CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÂY CHUY ỂN GEN Ở MỨC ĐỘ PHÒNG THÍ NGHIỆM

1

MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học hiện đại sử dụng kỹ thuật di truyền đã đóng góp đáng
kể trong việc cải tạo năng suất chất lượng cây trồng. Hiện nay có rất nhiều cây
trồng là sản phẩm của công nghệ sinh học được thương mại trên thế giới đã
khẳng định tiềm năng và khả năng phát triển của lĩnh vực này. Trong các kỹ
thuật ứng dụng công nghệ sinh học vào nâng cao năng suất, chất lượng giống
cây không thể không kể đến kỹ thuật chuyển gen thực vật.
Ngày nay kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng rộng rãi trong việc
chuyển các gen hữu ích vào cây trồng tạo ra các cây trồng có nhiều ưu điểm
vượt trội hơn hẳn so với loài ban đầu. Trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến
năm 2005, tỷ lệ diện tích trồng cây chuyển gen ở các nước đang phát triển đều
tăng hàng năm, từ 1,7 triệu hecta (1996) lên 90 triệu hecta (2005) chiếm hơn 1/3
diện tích đất trồng cây nông nghiệp. Điều này cho thấy ngày càng có nhiều nông
dân tại các nước phát triển và đang phát triển chấp nhận và trồng cây chuyển
gen. Số nước trồng cây biến đổi gen đã tăng gấp 3 lần trong vòng 9 năm (từ 6
nước năm 1996 đến 21 nước năm 2005) (James, 2007).
Kỹ thuật chuyển gen thực vật cho phép đưa một hoặc nhiều gen có đặc
điểm ưu việt từ những loài có thể rất khác nhau về di truyền vào bộ gen của cây
nhận trong một thời gian ngắn. Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật
đã được thử nghiệm tuy nhiên hiện nay 2 phương pháp được sử dụng rộng rãi
hơn cả là chuyển gen bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefacien. Chuyển gen thông qua vi khuẩn có ưu điểm
dễ tiến hành, khả năng chuyển nạp cao và tiết kiệm chi phí vì vậy nó được tiến
hành ở hầu khắp các phòng thí nghiệm. Có nhiều quy trình chuyển gen đã được
xây dựng cho rất nhiều các loại cây trồng khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoai
tây, mía, sắn… Một quy trình chuyển gen thực vật bao gồm các bước chính sau:
(1) Phân lập gen mong muốn từ một sinh vật bất kỳ; (2) Tạo dòng và thiết kế
vector chuyển gen mang đoạn gen mong muốn đó; (3) Biến nạp vector chuyển
gen vào thực vật nhận và (4) Chọn lọc, phân tích biểu hiện của gen chuyển.

Chuyển gen được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được
dung hợp vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào
chủ; (iii) gen chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau, trong mỗi thế hệ
2

sản phẩm của gen chuyển cũng phải được biểu hiện; và (iv) sản phẩm biểu hiện
của gen chuyển phải thể hiện được chức năng sinh học. Chính vì vậy quá trình
chọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ có thể được thực hiện theo
ba nội dung sau:
(1) Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ (cây mang gen
chuyển);
(2) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu
hiện là mRNA và protein;
(3) Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển.
Mỗi nội dung có các phương pháp, kỹ thuật phân tích tương ứng, phù hợp
và trong thực tiễn có thể tiến hành các phương pháp trong phòng thí nghiệm, nhà
lưới hoặc đồng ruộng. Qua các thế hệ, cần phân tích, đánh giá và xác định đặc
điểm di truyền của gen chuyển (sự di truyền, sự phân ly), phân tích đặc tính di
truyền của cây chuyển gen.

