ENZYME GLUCOSE ISOMERASE VÀ GLUCOSE OXIDASE

VIỆN SINH HỌC – THỰC PHẨM
TIỂU LUẬN
PHỤ GIA THỰC PHẨM
Đề tài
ENZYME GLUCOSE
ISOMERASE VÀ GLUCOSE
OXIDASE
MỞ ĐẦU
Cùng với sự tiến bộ của xã hội, sự phát triển của khoa học kỹ thuật nhu cầu của con
người cũng không ngừng nâng lên. Không chỉ đơn thuần là ăn no mà còn phải ăn ngon
và thực phẩm phải có tính hấp dẫn, bắt mắt.
Từ ngàn xưa, ông cha ta đã biết lấy các chất màu trong thiên nhiên như cỏ cây, các
loại lá, khoáng chất... để cho vào các món ăn nhằm làm tăng thêm tính hấp dẫn, kích
thích sự ngon miệng trong ăn uống. Những chất khi thêm vào trong thực phẩm nhằm
mục đích bù lượng tổn thất trong quá trình sản xuất và bảo quản, cải thiện chất dinh
dưỡng cho thực phẩm, tăng thời gian bảo quản sản phẩm, tăng thêm giá trị cảm quan và
hấp dẫn người tiêu dùng đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của khách hàng gọi là chất phụ
gia trong thực phẩm.
Ngoài những vai trò trên nếu không được sử dụng hợp lí và hiệu quả thì những chất
phụ gia sẽ gây nguy hiểm cho sức khỏe của người tiêu dùng. Glucose isonerase, glucose
oxidase là hai enzyme thuộc nhóm enzyme chuyển hóa đồng phân và enzyme oxy hóa
được dùng trong việc cải thiện độ ngọt của đường dùng trong sản xuất các sản phẩm
syrup, dịch đường,..
I. NỘI DUNG
1. Enzyme glucose isomarase
1.1. Giới thiệu chung về enzyme glucose isomerase
D – glucose / xylose isomerase thường được gọi là glucose isomerase (GI) là một
trong ba enzyme có giá trị xúc tác cao nhất, amylase và protease là hai enzyme còn lại.
Theo wiseman, GI có thể quan trọng nhất trong tất cả các ngành công nghiệp thuộc về
enzyme trong tương lai. Nó xúc tác đồng phân thuận nghịch của D – glucose và D –
xylose chuyển thành D – fructose và D – xylulose, tương ứng.

Sự chuyển đổi qua lại của xylose sang xylulose đáp ứng yêu cầu dinh dưỡng trong vi
khuẩn hoại sinh phát triển mạnh trên vật liệu là cây mục nát, cũng hổ trợ sự biến đổi của
hemicellulose để sản xuất ethanol. Đồng phân của glucose với fructose .. thương mại
quan trọng trong sản xuất si-rô ngô có hàm lượng fructose cao (HFCS). Saccharose có
nguồn gốc từ củ cải đường (40%) và đường mía (60%) là chất làm ngọt chính trên thế
giới cho đến năm 1976. Việc sản xuất HFCS bằng cách sử dụng enzyme glucose
isomerase lần đầu tiên được phát triển ở Nhật Bản và sau đó là ở Mỹ. GI đã đạt được
tầm thương mại quan trọng tại Mỹ vì thiếu sự cung cấp saccharose sau cuộc cách mạng
Cuba năm 1958 và nó tiếp tục là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng cho
đến nay.
1.2. Lịch sử phát triển của enzyme glucose isomerase
Nguồn gốc sự phát triển thành công của sản phẩm si- rô fructose nằm trong sự phát
hiện của enzyme glucose – isomerizing. Trong lịch sử có 4 loại enzyme khác nhau đã
được gọi là glucose isomerases. Các khám phá của Marsall và Kooi năm 1957 về khả
năng của glucose – isomerizing từ Pseudomonas hydrophila là điểm khởi đầu của việc
khai thác enzyme này để sản xuất HFCS như một sự thay thế cho đường mía. Sự sản
xuất enzyme xylose là cần thiết trong môi trường phát triển và được tăng cường trong sự
phát triển với sự có mặt của arsenate.
Sau đó, một xylose isomerase hoạt động, mà sự hoạt động đó độc lập với xylose,
đã được tìm thấy trong Escherichia intermedia. Các enzyme là một phosphor glucose
isomerase (EC 5.3.1.9), mà có thể isomerase không phải phosphoryl hóa đường duy nhất
trong sự hiện diện của arsenate. Takasaki và Tanable đã phân lập từ Bacillus megaterium
AI một glucose isomerase (EC 5.3.1.18) mà NAD liên kết và cụ thể với glucose. Một
glucose isomerase tương tự hoạt động, xúc tác đồng phân của cả hai đường glucose và
mannose với fructose, được phân lập từ Paracolobacterium aerogenoides.
Glucose isomerase được sản xuất bởi vi khuẩn acid heterolactic yêu cầu xylose như
một chất cảm ứng và tương đối ổn định ở nhiệt độ cao hơn. Trong số này các hoạt động
glucose – isomerizing, xylose isomerase (EC 5.3.1.5) là phù hợp nhiều nhất cho các hoạt
động thương mại. đó là nhiệt độ ổn định và không yêu cầu cofactor đắt tiền như NAD
hoặc ATP cho hoạt động. Enzyme glucose isomerase lần dầu tiên được thực hiện trong

