Nghiên cứu, đánh giá chất lượng tinh trùng được lấy từ mào tinh sau bảo quản đông lạnh

Phần I
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngành nông nghiệp Việt Nam hiện nay đã đạt được nhiều thành tựu to
lớn, đó là ngoài việc đáp ứng nhu cầu lương thực cho người dân, còn xuất
khẩu một số lượng lớn lương thực ra nước ngoài góp phần cải thiện và nâng
cao chất lượng cuộc sống của người dân. Ngành chăn nuôi nói chung, chăn
nuôi lợn nói riêng giữ vị trí quan trọng trong sản phẩm nông nghiệp của thế
giới. Trên thế giới chăn nuôi lợn đã cung cấp 40% tổng sản lượng các loại thịt
tiêu thụ hàng năm, thịt trâu bò chiếm 31%, thịt gia cầm chiếm 24%. Ở Việt
Nam thịt lợn chiếm khoảng 76% tổng lượng thịt tiêu thụ hàng năm. Để có
được thành tựu to lớn trên thì bên cạnh việc áp dụng những tiến bộ của nhân
loại trong kỹ thuật chăn nuôi, chăm sóc, dụng cụ, phương tiện chăn nuôi tiên
tiến hiện đại, thì công việc quan trọng hàng đầu góp phần tạo nên thành công
trên là việc nhân và lai tạo giống.
Trong những năm qua, việc ứng dụng khoa học công nghệ vào thực tiễn
sản xuất bước đầu đã thu được những thành tựu quan trọng, chẳng hạn trong
công nghệ sinh học động vật: thụ tinh nhân tạo, cấy chuyển phôi, xác định giới
tính phôi, động vật chuyển gen, đông lạnh tế bào và phôi, nhân bản động vật…
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo đã có từ lâu đời, trong đó kỹ thuật thụ tinh
nhân tạo trên lợn đã mang lại hiệu quả cao cho ngành sản xuất giống cũng
như chăn nuôi ở Việt Nam và trên thế giới. Tuy vậy còn nhiều vấn đề tồn tại
cần được tiếp tục nghiên cứu, đặc biệt là vấn đề khai thác và bảo tồn tinh
dịch. Việc khai thác tinh ở giai đoạn thích hợp sẽ thu được tinh dịch có số
lượng cũng như chất lượng tốt, còn công tác bảo tồn tinh dịch vừa giữ được
1
tinh trùng sống lâu, vừa dễ ứng dụng vào sản xuất.
Đông lạnh tinh dịch gia súc để kéo dài thời gian sống của tinh trùng là
một thành tựu kỳ diệu của kỹ thuật TTNT nói riêng và của sinh học lạnh nói
chung. Bằng kỹ thuật đông lạnh, người ta có thể giữ tinh trùng sống hàng
chục năm, tiến tới việc thành lập ngân hàng gen cho mỗi quốc gia.

Với mục đích mang lại hiệu quả và năng suất cao cũng như nhằm khắc
phục những hạn chế trong kỹ thuật khai thác tinh truyền thống, kỹ thuật thu
lấy tinh trực tiếp từ bao dịch hoàn đã góp phần đáp ứng đáng kể nhu cầu của
thời đại.
Nhưng ở nước ta hiện nay kỹ thuật khai thác tinh trực tiếp từ mào tinh
có được áp dụng rộng rãi hay không và chất lượng của tinh trùng có đảm bảo
yêu cầu kỹ thuật trong thụ tinh hay không. Nhằm mục đích giải quyết những
khúc mắc trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu, đánh giá
chất lượng tinh trùng được lấy từ mào tinh sau bảo quản đông lạnh”
1.2. Mục đích nghiên cứu
Trên cơ sở nghiên cứu một số đặc tính sinh học của tinh dịch lợn nhằm:
- Khảo sát, đánh giá chất lượng tinh lợn được mổ lấy từ mào tinh sau
bảo quản lạnh để phục vụ TTON.
- Từ những kết quả nghiên cứu có thể tìm ra được những ưu điểm và
nhược điểm của phương pháp mới này để khác phục và nâng cao chất lượng
tinh dịch, sư dụng tinh nguồn gốc mào tinh trong CNSS.
1.3. Ý nghĩa đề tài
Đề tài mang ý nghĩa khoa học cũng như thực tiễn,việc nghiên cứu khảo
sát, đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn bảo quản ở -196
o
C trong
ni-tơ lỏng giúp cho việc đánh giá bước đầu hiệu quả cuả phương pháp thu lấy
tinh dịch từ mào tinh, đông lạnh tinh lợn, cung cấp nguyên liệu cho TTON,
tiến tới thành lập ngân hang tinh và phôi động vật đông lạnh, chủ động trong
2
nghiên cứu các kỹ thuật in vitro.
3
Phần thứ hai
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Các phương pháp bảo quản tinh lợn

2.1.1. Tình hình đông lạnh tinh trùng
Phương pháp TTNT đã có từ những nằm 1776 do tu sĩ Lazzaro
Spallanzani áp dụng cho thú vật và đã thành công mỹ mãn. Ngày nay, ở Mỹ
có khoảng 95% súc vật được TTNT, trong đó đối với lợn khoảng 50%,và đạt
được tỷ lệ 80% lợn đẻ 10 con trên lứa, nhưng công nghệ sinh sản chỉ thực sự
bắt phát triển những năm 1950 khi khoa học thành công trong việc đông lạnh
tinh dịch bò ở -79
o
C(trong CO
2
) để thụ tinh với bò cái (Polge và Rowson,
1952). Hai tác giả người Anh này dã tìm ra Glyxerin để có thể đông lạnh vĩnh
cửu tinh trùng (Trần Tiến Dũng vcs, 2002).
Có thể hiểu: bảo quản lạnh là quá trình mà các tế bào hoặc toàn bộ mô
được bảo quản ở nhiệt độ lạnh âm sâu, như 77K hay -196
o
C(điểm sôi của
Nitơ lỏng). Ở nhiệt độ đó, mọi hoạt động sinh học (trong đó có phản ứng sinh
hóa) dẫn đến làm chết tế bào đều ngừng lại.
Thay đổi chủ yếu trong việc dự trữ tinh trùng xảy ra vào những năm
1950 khi chuyển từ dự trữ trong CO
2
rắn ở -79
o
C sang dự trữ trong nitơ lỏng
ở -196
o
C.
Năm 1960, người ta đã thành công trong việc bảo quản tinh dịch trong
nitơ ở -196

