Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1

Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
MỤC LỤC
Phạm Khánh Dung ..................................................................................................................3
NỘI DUNG..............................................................................................................................4
I. Tổng quan về bệnh cúm A/H5N1.........................................................................................4
I.1. Khái quát bệnh cúm gia cầm....................................................................................4
I.2. Dịch bệnh cúm A/H5N1............................................................................................4
I.3. Dịch tễ học.................................................................................................................7
I.4. Những hiểu biết cơ bản về virus cúm A/H5N1......................................................10
I.5. Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm typ A và phòng chống bệnh...........................15
II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu........................................................................25
II.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................25
II.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.....................................................................25
KẾT LUẬN............................................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................35
1
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
MỞ ĐẦU
Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm và thuỷ
cầm, đặc biệt là ở gà. Dịch bệnh này do các phân typ khác nhau thuộc nhóm
virus cúm typ A, họ Orthomyxoviridae gây nên (Dybing et al., 2000; Hatta
et al., 2001). Khi dịch bệnh xuất hiện thì rất dễ bùng phát thành đại dịch
nguy hiểm.
Hàng năm trên thế giới có khoảng 10.000- 20.000 người tử vong vì
bệnh cúm, đặc biệt là vụ dịch năm 1918-1919 có khoảng 21 triệu người chết
(Couch, Kasel, 1995). Nhiều công trình đã chứng minh rằng virus cúm typ A
là nguyên nhân gây ra những vụ đại dịch nguy hiểm và điều này được giải
thích bằng khả năng thay đổi kháng nguyên HA- hemagglutinin (H1

đến
H15) và kháng nguyên NA- neuramindaza (N1 đến N9), sự tổ hợp của

những biến thể gen mã hoá cho kháng nguyên HA và kháng nguyên NA tạo
nên những phân typ mới (subtype). Trong các phân typ thuộc cúm typ A cho
đến nay thì phân typ H5N1 có độc lực cao nhất gây chết gia cầm hàng loạt.
Trong những tháng cuối năm 2003 và đầu năm 2004, ở khu vực Đông Nam
Á và Châu Á - Thái Bình Dương đã phải đối mặt với vụ dịch cúm gia cầm
nguy hiểm với qui mô rộng lớn chưa từng có trong lịch sử. Ở nước ta dịch
cúm gia cầm hoành hành đã gây những thiệt hại nghiêm trọng: về kinh tế,
riêng vụ dịch từ cuối năm 2003 dến tháng 3/2004, cả nước ta đã phải tiêu
hủy 43,8. Cúm còn lây sang người với những dấu hiệu trầm trọng và đã gây
ra nhiều ca tử vong. Theo WHO, tính đến tháng 5 năm 2004 ở Việt Nam đã
có 23 trường hợp tử vong do nhiễm virus cúm H5N1. Và đặc biệt là sau
những cái chết gần đây tại Thái Lan, đã có dấu hiệu cho thấy virut cúm gia
cầm có thể lây từ người sang người. Nếu điều này được khẳng định chính
xác thì dịch cúm gia cầm thực sự đang diễn biến đến mức trầm trọng. Cuộc
chiến chống lại dịch bệnh chết người này vì thế cần được đẩy mạnh hơn nữa.
Để phòng chống căn bệnh nguy hiểm này đòi hỏi phải có các biện pháp tổng
hợp như giám sát dịch tễ học, chẩn đoán nhanh, cách ly tiêu diệt mầm bệnh
và tìm ra phác đồ điều trị hiệu quả.
2
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
Kỹ thuật gen được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực của đời
sống: trong y dược học, trong nông – lâm – ngư nghiệp, … Với những kiến
thức đã được học môn Kỹ thuật gen do PGS.TS. Khuất Hữu Thanh giảng
dạy em tìm hiểu đề tài: “Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh
do nhiễm virus H5N1”. Do kiến thức hiểu biết còn hạn chế nên bài tiểu luận
còn nhiều thiếu sót, rất mong thầy có sự chỉ bảo và góp ý giúp cho đề tài
được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 6 tháng 6 năm 2011
Sinh viên thực hiện