Hình 1. Mô tả các bước tiến hành và phương pháp phân tích cây chuyển gen
3

1. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN Ở
MỨC ĐỘ PHÒNG THÍ NGHIỆM
Việc xác định nguyên liệu thu được từ hệ thống tái sinh sau biến nạp gen
có phải là cây chuyển gen hay không là rất cần thiết và phải tiến hành đầu tiên.
Trước hết, chọn lọc các mô, cây chuyển gen bằng các chỉ thị chọn lọc dựa vào
các gen chỉ thị phải được tiến hành. Sau đó, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi
đặc hiệu của gen chuyển để xác định sự có mặt của gen trong tế bào cây chuyển

gen. Muốn xác định số copy được đưa vào genome cây tái sinh phải thực hiện
phép lai phân tử Southern mà mẫu dò là đoạn gen chuyển được đánh dấu huỳnh
quang còn DNA nhân cao phân tử được tách từ cây chuyển gen. Xác định gen
chuyển có được phiên mã sang mRNA hay không có thể thực hiện bằng RT-
PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển và khuôn là cDNA từ RNA tổng số
của cây cần kiểm tra hoặc lai Northern giữa mẫu dò là đoạn DNA của gen đánh
dấu huỳnh quang và RNA toàn phần của mô cây chuyển gen. Và bước cuối cùng
là xác định gen chuyển có biểu hiện và tạo sản phẩm cuối cùng của nó bằng kỹ
thuật lai Western giữa protein của cây chuyển gen và kháng thể đặc hiệu với
protein đó được tinh sạch từ nguồn khác.
1.1. ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN BẰNG TÍNH KHÁNG CHẤT CHỌN
LỌC
Hầu hết các vector chuyển gen đều được thiết kế hệ thống gen chọn lọc
kèm theo gen đích cho phép sàng lọc các mô, cây mang gen ở giai đoạn sớm
bằng biểu hiện kháng của gen đó với các chất chọn lọc. Các gen chọn lọc có thể
là các gen kháng kháng sinh, kháng thuốc diệt cỏ, gen chỉ thị màu hoặc gen
chuyển hóa các cơ chất chọn lọc.
Thực chất phân tích tính kháng của chất chọn lọc (kháng sinh, chất diệt
cỏ) là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng với chất chọn lọc thông qua
hoạt động của gen chuyển. Chất chọn lọc có thể là kháng sinh như kanamycine
khi dùng gen nptII hay hygromycine khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta
khi dùng gen bar. Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi
biến nạp từ trạng thái đơn bào đến mô sẹo, chồi tái sinh cây hoàn chỉnh hay cây
non gieo từ hạt. Cách thức tiến hành đơn giản: chỉ bổ sung chất theo nồng độ
nhất định vào môi trường nuôi cấy rồi quan sát ảnh hưởng của chất chọn lọc lên
mô hoặc cây. Biểu hiện thường thấy đối với mô không mang gen là mất khả
4

năng tạo lục lạp rồi sau đó chuyển nâu đen và chết (hình 2.1(B)). Còn chồi sẽ
không thể tạo rễ nếu không mang gen chuyển mặc dù được chuyển sang môi

trường có nồng độ chất kích thích ra rễ cao vì bộ rễ rất nhạy cảm với chất chọn
lọc.


Hình 1.1. Mô sẹo của cây cao lương chuyển gen (A) và đối chứng (B) trên môi
trường có chất chọn lọc (Tuong Van Nguyen, 2008)
Phương pháp thử tính kháng đối với các chất chọn lọc còn được phát triển
thành phương pháp tạo vết cháy trên lá. Chất chọn lọc được sử dụng với nồng
độ cao hơn khoảng 2 – 5 lần so với thử in vitro và thường bổ sung thêm Twin 20
để tăng khả năng bám dính bề mặt sau đó dùng bút lông quét lên lá của cây cần
thử, cũng có thể dùng một sợi chỉ bông kích thước lớn hơn chỉ bình thường,
thấm dịch thuốc rồi vắt sợi chỉ qua nhiều lá của nhiều cây. Sau 3 – 5 ngày có thể
thấy nơi bôi thuốc hoặc sợi chỉ vắt qua trên các cây không mang gen kháng
thuốc hình thành các vết trắng hoặc nâu trên mặt lá do bị mất diệp lục. Để đảm
bảo chính xác phương pháp này thường được tiến hành lặp lại 2 – 3 lần.