o
C có thể giữ khả năng thụ thai của tinh trùng hàng chục năm sau.
Kết quả này đã tạo tiền đề cho những nghiên cứu về đông lạnh tinh sau này,
trong đó những tổng kết về quả về bảo quản lạnh tinh trùng các loài động vật,
bao gồm việc mô tả kỹ thuật và kết quả thụ tinh đối với trâu bò (Vishwanath
va Shannon, 2000), cừu (Salamon và Maxel, 2000), lợn (Jonhson vcs,2000),
4
dê (Seboeuf vcs, 2000), ngựa (Ecot vsc, 2000) gần đây đã được xuất bản.
Sự đông lạnh tinh trùng đã được thực hiện cách đây hơn 30 năm và kết
quả được thể hiện ở con cháu đang sống của chúng sau khi tiến hành thụ tinh
ở voi Fallope, tuy nhiên, kỹ thuật đông lạnh hiện nay vẫn đem lại sản lượng
thấp vì sự dung nạp của tinh trùng khi đông lạnh là thấp. Chúng ta biết là khả
năng xâm nhập vào trứng của cả tinh trùng tươi và tinh trùng đông lạnh- giải
đông là khác nhau phụ thuộc vào lợn đực được khai thác tinh. Vì những lý do
sinh lý học của tinh trùng nên khó khăn trong việc kiểm soát sản phẩm phụ
trong quá trình bảo quản lạnh tinh trùng lợn. Tuy nhiên, bảo quản lạnh tinh
trùng lợn là nguồn lực chính trong việc bảo tồn nguồn gen lợn.
Theo K. Kikuchi vcs (1998) đã công bố kết quả nghiên cứu về khả năng
thụ tinh ống nghiệm của tinh trùng lợn được khai thác từ mào tinh và được
bảo quản lạnh ở 4
o
C.
2.1.1.1. Cơ sở khoa học xây dựng môi trường pha loãng bảo tồn
Ivanov (1999) khẳng định: tinh thanh không tham gia thụ tinh mà chức
năng sinh học của tinh thanh là nuôi dưỡng, hoạt hóa tinh trùng, hoạt hóa
đường sinh dục cái. Ông cho rằng có thể thay thế tinh thanh bằng môi trường
nhân tạo và ý niệm này đã đặt nền móng cho việc điều chế, chế tạo môi
trường pha loãng tinh dịch mà ngày nay sử dụng rất phổ biến.
Một số đặc điểm lý hóa học cơ bản của tinh dịch chính là thể hiện đòi
hỏi về điều kiện sống của tinh trùng ngoài cơ thể. Do vậy việc tổng hợp môi

trường cần thỏa mãn tối ưu các yêu cầu cơ bản đó.
2.1.1.2. Nguyên tắc cơ bản của MTPLBT tinh dịch lợn
- Áp lực thẩm thấu của môi trường phải tương đương áp lực thẩm thấu
của tinh dịch.
- pH của môi trường phải tương đương hoặc thấp hơn 1 chút so với pH
tinh dịch.
5
- Môi trường phải có năng lực đệm.
- Môi trường tổng hợp phải đảm bảo đầy đủ các chất dinh dưỡng cần
thiết cho sự sống và trao đổi của tinh trùng.
- Môi trường phải có tỷ lệ các chất điện giải/ chất không điện giải thích hợp.
- Tỷ trọng của môi trường phải tương đương tỷ trọng của tinh dịch.
- Độ nhớt của môi trường phải tương đưng độ nhớt tinh dịch.
- Môi trường phải đảm bảo vô trùng tuyệt đói.
- Môi trường phải có điểm sôi, điểm đông đặc, điểm bốc hơi phải tương
đương hoặc thấp hơn môi trường tinh dịch.
- Môi trường phải thả mãn tính kinh tế và thực tiễn nghĩa là giá thành rẻ
và dễ ứng dụng trong sản xuất.
2.1.1.3. Các chất cấu tạo nên môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch
- Chất đường: cung cấp chất dinh dưỡng cho tinh trùng sống và vận
động, còn có tác dụng bảo vệ màng tinh trùng, tránh hiện tượng tinh trùng bị
tụ dính.
Milovanov (1962), Salisbury (1978), Xecduc (1970)…sử dụng đường
Glucose trong môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch lợn.
Ngoài đường Glucose có thể sử dụng đường Fructose, Sacarose để pha
chế tinh lợn.
- Chất muối: có vai trò duy trì áp lực thẩm thấu cho tinh trùng và có tác
dụng đệm để ổn định pH môi trường. Các nhà khoa học thường dùng muối
Natricitrat, Natrikalitartrat (Nguyễn Văn Hưởng 1976; Xecduc 1970).
Muối Trilon B (tên khác: EDTA-B

2
, complexon-3, Selecton II, Titon
(Na
2
H
2
Y
-
, M = 372,24) nhờ muối này môi trường sống của tinh trùng trở nên
vô độc, kéo dài thời gian sống của tinh trùng. TrilonB lần đầu tiên được
Voloxievich (1962-1963) (Dương Đình Long, 1996) dung để bảo tồn tinh
dịch lợn ở 0
o
C. Cơ chế tác dụng của muối này: H
2
Y
2-
sẽ tạo phức càng cua với
6
các ion kim loại nặng Ca
2+
, Mg
2+
trong tinh dịch, tác dụng như chất rửa sạch
môi trường.
- Chất kháng sinh: tập đoàn vi sinh vật phát triển rất nhanh trong tinh
dịch làm thay đổi đặc điểm lý hóa môi trường sống của tinh trùng và cướp
chất dinh dưỡng làm tinh trùng bị chết nhanh chóng. Bổ sung chất kháng sinh
vào môi trường là hết sức cần thiết. Tuy nhiên, các chất kháng sinh đó về định
tính và định lượng phải vô hại với tinh trùng. Dựa vào cơ chế tác dụng và phổ

tác dụng của kháng sinh đối với các loại vi khuẩn, trong môi trường pha loãng
bảo tồn tinh dịch lợn người ta thường bổ sung các chất kháng sinh penicillin,
streptomycin, tetracycline… Hỗn hợp penicillin và streptomycin được sử
dụng rộng rãi để bảo tồn tinh lỏng cũng như tinh đông lạnh.
- Chất đông lạnh: Ở nhiệt độ thấp, quá trình sống và vận động, trao đổi
chất của tinh trùng bị ức chế nên kéo dài được thời gian sống của tinh trùng
ngoài cơ thể. Song nhiệt độ thấp dễ làm tinh trùng bị sốc lạnh. Nguyên sinh
chất của đầu tinh trùng bị “thủy tinh hóa” làm cho chúng bị gãy cổ đứt đuôi.
Để bảo tồn tinh dịch ở nhiệt độ thấp, hay bảo quản lạnh cần bổ sung vào môi
trường chất chống lạnh cho tinh trùng.
Lòng đỏ trứng gà: chứa nhiều Lecitine (7%) là 1 lipoit có tác dụng bảo
vệ tinh trùng, chống lại hiện tượng sốc lạnh, và cũng để tăng độ nhớt, tăng độ
dinh dưỡng cho môi trường. Lecitine có khả năng chống lạnh cho tinh trùng
là do cấu trúc phần tử của nó có 1 phần ưa nước và 1 phần kị nước, phần ưa
nước bị hydrat hóa, phần kị nước không bị hydrat hóa và liên kết với nhau tạo
thành 1 hệ lưới vi thể trong dung dịch làm giảm hệ số tăng nhiệt trong môi
trường. Do đó mà tinh trùng đỡ bị sốc do nhiệt độ (Trần Tiến Dũng vcs,
2002). Vì vậy, lòng đỏ trứng không thể thiếu trong môi trường đông lạnh tinh
dịch (môi trường phối hợp sẵn Laicifot, Baier, môi trường sữa, môi trường
Polge 1970).
7
Glyxerin: đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của kỹ thuật
đông lạnh tinh dịch nói riêng và công nghệ sinh học lạnh nói chung. Khi đông
lạnh tinh dịch ở nhiệt độ lạnh sâu thì các phân tử Glyxerin không bị kết tinh,
do đó tinh dịch đông lạnh không tăng về thể tích, không “thủy tinh hóa”. Khi
giải đông các tế bào lại hồi phục sự sống sau “ ngủ đông”.
Glyxerin trong nước làm thay đổi tính chất vật lý của nước, đặc biệt là
làm tăng nhiều giá trị của độ tăng phí điểm và độ hạ băng điểm của dung dịch
so với dung môi, nghĩa là với sự có mặt của Glyxerin thì hệ số truyền nhiệt bị
giảm đi nhiều. Hơn nữa Glyxerin còn có tác dụng bảo vệ màng tế bào, ngăn

