oxy hóa.

Theo phương pháp DPPH.

Theo phương pháp MDA.
– Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.
– So sánh các hoạt tính của dẫn xuất tổng hợp được với hoạt tính sinh học
của curcumin.

3
1.4. Yêu cầu
– Tách và tinh chế được curcumin tinh khiết.
– Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin.
– Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2,4 – Difluorophenylhydrazinocurcumin.

– Xác định cấu trúc của các dẫn xuất bằng phổ MS, IR và NMR.
– Khảo sát hoạt tính sinh học của:
•
Curcumin.
•
2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin.
•
2,4–Difluorophenylhydrazinocurcumin.


4




Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về curcumin
2.1.1. Curcuminoid
2.1.1.1. Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid
Hỗn hợp curcuminoid là một trong những thành phần quan trọng mang nhiều
hoạt tính đáng quý được chiết từ củ nghệ vàng (Curcuma longa L.). Hỗn hợp
curcuminoid có dạng bột màu vàng và là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng cam
của nghệ [6].
Lượng curcuminoid trong bột nghệ khoảng từ 3 – 6%. Hỗn hợp curcuminoid
có chứa khoảng 77% curcumin (Cur), 17% demethoxycurcumin (DMC), 3%
bisdemethoxycurcumin (BDMC) [7].
O O
OH
R

1
OH
R
2

Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid [7]
Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid [7]
Hợp chất R
1
R
2
CTPT M (đvc)
Cur OCH
3
OCH
3
C
21
H
20
O
6
368
DMC OCH
3
H C
20
H
18
O

5
338
BDMC H H C
19
H
16
O
4
308


5
2.1.1.2. Phân lập các dẫn xuất curcuminoid
Để tìm hiểu, nghiên cứu sâu hơn về curcuminoid cũng như các dẫn xuất của nó
thì các dẫn xuất này cần phải được phân lập ra vì mỗi thành phần này có cấu trúc hoá
học khác nhau nên màu sắc và tính chất hoá học cũng khác nhau. Vì vậy việc phân lập
các thành phần của curcuminoid ra là vấn đề cần thiết và mang ý nghĩa thiết thực.
Hiện nay đã có nhiều tác giả dùng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập các
thành phầ
n của curcuminoid.
Opa vajragupta và cộng sự [8] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid bằng sắc
ký cột silica gel 60G, 0.063-0.200mm với hệ dung môi CHCl
3
:MeOH:AcOH (98:5:2
v/v/v). Theo phương pháp này, Cur được rửa giải đầu tiên, kế tiếp là hỗn hợp của
Cur và DMC, cuối cùng là BDMC tinh. DMC được tách ra khỏi hỗn hợp giữa DMC
và Cur bằng sắc ký cột với hệ dung môi CH
2
Cl
2

:MeOH (95:5 v/v ).
G. K. Jayaprakasha và cộng sự [9] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid
bằng sắc ký cột silica gel. Thu được Cur, DMC, BDMC lần lượt với hệ dung môi
benzene : EtOAc (82:18 v/v), benzene : EtOAc (70:30 v/v), benzene : EtOAc (58:42
v/v). Nhiệt độ nóng chảy đo được của Cur, DMC, BDMC tương ứng là 186 - 187, 175
- 176, 231 - 232
o
C.
W. Chearwae và cộng sự [10] đã cô lập các dẫn xuất curcuminoid từ cao
ethanol trích từ củ nghệ vàng cũng bằng sắc ký cột silica gel với dung môi CHCl
3
,
sau đó tăng dần độ phân cực của hệ dung môi bằng CH
3
OH. Thu được các phân
đoạn Cur, DMC, BDMC có độ tinh khiết khoảng 95-99% (HPLC).
L. Péret-Almeida và cộng sự [11] đã cô lập, xác định cấu trúc và một số tính
chất hoá lý của từng dẫn xuất curcuminoid riêng biệt. Hỗn hợp curcuminoid (Merck)
được kết tinh lại 3 lần bằng hệ dung môi CH
2
Cl
2
:CH
3
OH (5:1 v/v), hiệu suất quá
trình kết tinh ~ 40%.
Cắn thu được từ nước cái của quá trình kết tinh được sắc ký với chất hấp phụ
silica gel tẩm sodium dihydrogen phosphate (NaH
2
PO

4
), dung môi rửa giải là
CH
2
Cl
2
. Các phân đoạn tinh khiết được xác định cấu trúc và một số tính chất vật lý.