quy mô công nghiệp năm 1967 bởi Clinton. Nhu cầu HFCS cho thực phẩm ngày càng
tăng và đến năm 1980 thực tế tất cả các công ty chế biến tinh bột lớn trong thế giới
phương Tây đã phải dùng đến công nghệ GI. Ngày nay, enzyme là thị trường lớn nhất
trong ngành công nghiệp thực phẩm.
1.3. Đặc tính của glucose isomerase
Các enzyme và các tính chất hóa lý của GI từ một số sinh vật đã được nghiên cứu
rộng rãi. Kiến thức rõ ràng các đặc tính của enzyme, như sự ổn định của nó, cơ chất đặc
trưng và yêu cầu ion kim loại là quan trọng để ngăn chặng sự bất hoạt của nó và để đánh
giá sự phù hợp cho việc ứng dụng trong sản xuất HFCS.
1.3.1. Cơ chất đặc trưng
Khả năng của các enzyme đồng phân hóa trên các cơ chất đa dạng như pentose,
hexoses, sugar alcohols, và đường phosphates đã được nghiên cứu. Mặc dù cơ chất đặc
trưng của enzyme từ nhiều nguồn thay đổi khác nhau, các enzyme có thể sử dụng D –
ribose, L – arabinose, L – rhamnose, D – allose, và 2 – deoxyglucose, cũng như cơ chất
phổ biến nhất là D – glucose và D – xylose. Đồng phân tối đa được thu với chất nền có
các nhóm hydroxyl tại cacbon số 3 và 4 trong vị trí như việc chuyển đổi tỷ lệ của D -
glucose đến D – fructose xúc tác bởi GI từ những sinh vật khác nhau ở dạng hòa tan
hoặc bất động trong khoảng 26 – 59%. Giá trị K
m
của enzyme cho D – glucose và D –
xylose trong phạm vi từ 0.086 đến 0.920M, và 0.005 đến 0.093M.
1.3.2. Yêu cẩu ion kim loại và các chất đặc trưng
GI yêu cầu một cation hóa trị 2 như Mg
2+
, Co
2+
, hoặc Mn
2+
, hoặc một sự kết hợp
của các ion này cho hoạt động tối đa. Mặc dù cả hai Mg

2+
và Co
2+
là rất cần thiết cho
hoạt động nhưng khác nhau về vai trò. Trong khi Mg
2+
tốt hơn Co
2+
như một chất hoạt
hóa, Co
2+
chịu trách nhiệm cho sự ổn định của enzyme bởi giữ được sự sắp xếp về cấu
tạo, đặc biệt là các cấu trúc bậc bốn của enzyme. Ion kim loại liên kết trực tiếp đã được
nghiên cứu bởi Danno trên GI từ Bacillus coagulans. Kasumi et al. đã báo cáo sự hiện
diện của bốn ion Co
2+
của GI từ Streptomyces griseo fuscus. Các hoạt động xúc tác của
GI đã được ức chế bởi các kim loại như Ag
2+
, Hg
2+
, Cu
2+
, Zn
2+
và Ni
2+
và để tăng mức độ
bởi Ca
2+