ngừa hiện tượng mất nước của plasma tế bào, giúp tế bào tránh được hiện
tượng “thủy tinh hóa” nguyên sinh chất trong điều kiện lạnh sâu. Vì vậy việc
phát hiện ra Glyxerin có tác dụng tốt trong vai trò đông lạnh cho tinh trùng là
một gốc quan trọng trong công nghệ sinh học,.
2.1.2. Phương pháp bảo quản lạnh tinh trùng
2.1.2.1. Đông lạnh tinh từ dịch tinh xuất ra ngoài
- Năm 1949, tinh trùng được bảo tồn lạnh lần đầu tiên bởi nhóm các
nhà khoa học do Polge lãnh đạo.
Nền tảng của bảo tồn tinh trùng đã có hơn nửa thế kỷ trước đây bằng
việc phát hiện ra những tác nhân có tính chat bảo vệ trong lòng đỏ trứng khi
làm lạnh (Phillip vcs, 1940) và Glyxerol để đông lạnh tinh trùng gà và trâu bò
(Polge vcs, 1952).
Xuất phát từ thực trạng sử dụng lợn đực giống trong những năm qua:
trong khi các nghiên cứu cho thấy tiềm năng khai thác tinh dịch lợn rất lớn
nhưng thực tế cho thấy: việc phối giống trực tiếp gây lãng phí tinh dịch và
hiệu quả kinh tế thấp do 1 đực giống chỉ phụ trách 1 đến 2 lợn nái, kể cả việc
TTNT bằng tinh tươi cũng gặp phải 1 số khó khăn: thời gian giữ tinh dịch
không được lâu, đối với vùng giao thông đi lại khó khăn, việc mua tinh tươi
8
rồi bảo quản, vận chuyển về đến nơi thường mất nhiều thời gian làm giảm
chất lượng tinh dịch, tỷ lệ thụ thai thấp, hơn nữa, TTNT bằng tinh tươi cần
lượng tinh dịch rất lớn (đối với lợn nội là 30ml tinh pha, còn lợn ngoại là 100
ml tinh pha). Còn sản xuất tinh theo liều phối dạng viên hay cọng rạ, bảo quản
đông lạnh ở -196
o
C trong ni-tơ lỏng dùng cho TTNT hoặc IVF, cho phép khai
thác tối đa tiềm năng sinh sản của đực giống tốt, lại bảo quản được rất lâu, nó
còn có ý nghĩa đặc biệt trong việc bảo tồn giống nòi tránh nguy cơ tuyệt
chủng. Chính vì vậy, xây dựng ngân hang tinh, phôi cung cấp tinh cọng rạ cho
IVF và TTNT đã thay thế hầu hết tinh tươi và việc phối giống tực tiếp, tạo ra

bước đột phá trong chăn nuôi nói riêng, CNSH động vật nói chung.
Trong những năm qua, những điều chỉnh kỹ thuật thực nghiệm đã được
đưa vào kỹ thuật bảo quản lạnh tinh trùng với mục đích mở rộng phương pháp
đối với nhiều loài và cải tiến hiệu quả của quá trình đông lạnh.
Tinh trùng của các loài có màng tế bào khác nhau (Cross, 1998), nên
ảnh hưởng của việc làm lạnh đến tinh trùng cũng khác nhau: lợn đực mẫn cảm
nhất, trâu bó, cừu ngựa rất mẫn cảm, chó mèo mẫn cảm có mức độ, thỏ,
người, gà ít mẫn cảm hơn (Parks, 1997). Có thể phòng tránh sốc lạnh trong kỹ
thuật bảo quản lạnh bằng việc kiểm soát tốc độ làm lạnh và bổ sung các thành
phần bảo vệ vào chất pha loãng tinh dịch (Parks, 1997; Foote, 1984). Tốc độ
làm lạnh phù hợp nhất là: đầu tiên nhanh để cho nước ở ngoài tế bào đông
lạnh mà không hình thành tinh thể đá trong tế bào, tốc độ đong lạnh tối ưu đối
với tinh trùng dao động theo loài: 1-10
o
C/ phút đối với người, 50-100
o
C/phút
đối với trâu bò (Woelders, 1997).
Theo Holth vcs (2000), ở một số loài, sử dụng liều tinh trùng bảo quan
lạnh dù cao thì cũng đạt được tỷ lệ thụ thai tương đương với sử dụng tinh
tươi: tinh trùng bò bảo quản lạnh phải được phối với liều gấp 2-10 lần so với
tinh tươi để đạt được tỷ lệ thụ thai tương đương. Nhưng tinh trùng đông lạnh
9
cần phải đực phối giống gần với thời điểm rụng trứng để tăng khả năng thụ
thai (Parrish vcs, 1986).
2.1.2.2. Đông lạnh tinh từ mào tinh
a) Khai thác tinh từ mào tinh
*) Cơ sở khoa học
Trong những phương pháp để khai thác tinh thì khai thác tinh từ mào
tinh là một đề cử quan trọng cho việc bảo quản lạnh tinh trùng. Mào tinh là