(a)
(b)
Hình 1.2. Thử tính kháng kanamycin của bông chuyển gen bằng tạo vết cháy trên
lá (Lê Trần Bình, 2008). (a) bông chuyển gen; (b) đối chứng
5

Ngoài ra, Việc đưa một gen chỉ thị mã hóa cho một enzyme trong vector
chuyển gen cho phép dễ dàng nhận biết mẫu mang gen khi nhuộm bằng chất
màu. Hệ thống GUS (gus, gusA và uidA) mã hóa cho protein β-glucuronidase -
một phân tử homotetramer lần đầu tiên được phân lập từ E. coli (Jefferson et al.,
1986). β-glucuronidase thường
được sử dụng làm chỉ thị chọn
lọc để nhận biết cây chuyển
gen bởi ưu điểm dễ nhận biết

thông qua nhuộm màu, phản
ứng có độ nhạy và ổn định cao
đồng thời dễ tiến hành định
lượng. Ngày nay, việc sử dụng
GUS trong chuyển gen thực
vật ngày càng được tiến hành
rộng rãi. Nhất là trong những
thí nghiệm khảo sát quy trình
chuyển gen vào một giống cây mới (Đỗ Tiến Phát và cs, 2008; Lopez et al.,
2004).
Ngay sau khi GUS được đưa vào thử nghiệm trong nhận biết cây chuyển
gen, nó nhanh chóng được phát triển thành hệ thống chỉ thị cho nhiều đối tượng
chuyển gen thực vật (Jefferson et al., 1987) vì ngoài tính nhạy và bền của
enzyme nó còn dễ dàng thực hiện bằng các kỹ thuật khối phổ, so màu và phân
tích tế bào học. Hơn nữa hầu như không có hoặc rất ít hoạt động của GUS được
ghi nhận ở hầu hết mô thực vật bậc cao (Jefferson et al., 1987, Hu et al., 1990;
Kosugi et al., 1990; Muhich, 1998).
Trong thực vật GUS hoạt động như một gen hỗn hợp nhờ một promoter
khởi động quá trình sao mã của trình tự uidA và điều chỉnh biểu hiện gen. Sự
biểu hiện của gen sẽ được nhận diện bởi một chất có tên là 5-bromo-4-chloro-3-
indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) hoặc 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide
(MUG) trong thời gian ngắn. Một vài hạn chế đã được ghi nhận trong và sau khi
xác định hoạt động của GUS trong mô chuyển gen đó là: hoạt tính nền (Hu et
al., 1990; Thomasset et al., 1996), thường do sự khuếch tán các sản phẩm phản
ứng hoặc hoạt động của chất nội sinh; Tính tự phát sáng (Thomasset et al.,
1996), dập tắt hoặc im lặng (Serres et al., 1997) hoặc sự nhiễm khuẩn.


Hình 1.3. Biểu hiện gen GUS trong mô bông
chuyển gen (A) và đối chứng không chuyển gen