. Chất ức chế khác được biết đến của GI là xylitol, arabitol, Sorbitol, mannitol,
lyxose, và Tris.
1.3.3. Các tiểu đơn vị cấu trúc
Sự kết tủa không đổi và trọng lượng phân tử của GI thay đổi từ 7.55 đến 11.45 và
từ 52.000 đến 191.000. Các cấu trúc tiểu đơn vị và thành phần axit amin GI bộc lộ rằng
đó là một tetramer hoặc dimer tương tự hoặc tiểu đơn vị giống hệt nhau liên kết với các
noncovalent và là không có disulfide.
Mỗi isoenzymes là một tetramer tiểu đơn vị nonidentical. Hiệu quả của chất làm
biến tính như urê, guanidine hydrochloride, sodium dodecyl sulfate, và nhiệt độ trên hoạt động
của GI từ Arthrobacter và Streptomyces spp. đã được điều tra. Các phân ly và diễn tiến của GI
tetrameric từ Streptomyces sp. Biến dạng NCIM 2730 nói rằng các tetramer và dimer là loài
hoạt động trong khi monomer không hoạt động.
1.3.4. Nhiệt độ và pH tối ưu
Nhiệt độ tối ưu của GI trong phạm vi từ 60 – 80
0
C và gia tăng trong sự có mặt
của Co
2+
. Giá trị pH tối ưu của GI nói chung là giữa pH 7.0 và 9.0. Enzyme từ
Lactobacillus brevis có pH tối ưu thấp hơn (6 – 7), đó là mong muốn cho các ứng dụng
thương mại của GI. Các enzyme từ Streptomyces spp, Bacillus spp, Actinoplanes
mis-souriensis, và Thermus thermosulfurogenes ổn định ở mức nhiệt độ cao, GI từ
Lactobacillus và Escherichia spp. ít ổn định hơn .
1.3.5. Nghiên cứu phạm vi hoat động
Danh tính của các axit amin tham gia tại hoặc gần các phạm vi hoạt động của GI
đã được giải mã với nhóm hóa chất cụ thể và tinh thể học X - Ray. Bằng chứng cho
histidine là cần thiết và các dư lượng carboxylate trong GI đã được trình bày. Môi trường
cấu trúc của dư lượng axit amin chức năng đã được xác định bằng cách thay đổi hóa học
và sau đó lập bản đồ khác biệt giữa các peptide của GI. Từ lâu đã nhận ra rằng GI xúc
tác đồng phân của cả glucose và xylose. Tuy nhiên, cho dù các phản ứng xảy ra ở cùng

một phạm vi hoạt động hoặc tại hai địa điểm khác nhau không được biết. Các sự hiện
diện của một phạm vi hoạt động duy nhất cho đồng phân của cả hai glucose và xylose đã
được chứng minh bằng cách sử dụng một phương pháp động được xây dựng bởi Keleti
et al.
1.4. Cơ chế hoạt động của glucose isomarase
Mặc dù tầm GI có tầm quan trọng trong thương mại nhưng có rất ít thông tin sẵn
có về các tính chất cấu trúc và cơ chế của nó. Các cơ chế xúc tác của GI đã là một chủ đề
lớn được các nhà nghiên cứu quan tâm. Trước đó, GI đã được giả định là chức năng
tương tự như đường phosphate isomerases và làm theo cơ chế enediol (hình dưới)
Các nghiên cứu gần đây do hoạt động của GI đến hydride như một cơ chế chuyển đổi.
Kiến thức về cấu hình hoạt động là điều kiện tiên quyết cho việc nghiên cứu mối
quan hệ về cấu trúc và chức năng của enzyme. Các phương pháp tiếp cận khác nhau đã
được nghiên cứu về phạm vi hoạt động của GI và để phân định cơ chế hoạt động của nó.
Chúng bao gồm thay đổi hóa học, tinh thể lọc tia X và chuyển đổi đồng vị. Các tính
năng chính của cơ chế đã đề xuất cho GI là mở rộng cơ chất, đồng phân hóa thông qua
một hydride chuyển đổi từ C-2 sang C-1, và kết thúc một vòng sản phẩm.
1.4.1. Sự chuyển đổi đồng phân hóa học của glucose isomerase
Sự thay đổi hóa học của phần dư acid amin với cụ thể là thuốc thử hóa học như
một phương pháp đơn giản của việc khảo sát phạm vi hoạt động của enzyme. Sự tham
gia có thể có của histidine trong phạm vi hoạt động của GI đã được mặc nhiên công nhận
bằng cách nghiên cứu tác động của diethylpyrocarbonate lên sự ngừng hoạt động của GI.
Sau đó, bằng chứng cho sự có mặt của một lượng dư histidine cần thiết cho phạm
vi hoạt động của GI từ nhau Lactobacillus spp và Streptomyces spp khác nhau đã được
cung cấp. Sự ức chế bởi diethylpyrocarbonate đã được khắc phục bằng hydroxylamine.
Tóm lại, sự bảo vệ hoạt động của enzyme là khả năng của cơ chất và cơ chất
tương tự xylitol trong suốt quá trình thay đổi hóa học. Histidine được biết đến chức năng
như một cơ sở tóm tắt proton và hỗ trợ chuyển đổi hydro.
Sự có mặt của một lượng dư aspartate hoặc glutamate trong GI là tài liệu bằng
cách bất hoạt bởi thuốc thử K Woodward
’