nguồn cung cấp nguồn gen quan trọng của động vật đực đối với những động
vật đang bị đe dọa tuyệt chủng, cũng như động vật hoang dã hay động vật
nuôi nhốt.
Hơn nữa, đông lạnh- giải đông tinh khai thác từ mào tinh mang lại kết
quả cao hơn trong IVF so với tinh trùng đông lạnh- giải đông khai thác bằng
phương pháp xuất tinh của cùng con lợn. Việc sử dụng phương pháp bảo quản
lạnh tinh trùng khai thác từ mào tinh, thụ tinh ở vòi Fallop hay IVF, kế tiếp là
chuyển phôi (IVF/ET) là những phương pháp có thể hoàn thiện và khắc phục
giới hạn về chất lượng tinh trùng kém. Bởi vì tinh trùng được thụ tinh trong
âm đạo thì cần một lượng lớn và chất lượng tốt. Còn thụ tinh ở vòi Fallop
hoặc IVF/ET yêu cầu tinh trùng có khả năng thụ tinh trong ống nghiệm vì
tinh trùng không ở lại hoặc chỉ ở lại 1 khoảng thời gian ngắn trong đường sinh
dục con cái, (H,Ikeda, K,Kikuchi, I,Noguchi, H,Takeda, 2000, Effect of
preincubation of cryopreserved porcine epididymal sperm). Bản báo cáo đã
nhấn mạnh việc bảo quản lạnh tinh trùng khai thác từ mào tinh là 1 phương
pháp quan trọng cho việc bảo tồn nguồn gen lợn.
*) Kỹ thuật khai thác
- Thu lấy dịch hoàn lợn từ lò mổ
- Mổ dịch hoàn thu lấy mào tinh
- Đầu nhỏ của mào tinh được nối với ống để chứa tinh dịch
10
- Dùng kim cỡ 15 đã bấm đầu nhọn gắn vào lòng ống phia đầu còn lại
của mào tinh
- Dùng xilanh 100ml đã hút đầy không khí gắn vào kim, rồi bơm hết
không khí ra. Khi đó tinh dịch trong mào tinh sẽ được dồn hết về phía ống
chứa tinh. Chúng ta sẽ thu được tinh dịch từ mào tinh.
b) Đông lạnh tinh khai thác từ mào tinh
Sau khi thu được tinh dịch, tỷ lệ % hoạt lực tinh trùng sẽ được đánh giá
dưới ánh sáng kính hiển vi với khả năng chịu nhiệt 37
0

C, độ phóng đại < 200.
Nồng độ tinh trùng trong mỗi đơn vị thể tích được định lượng với phương
pháp đếm trong buồng đếm ThomZeiss.
Môi trường bảo quản đông lạnh được thêm vào bằng cách nhỏ từng
giọt tới khi gần tương đương với lượng tinh dịch (tỷ lệ pha loãng 1:1), sau đó
lắc nhẹ trong vòng 10 đến 15 phút để tinh dịch và môi trường trộn đều với
nhau, và cuối cùng hỗn hợp được cho vào cọng rạ 250µl. Các cọng rạ được
đóng đầy ở nhiệt độ phòng, được gắn miệng bằng nhiệt độ cao, được nhuộm
màu và được đánh dấu riêng với số của con vật và ngày tháng. Cọng rạ được
nhúng chìm trong chậu nước (400 ml) và làm lạnh 1 cách từ từ khoảng 1,9
đến 2
0
C/phút.
Sau 10 phút, cọng rạ đem đông lạnh được để ở -20
0
C trong 15 phút,
mẫu sẽ được làm lạnh thêm bằng cách đặt trong 1 lớp khí ni-tơ lỏng (cách 10
cm phía trên của bình ni-tơ lỏng) trong 10 phút. Sau đó bình đựng cọng rạ
đông lạnh sẽ được đặt trực tiếp vào ni-tơ lỏng. Cần tránh sự biến đổi nhiệt độ
quá nhanh, nên cần thao tác nhanh trong tất cả các bước, (Nguyen Van Hanh,
Quan Xuan Huu, Nguyen Viet Linh, Nguyen Thi Men, Nguyen Thi Uoc, K,
Kikuchi, Takashi Nagai, 2007, Conservation of endangered species semen).
11
2.2. Tình hình đông lạnh tinh tại Việt Nam
Bắt đầu từ năm 1983, Việt Nam đã ứng dụng thành công quy trình mới
về đông lạnh tế bào và phôi động vật, là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp
theo: tạo ra bê từ phôi TTON, xác định giới tính theo đơn đặt hàng từ năm
2002, phân lập tế bào gốc từ phôi và sử dụng tế bào gốc trong nhân bản vô
tính vào năm 2004.
Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu công nghệ bảo quản tinh đông lạnh

lợn Đại Bạch đã thành công, hoàn thiện vào những năm cuối thập kỷ 90 tại
phòng Sinh học tế bào sinh sản, viện Công nghệ sinh học thuộc Trung tâm
Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia (hiện là viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam).
Theo Nguyễn Anh vcs (2004) đã công bố kết quả thực hiện đề tài
nghiên cứu triển khai công nghệ bảo quản tinh đông lạnh lợn Ỉ nhằm bảo tồn
nguồn gen quý hiếm của Việt Nam. Hướng nghiên cứu tiếp theo cho đề tài
này là đánh giá hiệu quả công nghệ bảo quản đông lạnh thông qua kết quả
TTON hoặc TTNT.
Theo Nguyễn Văn Hạnh vcs (2007) đã tiến hành thu lấy tinh dịch từ 1
số động vật quý đang bị đe dọa (khỉ, lợn Bản) để bảo tồn nguồn gen bằng
phương pháp thu lấy tinh từ mào tinh.
Trong phòng thí nghiệm, bảo quản lạnh tinh trùng cho phép sử dụng
các kỹ thuật IVF cho các công nghệ sinh sản hỗ trợ như dùng trong sinh sản
của người, bảo tồn tế bào sinh dục của những loài có nguy cơ tuyệt chủng và
đối với việc sử dụng những gia súc thí nghiệm.
Tuy nhiên ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về tinh bảo quản
lạnh, đặc biệt là tinh lợn vì những khó khăn gặp phải khi nghiên cứu công
nghệ bảo quản so với các loài vật khác: môi trường đông lạnh tinh dịch,
phương pháp đông lạnh tinh, các chất bảo vệ lạnh…
12
2.3. Đặc điểm sinh học tinh dịch lợn
Nghiên cứu về tinh dịch và tinh trùng lợn được bắt đầu từ 1926- 1927
bởi Ivanov (milovanov, 1962). Theo như nghiên cứu, tinh dịch gồm có 2
thành phần: tinh trùng và tinh thành (95-97%).
2.3.1. Tinh trùng
Tinh trùng là tế bào duy trì nhất của cơ thể có khả năng tự vận động
ngoài cơ thể,được sinh ra từ những ống sinh tinh ở dịch hoàn và được giữ lại
ở mào tinh (phụ dịch hoàn).
Tinh trùng của mỗi loài động vật có hình thái khác nhau, đặc trưng theo