Phạm Khánh Dung
3
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
NỘI DUNG
I. Tổng quan về bệnh cúm A/H5N1
I.1. Khái quát bệnh cúm gia cầm
Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh viêm đường hô hấp cấp
tính rất nguy hiểm, với khả năng lây nhiễm cao, có nhiều biến chủng khác
nhau, thích ứng hầu hết với mọi loại vật chủ và có hệ gen luôn biến đổi. Đây
là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân type
khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt
virus (de Wit, Fouchier, 2008). Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ
H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp
(reassortment) giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra
nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác,
virus cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen
(đặc biệt ở gen NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau,
trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Họ
Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, đó là: nhóm
virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus
cúm C (Influenza C); và nhóm Thogotovirus. Các nhóm virus khác nhau bởi
các kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin
(HA), ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở
Thogotovirus là Glycoprotein (GP).
I.2. Dịch bệnh cúm A/H5N1
I.2.1. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới
Virus cúm typ A đã gây ra những vụ dịch kinh hoàng trong lịch sử:
Đại dịch cúm Tây Ban Nha vào năm 1918 đã gây chết trên 20 triệu người,
tiếp theo đó là những đại dịch nhưng ít nghiêm trọng hơn như: đại dịch cúm
1957 gọi là dịch cúm Châu Á do phân typ H2N2 gây nên, đại dịch cúm năm

1968 hay cúm Hồng Kông do phân typ H3N2 gây nên, đại dịch cúm 1977
4
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
gọi là dịch cúm Nga do phân typ H1N1 gây nên. Ba phân typ H1N1, H2N2,
H3N2 đã lan truyền từ người sang người tạo nên những vụ đại dịch gây ra
những tổn thất to lớn về mặt kinh tế và đặc biệt là gây tử vong rất cao.
Tại Hồng Kông, năm 1997 phân typ cúm gia cầm H5N1đã gây nhiễm
18 trường hợp, trong đó 6 ca tử vong. Năm 2003, tại Trung Quốc/Hồng
Kông hai trường hợp được xác nhận nhiễm cúm H5N1 và cả hai trường hợp
này đều chết.
Bản đồ các quốc gia xảy ra dịch cúm A/H5N1 (WHO, tính đến 15/09/2008).
Phần bôi đậm là vùngdịch cúm xảy ra trên gia cầm.
Phần bôi nhạt là vùng dịch cúm chỉ xảy ra trên chim hoang dã.
Từ cuối 2005, cúm A/H5N1, chủ yếu là các chủng virus thuộc phân
dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) bắt đầu lan sang một số
nước vùng Trung Á, trong đó có Nga, rồi tràn ngập Đông Âu và xâm nhập
vào các nước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc- Trung Phi,
đặc biệt Ai Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất (Salzberg,
2007). Nhằm ngăn chặn dịch bệnh lây lan, trong hơn mười năm qua, trên thế
giới đã có hàng trăm triệu gia cầm đã bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho
5
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
ngành chăn nuôi và kinh tế. Đặc biệt, số người nhiễm và tử vong do virus
cúm A/H5N1, mỗi năm một cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúm
gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến
tháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó, 243
trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11%. Việt Nam và Indonesia là các 2
quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 trên
thế giới. Trong số 16 nước có người chết do cúm gia cầm, Inonesia và Việt
Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” có thể cúm A/H5N1 có

được các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành
virus của người.
I.2.2. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng
12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các
tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên
dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia
cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân. Tính đến
nay (tháng 10/2008), dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại
nhiều địa phương trong cả nước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như
sau:
Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 và 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở
các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ
trong vòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 thành trong cả nước. Tổng số gà
và thủy cầm mắc bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17%
tổng đàn gia cầm. Trong đó, gà chiếm 30,4 triệu con, thuỷ cầm 13,5 triệu
con. Ngoài ra, có ít nhất 14,8 triệu chim cút và các loại khác bị chết hoặc
thiêu huỷ. Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và
cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này.
Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17
tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng
11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống
kê trong vụ dịch này là 84.078 con. Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt;
6
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
và 19.950 con chim cút. Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm
A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong.
Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch cúm gà xảy ra
trên 36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y
thống kê là 1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm và 551.000