s hoặc guanidine hydrochloride. Sự tham gia
của lượng dư carboxylate kéo theo các ràng buộc của các cofactor ion kim loại. Hóa chất
sửa đổi, bảo vệ hay không bảo vệ GI và tiếp theo peptide lập bản đồ cho phép xác định
với một chuỗi sự đồng thuận bao gồm Phe – His – Xaa – Asp – Xaa – Xaa – Pro – Xaa –
Gly. Kết qủa nghiên cứu về thay đổi hóa học của GI bổ sung cho các kết luận rút ra trân
cở sở nghiên cứu các tinh thể lọc X – Ray.
1.4.2. Tinh thể lọc X – Ray
Tinh thể lọc tia X mang lại sự đánh giá chi tiết về cấu trúc 3 chiều của protein và cho
phép hình dung thực tế phức hợp giữa enzyme và cơ chất của nó hoặc chất ức chế. GI từ
các loài vi khuẩn khác nhau như Actino- myces, Arthrobacter, Actinoplanes, và các loài
vi khuẩn Bacillus được nghiên cứu bởi tinh thể lọc X – Ray ở các cấp độ khác nhau của
độ phân giải, sự có mặt và không có mặt của các chất ức chế và ion kim loại để hiểu và
giải thích cơ chế họat động. Từ khi GI là một chất nền đơn chất duy nhất của enzyme, nó
có thể quan sát sự phức tạp Mihaelis trực tiếp tại một chất nền nồng độ tập trung cao hơn
K
m
của nó.
Các cấu trúc của GI từ một số Streptomyces spp. được biết chính xác, nó rất tương tự,
đặc biệt là ở phạm vi hoạt động. Cấu trúc của GI từ Streptomyces rubiginosus được xác
định tại độ phân giải 4 - Å (1 Å = 0,1 nm) đã chỉ ra rằng enzyme bao gồm tám sợi xoắn
đơn vị được tìm thấy trong triose – phosphate isomarase. Sự phân tích cấu trúc tinh thể
của GI từ olivochromogenes Streptomyces ở 3Å cho thấy GI dài 30Å, 40Å trong đường
kính. Characterization của cấu trúc tinh thể từ Streptomyces violaceoniger ở độ phân
giải 2,2-Å cho thấy một sự thay đổi trong cấu trúc bậc bốn của GI từ S.
olivochromogenes trong dung dịch. Các cấu trúc của tinh thể GI từ Streptomyces
rubiginosus được xác định trong sự hiện diện của chất nền và phạm vi hoạt động hướng
chất ức chế ở độ phẩn giải 1.9 - Å.
Những nghiên cứu này dẫn đến việc xác định khu vực hoạt động của enzyme và hai
kim loại ràng buộc các phạm vi. Một trong các ion kim loại liên kết với C – 3-O và C-5-
O của cơ chất, trong khi có một liên hệ chặt chẽ giữa histidine và C – 1 của cơ chất. Kết