loài. Tinh trùng lợn có dạng con nòng nọc gồm 3 phần: đầu, cổ thân, đuôi.
Theo Mioti (1941), Randall (1950), Bonadonna (1953), Hancock
(1957), kích thước các phần của tinh trùng lợn như sau:
Đầu : dài 6,5μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μm
Cổ thân :10-20 μm
Đuôi : 30-40 μm
Dài tổng số : 50-60 μm
Theo Kunitado Sato, Junichi Mori, Hiroshi Masuda (2005) cho biết
kích thước các phần tinh trùng lợn như sau:
Đầu : dài 7,2-7,9μm, rộng 3,6-4,3 μm
Đoạn giữa : 10 μm
Đuôi : 30 μm
Dài tổng số : 49,2-62,4 μm
Theo Niwa vcs (1961):
Đầu : 8,51 μm, rộng 4,21 μm
Dài tổng số : 54,58 μm
- Phần đầu:
Ở lợn, phần đầu tinh trùng có hình tang trống. Trong màng, trên cùng
13
của đầu là hệ thống acrosom. Phần trước của đầu được bao phủ bởi một mũ
mỏng tức bao đầu. Dưới lớp này có cấu tạo hình dải gọi là thể đỉnh (thể
ngọn). Trong bao đầu tập trung nhiều enzim trong đó enzim hyaluronidaza có
vai trò phá vỡ màng phóng xạ của tế bào trứng trong quá trình thụ tinh, Trong
quá trình bảo tồn, hệ thống acrosom rất dễ bị bong ra do các yếu tố áp suất,
nhiệt độ, pH hay do vận chuyển rung động , xóc lắc … làm cho tinh trùng mất
khả năng thụ tinh. Men hyaluronidaza rất dễ bị thấm xuất ra ngoài. Đây là vấn
đề cần nghiên cứu và quan tâm trong quà tình trong quá trình pha chế bảo
quản và sử dụng tinh dịch nhằm nâng cao tỷ lệ thụ tinh. Sau hệ thống acrosom
là nhân tinh trùng chiếm 76,7-80,3% phần đầu tinh trùng, nó là kho duy nhất
chứa mật di truyền của con đực.

- Phần cổ thân:
Phần cổ thân đính với phần đầu rất lỏng lẻo có ý nghĩa trong quá trình
thụ tinh nhưng cũng vì thế nó thế nó dễ bị đứt bởi tác động cơ học, nhiệt, hóa
chất… làm giảm khả năng thụ tinh và tỷ lệ thụ tinh.
Phần cổ thân có cấu trúc 2+9+9 (2 sợi trục trung tâm, 9 sợi vành trong,
9 sợi vành ngoài). Giữa các sợi trục với nhau có mối liên hệ “bắt tay”, còn
giữa các sợi dụng truyền thông tin rất nhanh, truyền năng lượng cho đuôi co
rút vận động.
Ở phần cổ thân còn chứa một lượng ATP lớn có tác dụng cung cấp năng
lượng cho tinh trùng vận động, song nó lại giảm đi rất nhanh, lượng ATP giảm
đi nhanh khi nhiệt độ bảo tồn cao. Do đó, cần phải bổ sung năng lượng vào môi
trường pha chế và bảo quản để kéo dài thời gian sống tinh trùng.
- Phần đuôi:
Đuôi được chia làm 3 phần: đuôi trung đoạn, đuôi chính, đuôi phụ,
cũng có cấu trúc 2+9+9 sắp xếp theo những vòng tròn đồng tâm. Chức năng
chủ yếu của đuôi là giúp cho tinh trùng vận động.
14
2.3.2. Tinh thanh
Là hỗn hợp chất lỏng do các tuyến sinh dục phụ tiết ra cùng với tinh
trùng trong quá trình giao phối. Tinh thanh không cần thiết cho quá trình thụ
thai nhưng lại cần cho tinh trùng hoạt động và chuyển động trong đường sinh
dục con cái. Dịch tiết của mỗi tuyến sinh dục phụ có thành phần hóa học và
chức năng khác nhau:
- Tuyến củ hành:
Tiết ra 1 thứ dịch trong suốt, có mùi đặc biệt, pH trung tính, tác dụng chủ
yếu của dịch tiết này là làm trơn niệu đạo, rửa niệu đạotrước khi phóng tinh.
Trong dịch tiết của tuyến củ hành có chứa một lượng khá lớn hạt thể
selatin (chiếm 20-30% lượng tinh dịch), có bản chất là Anbumonoit đặt
quánh, trong suốt. Khi xuất tinh, các hạt thể này gặp men Vegikinaza của
tuyến tinh nang đông lại tạo thành những thể lớn hơn gọi là keo phèn. Trong

giao phối tự nhiên, keo phèn có tác dụng “ đóng nút cổ tử cung “ không cho
tinh dịch chảy ra ngoài, còn trong TTNT phải chóng loại bỏ keo phèn tránh
làm cho tinh trùng bị kết dính,
- Tuyến tiền liệt:
Tiết ra dịch tiết không trong suốt, có tính kiềm có tác dụng trung hòa
độ axit trong lòng niệu đạo và H
2
CO
3
do tinh trùng sinh ra trong quá trình
hoạt động. Ngoài ra nó còn có chức năng nội tiết: tiết hormon Prostaglandin
có tác dụng tăng co bóp cơ trơn ống dẫn tinh và tăng co bóp cơ trơn tử cung
làm tăng tốc độ di chuyển của tinh trùng vào ống dẫn trứng để thụ tinh.
- Tuyên tinh nang:
Tiết ra chất keo màu trắng hoặc vàng. Chất keo này gặp dịch tiết của
tuyến tiền liệt thì kết lại tạo ra một cái nút để đóng cổ tử cung sau quá trình
giao phối, mục đích không cho tinh trùng chảy ra ngoài. Chất keo này còn co
Glucose, axit béo cùng một số enzim khác để tăng cường dinh dưỡng hoạt lực
cho tinh trùng,.
15
2.4. Quá trình phát triển của tinh trùng
2.4.1. Giai đoạn phát triển
Tế bào phôi nguyên thủy (tế bào tinh nguyên thủy) đều giống nhau ở
con đực và cái. Những tế bào này sản sinh thành tinh nguyên bào, các tinh
nguyên bào này xuất hiện không lâu trước khi thành thục về tính, là những tế
bào lớn hình tròn, có chất nhiễm sắc phân tán rất điển hình, có dạng hạt nhỏ li
ti hay hạt phấn hoa.
2.4.2. Giai đoạn sinh trưởng
Trong giai đoạn này tinh nguyên bào tăng kích thước của nó. Đến cuối
giai đoạn sinh trưởng tế bào phôi được gọi là inh bào cấp I (Cyt I).