chim cút). Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ra trong tháng
10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005.
Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho các
đàn gia cầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng chống dịch quyết
liệt, dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam. Mặc dù vậy, đến
06/12/2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó
lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ.
Trong năm 2007, dịch bệnh tái phát tại Hải Dương vào ngày
17/02/2007 và được khống chế sau 1 tháng. Tuy nhiên, đến ngày 01/05/2007
dịch bệnh tiếp tục tái phát tại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh, thành
phố trong cả nước. Theo Báo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp và Phát
triển Nông thôn) đến ngày 10/06/2007 dịch đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố
(Nghệ An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam Định, Đồng Tháp, Hải
Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam,
Hưng Yên, Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ được khống chế hoàn toàn vào
8/2007.
Gần đây, dịch bệnh lại tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc
vào tháng 3/2008. Cho đến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ
bản đã được khống chế trên toàn quốc.
I.3. Dịch tễ học
Dịch cúm diễn ra hàng năm do virus cúm typ A và typ B gây ra
thường diễn ta vào mùa đông. Cả virus typ A và virus typ B có thể đồng thời
lưu hành, song chỉ có một typ hoặc một phân typ là chiếm ưu thế hơn trong
một vụ dịch nhất định. Sự biến thể của virus xuất hiện với một số lượng vừa
7
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
phải cuối một vụ dịch cú thể báo trước sự ưu thế của biến thể này vào vụ
dịch tiếp theo.
Đại dịch cúm diễn ra thường không theo một chu kỳ nhất định, mà xen kẽ
vào là những vụ dịch nhỏ. Người ta nhận thấy chính virus cúm typ A là thủ

phạm gây ra các vụ đại dịch, các virus cúm typ B thường gây ra các dịch khu
vực. Nhiều công trình nghiên cứu đó chứng minh rằng virus cúm typ A cú
khả năng biến đổi không ngừng, tạo ra những phân typ virus mới là nguyên
nhân của các vụ đại dịch cúm. Nguyên nhân của sự biến đổi không ngừng có
thể được giải thích như sau:
Khi cơ thể bị nhiễm virus cúm sẽ sinh không thể chống lại virus ở
mức độ khác nhau. Do vậy virus thay đổi không ngừng để tồn tại.
Virus cúm typ A thích ứng tồn tại trên người và nhiều loài động vật
như vịt, gà, lợn, ngựa, chim… nên các loài này luôn là nguồn tàng trữ virus.
Chính vì vậy, sự lan truyền nội, ngoại loài tạo cơ hội cho các biến chủng trao
đổi gen và tái tổ hợp tạo nên những biến chủng mới.
Bệnh cúm lây trực tiếp từ người sang người bằng đường hô hấp, qua
các hạt nước bọt nhỏ li ti mang rất nhiều virus. Ngày nay các phương tiện
giao thông hiện đại làm cho dịch cúm không những lan tràn nhanh trong
phạm vi địa phương mà còn cả trong phạm vi toàn cầu.
Mọi người, mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với cúm, đặc biệt là trẻ em, lứa tuổi
thanh thiếu niên và phụ nữ mang thai. Người già, người có bệnh mạn tính
đường hô hấp dễ bị nhiễm cúm nặng, có nhiều biến chứng và tỷ lệ tử vong
cao.
I.3.1. Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm A/H5N1
Sinh bệnh học
Virus cúm xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô đường hô hấp thông
qua cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể. Sau khi vào được trong tế bào biểu
mô đường hô hấp, virus nhân lên và phát triển rất nhanh, phá vỡ tế bào để
chui ra và xâm nhập vào các tế bào lành khác.
8
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
Ở niêm mạc đường hô hấp trên, virus cúm bị các yếu tố miễn dịch
không đặc hiệu của cơ thể như dịch mũi họng, dịch phế nang và IgA tiết …
chống lại. Khi virus cúm vượt qua được hàng rào này chúng sẽ xâm nhiễm