6
Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất curcuminoid [11]
Điểm chảy (
o
C)

Cur DMC BDMC
184 172 222

Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur [11]
Điều kiện HPLC: cột spherical Shi-pack CLC NH
2

(5 µm, 4.6 x 150 mm, Shimadzu),
pha động ethanol: nước (85/15 v/v), tốc độ dòng 1ml/phút, 22
o
C, detector DAD 425nm.
Ngoài ra các thành phần này còn được định tính bằng phổ tử ngoại khả kiến,
hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và bằng phương pháp so màu. Các kết quả
đều cho thấy các thành phần phân lập được chính là Cur, DMC, BDMC.
2.1.2 Curcumin

2.1.2.1. Lý tính
Có dạng bột màu vàng cam huỳnh quang, không mùi [6].
Tỉ trọng: 0.93 g/ml [5].
Điểm chảy: 179- 183
0
C [5].
Bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng. Khi ở dạng dung dịch Cur dễ bị phân
hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ [6].

7
Tan trong chất béo, ethanol, methanol, dicloromethane, aceton, acid acetic băng
và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan <10 mg ở
25
0
C) [6,12].
Tan trong môi trường kiềm tạo dung dịch màu đỏ máu rồi ngả tím, tan trong
môi trường acid có màu đỏ tươi [4].
Dung dịch Cur trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng từ
420 - 430 nm [6].
2.1.2.2. Hóa tính
a. Quá trình điện ly theo pH
Cur không tan trong môi trường nước ở pH acid và trung tính nhưng tan tốt ở
pH kiềm [12]. Nghiên cứu bằng kỹ thuật HPLC cho kết quả điện ly theo pH của Cur
như sau:
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồ
n tại của Cur [12].
pH Màu của dung dịch Dạng ion tồn tại
< 1 Đỏ H
4
A

+

1 – 7 Huyền phù màu vàng H
3
A
> 7.5 Đỏ H
2
A
-
, HA
2-
, A
3-

H
4
A
+
OH
+
HO
OCH
3
H
3
CO
OHOH

8
H
3
A
OHHO
OCH
3
H
3
CO
OHO

H
2
A
-

OHHO
OCH
3
H
3
CO
O
-
O

HA
2-
O
-
HO
OCH
3
H
3
CO
O
-
O

A
3-
O
--
O
OCH
3
H
3
CO
O
-
O

Hình 2.3: Các dạng ion của Cur theo pH [12]
b. Phản ứng phân hủy

 Phân hủy trong môi trường kiềm
Cur tương đối bền trong môi trường acid nhưng lại bị phân hủy nhanh chóng
trong môi trường kiềm [12]. Ở pH = 8.5, chỉ sau 5 phút Cur đã bắt đầu phân hủy thành
ferulic acid và feruloylmethane. Sau đó, feruloylmethane còn bị phân hủy thành
vanillin và acetone.


9
OCH
3
OCH
3
OH
HO
OO
OCH
3
HO
O
OCH
3
OH
O
HO
OH
-
OH
-
OCH
3

HO
CHO
O
as radical
feruloyl methane
ferulic acid
condensation product
vaniline
actone

Hình 2.4: Sự phân huỷ của Cur trong môi trường kiềm [12, 14]
Nghiên cứu của Ying Jan Wang và cộng sự [13] cũng cho thấy 90% Cur bị
phân huỷ sau 30 phút trong môi trường đệm phosphate pH = 7.2, 37
o
C.
 Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng [12]
Cur không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch. Khi tiếp xúc với ánh
sáng, Cur bị phân huỷ ngay cả ở dạng rắn và bị phân huỷ nhanh hơn khi ở trạng thái
dung dịch. Sản phẩm phân hủy là vanillin, vanillic acid, ferulic aldehyde, ferulic acid.
Cur có thể bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng ngay cả khi có mặt oxi và không
oxi.
- Không có oxi, Cur có thể bị vòng hóa.
- Khi có mặt oxi và ánh sáng, Cur phân huỷ tạo thành 4-vinylguaialcol và
anilin.

10
c. Phản ứng cộng H
2

Trong phân tử Cur có nối đôi trong mạch cacbon nên có thể phản ứng với 1, 2

hoặc 3 phân tử H
2

tạo thành các dẫn xuất dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin và
hexahydrocurcumin, khi có mặt xúc tác kim loại hay oxit kim loại (Ni, PtO
2
) tương
ứng (hình 2.5), các
sản phẩm này cũng là các chất kháng oxy hoá [15].
+ H
2
Ni (PtO
2
)
OHHO
OCH
3
H
3
CO
OHO

n = 1: dihydrocurcumin
OHHO
OCH
3
H
3
CO
OHO

.