Quá rình phân chia gián phân (Mitosis) cho ra những Cyt I với 2n
nhiễm sắc thể (NST). Giai đoạn này xảy ra 15 – 17 ngày.
2.4.3. Giai đoạn thành thục
Đặc trưng của giai đoạn này là số lượng nhất định các lần phân chia tế
bào và đặc biệt là số lần phân chia giảm nhiễm bộ nhiễm sắc (Meiosis) thành
đơn bội (n nhiễm sắc thể).
Phân bào giảm nhiễm ở đây gồm 2 lần phân chia liên tiếp:
- Lần 1: Theo cách phân chia giảm, tạo ra Cyt II với n nhiễm sắc thể,
xảy ra 13 – 17 ngày.
- Lần 2: Theo cách phân chia đều, phân chia NS có sau lần phân chia 1 để
tạo ra tinh tử (tiền tinh trùng). Lần phân chia này xảy ra rất nhanh 1 – 2 ngày.
2.4.4. Giai đoạn biến thái
Tinh tử phải trải qua giai đoạn biến thái:
- Nhân tế bào thu nhỏ và biến thành đầu tinh trùng; phần lớn tế bào chất
dồn về một phía tạo thành phần cổ thân. Một số thể Golgi tập trung ở đầu mút
trước của tinh trùng tạo thành Acrosom, các màng bọc và xoang Acrosom.
16
Cả hệ thống Acrosom cùng với màng nhân và màng ngoài tạo thành mũ
trước chóp của tinh trùng và nối với tế bào Sertoli để nuôi dưỡng tinh trùng.
Hai trung tử thì chuyển động về phía sau nhân, nằm đối diện với Acrosom.
Ở phía sau nhân xuất hiện một chỗ lõm gọi là hố thụ tinh, 1 trung tử sẽ
nằm trong hố đó. Trung tử thứ 2 nằm sau trung tử 1 và là nơi xuất phát cho 2 sợi
trục trung tâm cung với các sợi xoắn khác (fibrin) để tạo thành đuôi tinh trùng.
Các ty thể chuyển ới vùng cổ thân, phần lớn tế bào chất được biến đi
chỉ còn lại 1 lớp mỏng bao quanh miền ty thể và đuôi.
Quá trình biến thái xảy ra trên tế bào dinh dưỡng Sertoli trong lòng ống
sinh tinh, trong khoảng thời gian 14 – 15 ngày. Sau đó chúng trở thành tinh
trùng non và rơi vào trong lòng ống sinh tinh, được đùn đẩy và đưa về phía
phụ dịch hoàn.
2.4.5. Giai đoạn phát dục

Ở phụ dịch hoàn, tinh trùng non tiếp tục phát dục và thành thục. Trong
quá trình di chuyển từ đầu đến cuối phụ dịch hoàn, tinh trùng phải di chuyển
với đoạn đường khá dài (khoảng trên 100m) nằm uốn khúc quanh co. Trong
quá trình này có khá nhiều tinh trùng non bị phân hủy, có thể tới 50%,.
Thời gian di chuyển 14-15 ngày.
2.4.6. Giai đoạn biến đổi hóa học
Chính ở phụ dịch hoàn màng bán thấm Lipoprotein được hình thành
nhờ vách đuôi phụ dịch hoàn. Tinh trùng được dự trữ trong phụ dịch hoàn rất
lâu cho tới khi thành thục hoàn toàn vì ở đây nó có đủ điều kiện sống thuận
lợi. Tế bào vách của phụ dịch hoàn tiết ra 1 chất toan yếu, nồng độ ion N gấp
10 lần so với ở rong lòng ống sinh tinh, trong chất dịch của phụ dịch hoàn có
chứa chất điện giải nhưng ít hơn so với dịch hoàn, nhiệt độ cũng thấp hơn, tất
cả những điều kiện đó làm tinh trùng ở trạng thái không hoạt động, năng
17
lượng tiêu hao giảm thấp hơn, cho nên nó có thể ở đây trên 2 tháng mà vẫn
còn khả năng thụ thai.
2.5. Các chỉ tiêu đánh giá tinh dịch sau khi bảo quản đông lạnh
2.5.1. Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (A%)
Hoạt lực là sức sống (sức hoạt động) của tinh trùng có phương hướng
chuyển động tiến thẳng, A là chỉ tiêu kỹ thuật quan trọng trong việc đánh giá
chất lượng tinh dịch, A cho biết khả năng thụ thai của quần thể tinh trùng
trong tinh dịch (Dương Đình Long, 1996).
Theo Corteel (1977), tinh trùng có hoạt lực tốt thì tỷ lệ thụ tinh cao,
tinh trùng có hoạt lực yếu thì tỷ lệ thụ tinh kém.
Ở phụ dịch hoàn, tinh trùng không được hoạt động, khi ra ngoài cơ thể,
tinh trùng được tinh thành hoạt hóa nên đã được hoạt động với tất cả sức sống
của mình. Tùy theo sức sống mà tinh trùng có, chúng sẽ vận động theo 1
trong 3 phương thức như sau:
- Tiến thẳng : là sự vận động của tinh trùng mà phương của vectơ vận
động ổn định.

- Xoay vòng: là sự vận động của tinh trùng mà phương của vectơ vận
động luôn luôn bị thay đổi.
- Lắc lư : là sự vận động của tinh trùng mà hầu như không có vectơ vận
động, không thay đổi vị trí tương đối của chúng (Trần Tiến Dũng vcs, 2002).
Chỉ tinh trùng vận động tiến thẳng mới có khả năng tham gia vào quá
trình thụ tinh, Theo Milovanov (1962), sức sống của đời sau cũng phụ thuộc
vào sức sống của tinh trùng, Tinh trùng càng nhiều sức sống thì khả năng sinh
trưởng phát dục, sức đề kháng bệnh tất… của đời sau càng cao.
Theo Nguyên Thiện vcs (2005), tinh trùng có các phương thức vận
động: tiến thẳng, vòng quanh, dao động, không hoạt động (chết).
Theo Tổ chức Y Tế thế giới WHO, tinh trùng có các kiểu vận động :
18
0= Không vận động
1= Vận động yếu ớt
2= Vận động chậm
3= Không vận động tiến thẳng về trước
4= Vận động tiến nhanh về phía trước
Các giống lợn ngoại đã cải tiến: Đại bạch, Landrace, Duroc, A= 80-
90%, còn các giống lợn chưa được cải tiến, A nhỏ hơn: 70 – 80%, A thay đổi
theo giống là chủ yếu (Dương Đình Long, 1996).
Theo Nguyễn Lăng (1994), A của lợn Yorshire: 80-90%, Landrace: 70-80%
Theo kết quả nghiên cứu của Đào Đức Thà vcs (2003), A
Landrace
= 72%,
A
yorshire
= 73%.
Trong TTNT cho gia súc, chỉ tinh dịch đạt A ≥ 70% thì tinh dịch đó
mới đủ tiêu chuẩn để pha chế bảo tồn ở dạng đông lạnh (Trần Tiến Dũng vcs,
2002).