vào máu, cuối cùng xâm nhập vào các cơ quan tổ chức.
Triệu chứng lâm sàng
Thời gian ủ bệnh là từ vài giờ đến 21 ngày, các triệu chứng bắt đầu
xuất hiện một ngày sau khi virus phá vỡ tế bào chui ra. Bệnh nhân cúm A có
hiện tượng sốt liên tục trên 38
0
C, đau đầu, đau cơ, ho, đau họng, bệnh nhân
khó thở (nhịp thở lúc chỉ còn 30-40 lần/phút), độ bão hoà oxi giảm, tụt huyết
áp, bạch cầu giảm. Chụp X quang thấy phổi tổn thương nhanh hơn theo từng
ngày, dẫn đến sốc rồi gây tử vong. Những trường hợp nhiễm cúm nặng được
đặc trưng bởi sốt cao, đột ngột và tử vong nhanh với tỷ lệ chết có thể lên đến
100%. Tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều nhất là ở trẻ em, nhưng tỷ lệ nhiễm cúm nặng
và tỷ lệ tử vong cao nhất là ở người già trên 65 tuổi.
I.3.2. Nguồn lây truyền bệnh cúm A/H5N1
Bằng chứng sinh thái học và nguồn gốc phả hệ virus cúm A cho thấy
thuỷ cầm chính là nguồn tàng trữ virus cúm A, từ đó truyền sang các vật chủ
khác như ngựa, lợn, gà, có thể lây sang cả cá voi và chim biển, người. Sau
đó virut gây bệnh và gây dịch ở các loài này và dịch bệnh ở người.
Gà bị nhiễm virus cúm sẽ thải virus cúm qua đường mỏ hoặc đường
phân. Đây chính là nguy cơ lớn gây nhiễm nguồn nước và nguồn thức ăn,
tạo điều kiện cho sự lan truyền virus trong quần thể người và động vật.
9
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
Mối quan hệ lây nhiễm của virus cúm A
I.4. Những hiểu biết cơ bản về virus cúm A/H5N1
I.4.1. Đặc điểm chung của virus cúm typ A thuộc họ Orthomyxoviridae
Họ Orthomyxoviridae được chia làm 4 nhóm:
Nhóm viruscúm typ A
Nhóm virus cúm typ B
Nhóm viruscúm typ C

Nhóm Thogotovirus
Hạt virion có dạng hình cầu, đôi khi ở dạng sợi, đường kính khoảng 80-
120nm, trọng lượng phân tử của một hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton.
Hệ gen là sợi ARN đơn âm, được ký hiệu là ss(-) ARN, kích thước hệ gen
thường 10.000-15.000 nucleotide và có cấu trúc phân thành 8 phân đoạn,
mỗi phân đoạn mã hoá cho một chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên các
protein chức năng của virus. Lõi virus mang vật liệu di truyền và 3
polymerase, PB1, PB2, PB3 đều được gắn với nucleoprotein dạng xoắn
helica, phức hệ này tạo thành nucleocapsid. Bao quanh nucleocapsid là lớp
protein nền (matrix protein), ký hiệu là M
1
, tiếp đó là màng lipid kép có
10
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
nguồn gốc từ tế bào vật chủ. Lớp vỏ virus có bản chất là lipoprotein, bao
gồm những gai mấu có bản chất là protein trần hoặc đã được glycosyl hoá
gắn chặt vào lớp kép lipid nhờ các tương tác kỵ nước, kích thước của những
gai mấu có độ dài 10-14nm, đường kính 4-6nm. Có khoảng 500 gai mấu
chia làm 2 loại: gai HA (hemagglutinin), gai NA (neuraminidase).
a b
a- Hình thái của virut cúm typ A; b- Cấu trúc hạt virion của cúm typ A
I.4.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng
Virus cúm typ A có hệ gen là ss(-) ARN mang 8 phân đoạn, mỗi phân
đoạn mã hoá cho một chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên các protein cấu
trúc hoặc không cấu trúc của virus.
Phân đoạn 1, 2, 3: mã hoá cho các protein PB1, PB2, PB3. Những
protein này có chức năng là các ARN polymerase phụ thuộc vào ARN cần
cho quá trình tổng hợp mARN và ARN hệ gen của virus.
Phân đoạn 4: mã hoá cho protein HA. HA là các gai mấu có bản chất
là glycoprotein, nằm rải rác trên bề mặt của virus cúm gây ngưng kết hồng