(B) (Đỗ Tiến phát và cs., 2008)
6

Gần đây, một hệ thống chọn lọc khác được xem là “tích cực” có thể thay
thế hệ thống chọn lọc dựa trên kháng sinh, chất diệt cỏ… bởi chất được sử dụng
trong chọn lọc bản thân không gây độc cho thực vật và hoàn toàn không có hoạt
động sinh học. Trong hệ thống chọn lọc tích cực, gen mã hóa một hoặc một số
enzyme sẽ được đưa vào vector chuyển gen và cho phép các thực vật chuyển
gen sử dụng các hợp chất chọn lọc trong môi trường để sinh trưởng, những tế
bào không mang gen không sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất chậm trên môi
trường có chất chọn lọc. Một ví dụ về hệ thống chọn lọc tích cực được cung cấp
bởi Joersbo và Okkels. Nghiên cứu này đã thử nghiệm với cây thuốc lá chuyển
gen mã hóa β-glucuronidase bằng biến nạp gen vào lá thông qua Agrobacterim
tumefaciens. Chất cytokinin glucuronide được cung cấp dưới dạng một cơ chất
và bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Chỉ những tế bào biểu hiện GUS mới có
thể chuyển hóa cytokinin glucuronide, những tế bào này có thể tăng sinh và biệt
hóa thành rễ trong khi những tế bào không có hoạt động của GUS không có hiện
tượng này (Joersbo & Okkels, 1996). Rất nhanh sau đó, hệ thống chọn lọc tích
cực trong chuyển gen được phát triển không chỉ sử dụng cơ chất liên quan đến
hormone thực vật mà cả những chất như nguồn carbonhydrate và nitơ, những
chất cần thiết trong nuôi cấy mô.
Hệ thống chọn lọc sử dụng carbonhydrate là một trong những hệ thống
chọn lọc tích cực phổ biến và dễ dàng nhất bởi vì thực vật sinh trưởng trên môi
trường nuôi cấy đòi hỏi sự có mặt của nguồn carbon. Hơn nữa, hầu hết nguồn
carbon thường dễ kiếm, rẻ và có thể thu nhận từ nhiều nguồn như sucrose,
glucose và maltose. Nếu đưa một nguồn carbon thay thế cho carbon thực vật vẫn
sử dụng vào trong môi trường, trong phần lớn các trường hợp nghiên cứu, tế bào
thực vật sẽ không có khả năng phát triển và chết do các hợp chất sẽ được chuyển
hóa và tạo sản phẩm trung gian làm thực vật nuôi cấy không thể sử dụng để phát
triển. Ví dụ khi manose được dùng làm chất chọn lọc nó sẽ nhanh chóng được

chuyển hóa thành manose-6-phosphate (M6P), một chất thực vật không thể hấp
thụ chuyển hóa, bởi hoạt động của hexokinase. Trong trường hợp này, nếu thực
vật có mang gen manA của E.coli mã hóa cho phosphomanose isomerase (PMI)
thì PMI sẽ chuyển hóa M6P thành fructose-6-phosphate. Hệ thống chọn lọc
PMI đã được triển khai hiệu quả khi tiến hành chuyển gen vào củ cải đường,
ngô, lúa, lúa mì, Arabidopsis (Joersbo et al., 1998; Negrotto et al., 2000; Wang
et al., 2000; Wringht et al., 2001; Lucca & Potrykus, 2001) và rất nhiều thực vật
7

hai lá mầm cũng như một lá mầm khác. Hiện nay, cả hai hệ thống chọn lọc tích
cực và không tích cực đều được sử dụng trong chuyển gen thực vật (Brasileiro
& Aragao, 2001).
Phương pháp chọn lọc, phân tích cây chuyển gen bằng các chất chọn lọc
mặc dù dễ thực hiện, chi phí thấp tuy nhiên đây chỉ là phương pháp sử dụng ban
đầu để loại bớt những cây không mang gen trong quần thể cây tái sinh sau nuôi
cấy vì phương pháp này không cho biết các gen cần chuyển đã được đưa vào cây
hay chưa, các gen đưa vào có hoạt động không… Chính vì vậy cần phải có
những phân tích sâu hơn ở mức độ phân tử.
1.2. PHÂN TÍCH CÂY CHUYỂN GEN BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ
Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tại
trong tế bào chủ ở 3 trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài
dưới dạng một thể plasmid độc lập tự nhân và (3) ổn định như một đoạn DNA
của genome trong tế bào chủ và được nhân lên theo dạng tương hợp hay không
tương hợp. Đây là trạng thái mong muốn nhất khi tạo cây chuyển gen vì tính bền
vững của thể biến nạp, nhưng nó hoàn toàn phụ thuộc vào quá trình tái tổ hợp.
Hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thuộc nhân vẫn có thể phát hiện thấy hiện
tượng nhân không tương hợp đối với gen lạ khi hòa đồng vào DNA nhân do vị
trí đoạn gen lạ được ghép nối ảnh hưởng đến biểu hiện của chính nó hay gen chủ
gần đó. Chính vì thế, các phương pháp sinh học phân tử nhằm xác định sự có
mặt của gen và biểu hiện của gen đó trong tế bào là bước làm rất cần thiết.