.
n = 2: tetrahydrocurcumin
OHHO
OCH
3
H
3
CO
OHO


n = 3: hexahydrocurcumin
OHHO
OCH
3
H
3
CO
OHO


Hình 2.5: Phản ứng cộng H
2
của Cur [5]

d. Phản ứng imine hóa
Cur là hợp chất diketone nên có thể cho phản ứng với các amin bậc nhất
(RNH

2
), hydroxylamine (NH
2
OH), hydrazine (NH
2
-NH
2
), semicarbazide

11
(NH
2
NHCONH
2
) … tạo các dẫn xuất imine (base Schiff) hoặc dẫn xuất imine tương
ứng [2,3,16,17].

Cơ chế phản ứng imine hoá

RC
O
Y
R'NH
2
RC
O
-
Y
+NH
2

R'
± H
+
RC
OH
Y
NHR'
carbinolamin
RC
OH
2
Y
NHR'
RCY
NH R'
H
2
O
RC
NR'
Y
H
3
O
+
H
+
H
3
O

+

Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá [16]
Giai đoạn đầu của phản ứng là sự tấn công của đôi điện tử tự do trên nguyên
tử nitrogen của amine vào nguyên tử carbon mang một phần điện tích dương của nhóm
carbonyl. Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân thông thường, hình thành
hợp chất trung gian chứa đồng thời hai nhóm chức anion alkoxide và cation
ammonium. Hợp chất trung gian này chuyển hoá nhanh thành sản phẩm trung gian
bền hơn là carbinolamin. Phản ứng này cần một lượng nhỏ acid làm xúc tác, giúp cho
cân bằng chuyển dịch về phía tách nước từ hợp chất trung gian carbinolamine, sinh
ra dạng proton hoá của imine hoặc các dẫn xuất của imine. Cuối cùng là giai đoạn
tách proton, hình thành sản phẩm là imine hoặc các dẫn xuất của imine [2,16].
Trong cơ chế của phản ứng imine hoá, pH của môi trường đóng vai trò quan
trọng. Nếu môi trường phản ứng quá acid, toàn bộ amine bị proton hoá. Các amine
bị proton hoá không có tính ái nhân nên chúng không ph
ản ứng với các nhóm ketone.
Ngược lại, giảm môi trường acid sẽ làm giảm quá trình tách nước tạo imine. Điều
kiện pH thích hợp cho phản ứng imine hoá là khoảng pH~4.5 [17]. Hình 2.7 mô tả sự
phụ thuộc của tốc độ phản ứng giữa acetone và hydroxylamine vào pH môi trường
phản ứng.
Hìn
hyd
xuất i
nghiên
Cur. C

nh 2.7: S
droxylamine
Cur cũng
imine, Cur

n cứu tổng
Cơ chế của
H
3
C
H
3
C
Hìn

ự phụ th
u
e vào
pH
m
là hợp ch
còn có thể
hợp các h
các phản ứ
HO
CO
HO
CO
nh 2.8:

Cấu
uộc của t
môi trường [
hất β-diketo
ể tạo các hợ

hợp chất dị
ứng này tươ
Isoxa
Pyra
trúc của dẫ
ốc độ phả
[17].

one nên ng
ợp chất dị v
vòng của C
ơng tự như p
NO
azole curcum
NHN
azole curcum
ẫn xuất isox
ản ứng (k
goài khả nă
vòng khác
Cur như dị
phản ứng im
min
min
xazole và py

k
obsd
) gi
ữ

ăng tạo các
nhau. Hiện
ị vòng pyra
mine thông
OH
OC
H
OH
OC
H
yrazole Cur
ữa acetone
c imine và
n nay có mộ
azole, isoxa
thường [4]
3

3

r [18].
và
dẫn
ột số
azole
.

13
e . Phản ứng tạo phức
Cur với cấu trúc diketon trong môi trường acid hay trung tính nằm dưới dạng

hỗ biến keto-enol đối xứng và ổn định, làm cho Cur có khả năng tạo phức mạnh với
nhiều ion kim loại khác nhau như : Zn
2+,
Sn
2+,
Al
3+,
Cu
2+,
Ni
2+,
Fe
3+
...[4].
CH
R R
O O
H
H
C
R R
O O
H

Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch [5]
Các ion kim loại này hấp thu các cặp electron trong nguyên tử oxy của phân tử
Cur để tạo phức. Phức ion-kim loại không bền ở nhiệt độ cao và khi tiếp xúc với ánh
sáng trong thời gian dài. Một ion kim loại có thể tạo phức với một hay nhiều phân tử
Cur.
O O

H
3
CO
HO
OCH
3
OH
M
OO
OCH
3
OH
H
3
CO
HO

OO
OCH
3
OH
H
3
CO
HO
M
HOH OCOCH
3

Hình 2.10: Phức Cur với kim loại [5].