Theo tiêu chuẩn nhà nước TCVN 1859/76, A ≥ 70% mới sử dụng để
pha chế bảo tồn (Nguyễn Thiện, Đào Đức Thà, 1998).
Tinh dich bảo tồn phải đạt A ≥ 40-50% (tinh lỏng) và A ≥ 30% (tinh
đông lạnh) mới được sử dụng để dẫn tinh cho gia súc cái.
Các yếu tố: nhiệt độ, khoảng cách lấy tinh, dinh dưỡng, kỹ thuật khai
thác…đều có ảnh hưởng đến A. Nhiệt độ cao làm tinh trùng chết rất nhanh,
nhiệt độ thấp làm cho sức vận động của tinh trùng giảm, thậm chí ngừng vận
động, đây cũng chính là cơ sở khoa học để bảo tồn và đông lạnh tinh.
2.5.2. Nồng độ tinh trùng (C: triệu/ml)
Nồng độ tinh trùng là số lượng tinh trùng có trong 1 đơn vị thể tích tinh
dịch nguyên (chưa pha loãng) (thường tính bằng đơn vị 10
6
/ml hoặc 10
8
/ml).
Nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng tinh dịch,
là chỉ tiêu cơ sở để tính số liều tinh sản xuất. Do vậy ở các cơ sở sản xuất tinh
19
dịch công nghiệp, sản xuất tinh đông lạnh, C là chỉ tiêu kiểm tra thường xuyên.
Theo Nguyễn Tấn Anh, Nguyên Quốc Đạt (1997), C là 1 thông số cần
thiết giúp ta quyết định tỷ lệ pha loãng tinh nguyên với môi trường bảo quản
và định liều phối trong TTNT.
Để pha loãng bảo quản tinh dịch đạt kết quả cao thì tinh dịch phải đạt
yêu cầu:
Theo tiêu chuẩn nhà nước TCVN 1859/76, C lợn ngoại ≥ 80,10
6
/ml,
C lợn nội = 20,10
6
/ml.

Nồng độ tinh trùng lợn thấp hơn các gia súc khác: Milovanov (1962)
C= 10-20,10
6
/ml, cao nhất 100,10
6
/ml; Mann (1954), C
trung bình
=100,10
6
/ml.
Trần Thế Thông vcs (1974) cho biết: C
Đại Bạch
=110-130,10
6
/ml,
C
Landrace
= 120-300,10
6
/ml, C
Ỉ pha
= 30-60,10
6
/ml.
Dương Đình Long (1996), C
Đại Bạch
= 178,8,10
6
/ml, dao động 170-
200,106/ml, C

Landrace
= 167,5,10
6
/ml, dao động 150-190,10
6
/ml, C
lợn Ỉ
=
39,4,10
6
/ml, dao động 21-78,10
6
/ml.
Nồng độ tinh trùng phụ thuộc nhiều yếu tố : giống, tuổi, mùa vụ, chăm
sóc nuôi dưỡng, quản lý…
Nguyễn Thiện vcs (2005) cho biết:
Ở 4-8 tháng tuổi
Lợn nội C= 80-100,10
6
/ml
Lợn ngoại C= 80-100,10
6
/ml
1-2 năm
Lợn nội C= 40-50,10
6
/ml
Lợn ngoại C= 250-300,10
6
/ml

3-4 năm
Lợn nội C= 20-40,10
6
/ml
Lợn ngoại C= 200-250,10
6
/ml
2.5.3. Tỷ lệ sống (Sg: %)
Tỷ lệ tinh trùng sống là chỉ tiêu hỗ trợ đánh giá chất lượng tinh trùng.
Khi tinh trùng chết, màng của nó có thể cho chất nhuộm màu thấm qua, còn
tinh trùng sống thì không bắt màu, Do đó ta có thể xác định được tỷ lệ tinh
trùng sống. Chỉ tiêu này cũng là cơ sở để tính số tinh trùng cần thiết cho một
20
liều phối (Đỗ văn Thu, Nguyễn Anh, Lê Thành Đô, 2003).
Tỷ lệ tinh trùng sống có ý nghĩa quan trọng trong quá trình pha chế,
bảo tồn tinh dịch. Theo Nguyễn Thiện (2005), tỷ lệ sống phải đạt ≥ 80% mới
đạt yêu cầu trong pha chế, bảo tồn tinh dịch.
Theo TCVN 1859/76, tỷ lệ sống chung cho cả lợn nội và lợn ngoại phải
≥ 70% (Nguyễn Thiện, Đào Đức Thà, 1998).
Nguyễn Anh (2004) cho biết lợn Ỉ có Sg = 83,18%, dao động 60-98%.
Tỷ lệ sống phụ thuộc nhiều yếu tố: giống, tuổi, chế độ khai thác, nuôi
dưỡng và quản lý đực giống,
2.5.4. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K: %)
tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình thái học khong bình
thường ở đầu, cổ thân, đuôi. Những tinh trùng này không có khả năng thụ
thai. Đây là chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch.
Những tinh trùng kỳ hình thường dược xuất ngay từ giai đoạn đầu
(Asdell, 1946).
Theo Hafez (1974), K của tinh trùng lợn biến động từ 10-30%.
Còn Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993) cho biết chỉ sỗ này ở lợn Việt

Nam < 20%, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình càng thấp càng tốt, không nên quá 20%.
Quy trình kỹ thuật TTNT lợn của Bộ Nông Nghiệp 1985 và tiêu chuẩn
tinh dịch lợn Việt Nam 1982 cũng quy định K
max
= 16%.
Theo Dương Đình Long (1996), lợn Landrace có K= 6,2% dao động
3- 10,4%, lợn Đại Bạch K= 6,2%, dao động 3-4%, lợn Ỉ K= 4,1% dao động
3 - 5,7%, lợn Móng Cái, K= 4,76% dao ddoongj 4-5%.
Trương Lăng (1994) cho biết lợn Landrace, Yorshire có K= 9,86%.
Đào Đức Thà vcs, 2003 nghiên cứu cho thấy: Landrace K= 4,91%,
Yorshire K=5,81%.
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong tinh dịch phản ánh tình trạng sức khỏe
của con đực, hoạt động sinh dục và đặc biệt là quá trình sinh tinh. Vì vậy nó
21
phụ thuộc tuổi, chế độ nuôi dưỡng, chăm sóc và chế độ khai thác tinh.
Theo Milovanov (1962), có 2 thời kỳ có thê gây kỳ hình cho tinh trùng:
- Ngay trong quá trình sinh tinh, điều này xảy ra đều bắt nguồn từ
những nguyên nhân có liên quan đến bệnh lý.
- Sau khi tinh trùng ra ngoài cơ thể, trường hợp này xảy ra thường có liên
quan với các nhân ngoại cảnh và kỹ thuật không đúng khi kiểm tra tinh dịch.
Theo Hà Văn Chiêu (1999) nếu tinh trùng còn giọt bào tương bám theo
thì tinh trùng đó được coi là kỳ hình và không có khả năng thụ thai. Còn theo
Trần Tiến Dũng vcs (2002), tinh trùng còn giọt nguyên sinh ở cổ thân, đuôi là
những tinh trùng chưa thành thục-tinh trùng non.
Phân loại tinh trùng kỳ hình:
- Kỳ hình ở phần đầu: đầu khổng lồ, đầu bé bất thường, bong xoang
acrosom, 2 đầu.
- Kỳ hình ở phần đuôi: đuôi xoăn, đuôi cuộn, đuôi cong, đuôi gập, 2 đuôi.
Tinh trùng kỳ hình đuôi là chủ yếu chiếm 80%.
2.6. Thụ tinh ống nghiệm bằng tinh bảo tồn lạnh trong Nitơ lỏng -196