1.2.1. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase chain reaction) được Kary B Mullis phát hiện ra năm
1983. Đây là phương pháp trong ống nghiệm để tổng hợp các trình tự DNA đặc
hiệu nhờ enzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotide để khuếch đại vùng DNA
quan tâm nằm giữa hai mồi bằng cách lặp lại nhiều chu kỳ với các bước biến
tính 2 mạch DNA khuôn, bắt cặp các mồi và kéo dài các sợi. Kỹ thuật PCR đơn
giản dễ thực hiện với hầu hết các phòng thí nghiệm được trang bị máy PCR.
Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã được biết trình tự vì vậy chỉ cần
sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác
định làm khuôn là có thể tiến hành PCR. Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm
đối chứng, nếu sản phẩm PCR khi điện di có kích thước đúng như dự kiến và
bằng với đối chứng thì mẫu phân tíc được coi là dương tính. Tuy nhiên, PCR
dương tính không đồng nghĩa với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để
8

giải thích sự có mặt của DNA trong mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A. tumefaciens
mang gen chuyển có thể còn tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào của
mẫu phân tích. Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng và được gọi là
dương tính giả. Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính tức
đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ. (2) Gen chuyển tồn tại tự
do trong tế bào chất (có thể biến mất qua sinh sản hữu tính). (3) Gen chuyển
không hoạt động, tức không được phiên mã và biểu hiện ra protein có chức năng
sinh học. Chính vì những lý do trên mà kết quả PCR mới chỉ có giá trị định
hướng ban đầu khi phân tích cây chuyển gen.
Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ ra hữu dụng đối với việc phân tích phát
hiện các mẫu lương thực phực phẩm biến đổi gen (genetic modify origanism-
GMO). Để phục vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát triển còn thành kỹ
thuật multiplex PCR (MPCR) (Matsuoka et al., 2001). Với việc sử dụng đồng
thời nhiều cặp mồi nhận biết các gen khác nhau (promoter, terminator, gen chọn
lọc, gen đích…) trong một phản ứng, MPCR cho phép phát hiện đồng thời nhiều

trình tự đích nếu mẫu có mang các gen đó. Thông thường các cặp mồi được sử
dụng trong multiplex PCR là mồi P35S, TNOS, NPT-II, GUS, EPSPS. Nếu kết
quả dương tính với bất cứ cặp mồi nào thì mẫu cần xác định rất có thể đã được
chuyển gen.
1.2.2. Phƣơng pháp xác định số copy trong cây chuyển gen
Lai Southern để xác định số copy trong cây chuyển gen là phương pháp tin cậy
và thông dụng nhất. Ngoài việc khẳng định sự tồn tại của gen chuyển trong
genome cây nhận thông qua lai DNA tổng số của mẫu phân tích với DNA mẫu
dò nó còn cho biết số lượng bản sao đã được đưa vào cây. Mẫu dò chính là một
đoạn của gen chuyển có kích thước từ 100 – 300 bp được đánh dấu phóng xạ
hay huỳnh quang. Các bước chính trong kỹ thuật Southern bao gồm: (1) tách
chiết DNA tổng số của mẫu cần phân tích; (2) Xử lý DNA tổng số với 1 – 2
enzyme giới hạn mà điểm cắt không nằm trên gen; (3) Điện di trên gel agarose;
(4) chuyển lên màng nitrosocellulose hay còn gọi là blotting; (5) Tổng hợp sợi
DNA mẫu dò có đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang bằng PCR với mồi ngẫu
nhiên; (6) Lai mẫu dò với màng DNA và (7) Hiển thị trên phim X quang và
phân tích kết quả.