cầu và tham gia vào một số chức năng sau: HA khởi đầu quá trình xâm
nhiễm bằng cách gắn vào thụ thể sialic axit trên bề mặt tế bào vật chủ, sau
khi chui vào tế bào sự dung hợp diễn ra để giải phóng ARN vào tế bào chất.
Phân đoạn 5: mã hoá cho nucleoprotein (NP).
11
Nucleocapsid
Lipid envelope
Matrix
protein
RNA
segment
HA
NA
Inllustration of virus
Ion chanel
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
Phân đoạn 6: mã hoá cho protein enzym neuraminidase (NA). NA là
các gai mấu trên bề mặt của virus, có bản chất là glycoprotein, vừa đóng vai
trò là kháng nguyên vừa có hoạt tính enzym. Enzym neuraminidaza phân cắt
liên kết giữa thụ thể sialic axit và HA nhờ vậy đẩy nhanh quá trình lan
truyền của virus trong hệ thống đường hô hấp.
Phân đoạn 7: mã hóa cho chuỗi polypeptide, từ đó tổng hợp nên hai
protein, protein nền (matrix protein)- ký hiệu là M
1
và protein M
2
đóng vai
trò là kênh ion,nằm trên bề mặt của virus. Protein M
1
là loại protein chiếm tỷ

lệ cao nhất trong virion, với chức năng chính là làm ổn định hình thái của
virion. Protein nền này cũng mang kháng nguyên đặc hiệu typ, qua đó được
sử dụng để xác định virus cúm typ A, B, C.
Phân đoạn 8: là gen mã hóa protein không cấu trúc (non structural
protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước
khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP,
nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng
virus sinh ra sẽ bị thiểu năng (Murphy, Webster, 1996; Sekellick et al.,
2000). Độc tính của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non-
structural gen) này được tìm thấy ở biến chủng A/H5N1/97 (Webster, 1998),
trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phần gen có liên quan đến giảm độc
lực (Zhu et al., 2008). NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27.10
3
Da
(trên thực tế là 25.10
3
Da), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của
virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận
chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2,
là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có
khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14.10
3
Da (trên thực tế là 12x10
3
Da), đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm
để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới (Sekellick et al., 2000; Zhu et al.,
2008).
Như vậy, virus cúm A/H5N1 có hệ gen được cấu trúc từ 8 phân đoạn
riêng biệt và không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA, tạo điều kiện
12

Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen/hệ gen
qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen
giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn
đến thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus cúm A mới.
I.4.3. Sự biến đổi tính kháng nguyên HA,NA và sự hình thành các phân typ
mới
Nguyên nhân gây các vụ dịch lớn hay đại dịch thường do những
nguyên nhân chính sau :
Nguyên nhân thứ nhất là do sự biến đổi kháng nguyên trên bề mặt của virus
cúm, có hai hình thức biến đổi kháng nguyên.
Biến đổi nhỏ (antigenic drift): là những thay đổi từ từ trong protein
hemagglutin và neuraminidase khi virus mang những đột biến nhỏ và tiến
hoá qua thời gian để trốn thoát khỏi kháng thể đặc hiệu của cơ thể vật chủ.
Sự tích luỹ từ hai đến ba đột biến sẽ dẫn đến tạo thành một phân typ mới có
thể gây đại dịch lớn.
Biến đổi lớn (antigenic shift): là những biến đổi lớn và đột ngột trong
cấu trúc của protein hemagglutin và neuraminidase dẫn đến sự tạo thành một
phân typ virus mới.
HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt có mức độ biến đổi rẩt cao : có
15 biến thể gen HA (từ H1đến H15) và 9 biến thể gen NA (từ N1 đến N9).
Sự tổ hợp lại của những biến thể gen thường kéo theo một phân typ cúm mới
có khả năng gây nên đại dịch (ví dụ H2N2 năm 1957 và H3N2 năm 1968).
Ngoài ra một nguyên nhân chính nữa đó là do hệ gen của virus cúm typ A
phân đoạn tạo điều kiện cho sự trao đổi gen và sự tái tổ hợp trở lại, khi có
hai phân typ cúm khác nhau xâm nhiễm vào một cơ thể vật chủ.
Hơn nữa là do virus cúm thích ứng tồn tại trên rất nhiều loại vật chủ: người
và các loài động vật như gà, vịt, lợn, ngựa, chim…, nên các loài này luôn là
nguồn tàng trữ virus. Đồng thời tính thích ứng lan truyền nội, ngoại loài tạo
cơ hội cho sự hình thành các tái tổ hợp gen mới, ví dụ: năm 1968, phân typ

13
Kỹ thuật gen và ứng dụng trong phòng chống bệnh do nhiễm virus H5N1
cúm H3N2 ở người là kết quả của sự tái tổ hợp gen H2N2 ở người và H3
của virus trong tự nhiên; H7N7 của hải cẩu có thể do sự tái tổ hợp gen của 2
hay 3 loại virus cúm ở chim; H1N1 và H3N2 phân lập năm 1978 và năm
1989 gây bệnh ở người có cấu trúc protein bề mặt được lấy từ nguồn gen tái
tổ hợp từ H1N1 hoặc H1N2 và 4-6 gen có nguồn gốc từ H3N2.
Các chủng virus cúm phân lập được, được qui định danh pháp theo
trình tự như sau: typ huyết thanh/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời
gian phân lập/loại hình phân typ theo kháng nguyên HA và NA. ví dụ:
A/chicken/Vietnam/HD1/2004(H5N1) là chủng virut cúm typ A phân
lập trên gà tại Việt Nam, ký hiệu chủng là HD1, năm phân lập là năm 2004,
có kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1.
I.4.4. Chu trình sinh sống của virus cúm typ A
Virus xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng cơ chế ẩm bào nhờ tương tác
đặc hiệu giữa kháng nguyên HA và thụ thể là axit sialic trên màng tế bào vật
chủ. Khi pH môi trường trong khoang ẩm bào thấp, sẽ diễn ra sự dung hợp
giữa lớp vỏ lipoprotein của virus và lớp kép lipit của thể endosome, giải
phóng RNP (ARN và các protein PB1, PB2, PB3 được bao bọc bởi
nucleoprotein) vào tế bào chất của tế bào vật chủ, sau đó được chuyển vào
trong nhân. Tại đây chúng sử dụng bộ máy của hệ thống vật chủ và enzym
ARN polymerase phụ thuộc vào ARN do virus mang theo để tổng hợp nên
mARN thông tin, mARN sau khi trải qua cải biến cắt bỏ intron, được adenyl
hoá ở đầu 3’ sẽ được chuyển ra tế bào chất để tiến hành dịch mã tạo các
protein cấu trúc hoặc không cấu trúc, hầu hết các protein được tổng hợp ở lại
trong nguyên sinh chất, số khác lại được chuyển vào trong nhân để tiếp tục
quá trình tổng hợp nguyên liệu di truyền và tham gia vào quá trình bao gói
vật liệu di truyền. ARN đơn âm được chuyển thành ARN đơn dương theo cơ
chế bổ sung, và sợi dương này lại làm khuôn để tổng hợp nhiều ARN đơn
âm mới nhờ ARN polymerase phụ thuộc vào ARN vừa được tổng hợp.

Các sợi ARN hệ gen được tạo thành là một sợi hoàn chỉnh về độ dài,
không được mũ hoá ở đầu 5’ và không được adenyl hoá ở đầu 3’. Sau đó
14