0
C
+ Nguyên lý thụ tinh:
TTON là sự két hợp giữa trứng đã nuôi thành thục trong ống nghiệm
với tinh trùng đã được kiện toàn năng lực thụ tinh. Trong kỹ thuật TTON, tế
bào trứng và tinh trùng là nguyên liệu cơ bản đồi hỏi cần có sự chuẩn bị kỹ
càng cùng với các điều kiện nuôi cấy thích hợp.
+ Các giai đoạn của quá trình thụ tinh:
Các giai đoạn của TTON cũng có những điểm tương đồng với thụ tinh
invivo, bao gồm các giai đoạn:
- Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ
- Tương tác của tinh trùng với màng trong suốt
- Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt
- Phản ứng thể đỉnh
22
- Tinh trùng xuyên qua vùng trong suốt
- Sự dung hợp của giao tử đực và giao tử cái
- Sự hoạt hóa tế bào trứng
Để tiến hành IVF cần thực hiện các bước:
- Thu buồng trứng, bảo quản và vận chuyển buồng trứng
- Thu trứng từ các nang trứng
- Nuôi thành thục trứng invitro
- Xử lý tinh trùng (kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng)
- Thụ tinh trứng lợn trong ống nghiệm.
+ Kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng:
Astin (1951) thí nghiệm trên chuột và Chang (1951) trên thỏ khi tiến
hành thí nghiệm thụ tinh bằng tinh trùng trong ống dẫn trứng, cả 2 ông đều
chỉ ra rằng: Các tinh trùng trong tinh dịch khi phóng tinh đều không có khả
năng thụ tinh trực tiếp với trứng mà chúng phải trải qua một thời gian nhất
định trong đường sinh dục con cái để đạt tới khả năng thụ tinh. Chính vì vậy

“kiện toàn năng lực thụ tinh chi tinh trùng” là khâu quan trọng ảnh hưởng trực
tiếp đến kết quả thụ tinh ống nghiệm.
Hiện nay có 1 số phương pháp xử lý tinh trùng được phổ biến:
- Phương pháp bơi ngược dòng (swim-up)
Tinh trùng đông lạnh được giải đông ở nhiệt độ 35-37
o
C trong 1 phút,
Toàn bộ tinh trùng được đưa vào môi trường TALP trong vòng 45-60 phút ở
38,5-39
o
C. Thu lấy phần trên và ly tâm 200xg trong 10 phút. Những tinh
trùng đạt tiêu chuẩn được đưa vào thụ tinh, Kolbe và Holz (1999), bổ sung
NaHCO
3
, Pyruvat, lactate, gluco, BSA, dịch nang trứng, Kanamycine, giữ pH
= 7,8 và đưa vào tủ nuôi 39
o
C, 5% CO
2
, độ ẩm bão hòa trong 90 phút.
- Phương pháp ly tâm (centrifusion)
Tinh trùng đông lạnh được giải đông ở nhiệt độ 35-37
o
C trong 1 phút
và được rửa lại 2-3 lần trong môi trường TCT-PVA bổ sung axit béo – free
23
BSA, đưa vào ly tâm 2 lần, mỗi lần 5 phút, 9000 xg/phút. Tinh trùng thu được
cho vào ống nhựa hình chóp (4ml), để vào tủ ấm 38,5
o
C, độ ẩm bão hòa trong

15 phút đến khi thụ tinh, lúc này tinh trùng đã đủ tiêu chuẩn đưa vào thụ tinh.
+ Phương pháp lọc qua phân lớp Percoll (gradient percoll)
Tinh trùng đông lạnh được giải đông trong nước ấm 35-37
o
C trong 1
phút. Chúng được cho lên lớp Percoll với nồng độ khác nhau (90%/45%: 1
lớp percoll 90% ơ dưới và 1 lớp percoll 45% ở trên), ly tâm 700 xg/phút trong
20-3- phút, Phần lắng xuống đáy là những tinh trùng khỏe mạnh đạt tiêu
chuẩn thụ tinh.
Ngoài ra còn có phương pháp lọc qua phân lớp Polyvinyl pyrrolidone
(Guerin, 1981).
+ Phương pháp thụ tinh trứng lợn trong ống nghiệm:
Trứng đã thành thục và tinh trùng đã được tăng cường năng lực thụ
tinh, sẵn sàng tham gia vào thụ tinh thì tiến hành TTON.
Loại bỏ môi trường bảo quản đông lạnh tinh bằng cách ly tâm 200
vòng/phút sau đó pha loãng với một số môi trường thích hợp: DPPS, TCM-
199, Saline-BSA…
Sau khi xử lý tinh trùng xong phải tiến hành kiểm tra nồng độ và hoạt
lực tinh trùng tiến thẳng, thông thường nồng độ tinh trùng sau pha loãng phải
đạt 5x10
5
- 10
6
tinh trùng/ml.
+ Một số yếu tố ảnh hưởng đến TTON
Kết quả TTON phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó chủ yếu là: kích
thước nag trứng, chat lượng trứng, môi trường và điều kiện nuôi cấy, giống,
mùa vụ, tuổi, đực giống, phương pháp xử lý hoạt hóa tinh trùng, nồng độ và
hoạt lực tinh trùng tiến thẳng…
24

Phần thứ ba
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đánh giá 1 số đặc điểm sinh học tinh dịch lợn được tiến hành trên 2
giống lợn: Lợn Bản và Landrace nuôi tại các trại giống gia súc gia cầm Thuận
thành – Bắc Ninh, trại Cầu Diễn – Hà Nội… lợn khỏe mạnh, được chăm sóc
nuôi dưỡng tốt, giao phối thuần thục trước khi mổ lấy.
Khảo sát 1 số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn Bản, Landrace sau đông
lạnh, Lợn Bản (hay còn gọi lợn Mường, lợn “cắp nách”, Minipig) là 1 giống
lợn quý, kích cỡ nhỏ (khối lượng lợn đực trưởng thành là 30-40 kg, lợn nái
20-30 kg (7-8 tháng tuổi)), được nuôi chủ yếu ở vùng đồi núi phía Bắc, vùng
trung du.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 1 đến hết tháng 4 năm 2010.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ phôi, viện CNSH, viện Khoia
học và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội
Trung tâm giống gia súc gia cầm Thuận Thành – Bắc Ninh.
Trại nuôi động vật thí nghiệm của phòng công nghệ phôi.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát và đánh giá chất lượng tinh trùng trước và sau bảo quản lạnh
được mổ lấy từ mào tinh của lợn Landrace theo các chi tiêu A, K, Sg.
Đánh giá chất lượng tinh dịch của tinh từ mào tinh của lợn Landrace
qua việc tham gia vào thụ tinh ống nghiệm.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp thu tinh
25