quả cho thấy cơ chế liên quan đến một cấu chuỗi mở theo cơ chất và có thể là một hình
thành của một trung gian cis-enediol. Gần đây nghiên cứu về cấu trúc tinh thể X-quang
của kim loại activated GI từ S. olivochromogenes các đồng phân được xúc tác bởi hai
cofactors kim loại và cầu nối của nó thông qua lượng dư glutamate để thúc đẩy một sự
thay đổi hydride. Trong hai ion magie thiết yếu cho hoạt động của enzyme, Mg
2+
được
quan sát chiếm hai vị trí thay thế cách nhau 1.8Å. Các quan sát chuyển động của các ion
kim loại trong sự hiện diện của cơ chất là do một bước sau ràng buộc chất nền nhưng
trước khi đồng phân.
Các chất nền, tuyến tính của nó với các hình thức mở rộng, được quan sát tương tác
với các enzyme và đồng yếu tố kim loại. Carell et al đã chỉ ra rằng GI từ S. rubiginosus
có thể liên kết với các chất nền và chất ức chế trong một loạt các ràng buộc các chế độ
tùy thuộc vào kích thước của đường. Acid D – Threonohedroxamic tương tự như giả
định chuyển đổi trạng thái trong bước đồng phân của xylose bởi GI và là một chất ức
chế mạnh của enzyme.
Các nghiên cứu về tinh thể lọc X – Ray về độ phân giải cao trong cấu trúc đồ họa sự
phức tạp giữa các GI từ S. Olivo- chromogenes và acid D – Theronohydroxamic cung
cấp bằng chứng cho hoạt động kim loại trong xúc tác trên deprotonation, tiếp theo là sự
hình thành của một phối cấu tử cầu nối. Những kết qủa này xác nhận các quan sát trước
đó rằng protonation của nhóm hydroxyl xảy ra sau khi ko73 vòng. Cấu trúc tinh thể của
GI từ Arthrobacter dòng B3728 có chứa các chất ức chế xylitol và D – Sorbitol đã được
nghiên cứu ở độ phân giải 2.5 và 2.3-Å tương ứng.
Các ion kim loại là phức hợp tại phạm vi ái lực cao bên cạnh bốn chuổi carboxylate.
Các chất ức chế đang bị ràng buộc về phạm vi hoạt động trong cấu tạo mở chuổi rộng và
hoàn thành một vỏ phối hợp tám mặt cho cơ chất cation thông qua nguyên tử oxy O – 2
và O – 4. Collier et al. và các nhà nghiên cứu khác đã cho thấy thêm rằng ràng buộc vào
phạm vi hoạt động của cation thứ hai cũng là cần thiết cho xúc tác. Phạm vi này liên kết
Co
2+

mạnh hơn so với phạm vi hoạt động một và nó là octahedrally phối hợp với ba
nhóm carboxylate, một imidazole và một phân tử dung môi. Trong sự thay đổi hydide,
C-O-1 và sự liên kết C-O-2 của bề mặt phân cực cách tiếp cận chặt chẽ của hai cation.
Sau khi đồng phân hóa, đóng vòng được xúc tác là ngược lại của bước mở vòng.
Anomerism và stereospecificity là các men tiêu hóa được thể hiện hoàn toàn phù hợp với
sự thay đổi hydride. Kết tinh và đặc tính của GI từ Bacillus coagulans và Actinoplanes
missouriensis cũng đã được báo cáo.
1.4.3. Sự tao đổi đồng vị
Các tinh thể có sẵn là chỉ tiêu cho các quy tắc GI ra proton chuyển đổi cơ chế và đề
nghị một cơ chể chuyển đổi hydride. Tuy nhiên, dữ liệu cấu trúc một mình không đủ để
kết luận cơ chế họat động của một enzyme. Sự không chắc chắn về một proton chuyển
đổi cơ cấu trong GI đã được nhắc nhở bởi sự vắng mặt của trao đổi dung môi trong quá
trình nghiên cứu trên sự kết hợp của tritiated nước vào sản phẩm. Tuy nhiên, khả năng
proton chuyển nhanh trong một hoạt động bảo vệ không thể được loại trừ ra ngoài.
Allen et al. đã tiến hành đồng vị trao đổi experiments ở nhiệt độ cao hơn, PHS cực đại,
và trong sự có mặt của hydrochloride guanidine để nghiên cứu khả năng chuyển proton
được bảo vệ.
Cộng hưởng từ hạt nhân của họ nghiên cứu, kết hợp với các nghiên cứu về flo-thay
thế phụ các chất tương tự strate, không hỗ trợ một cơ chế chuyển proton GI. Nghiên cứu
gần đây về đột biến đồng phân D – Xylose từ Actinoplanes missouriensis hỗ trợ vai trò
quan trọng của các phân tử nước TRP-690, ASP-255 và Glu-liền kề 186 trong chuyển
proton từ 2-OH sang O-1 mở và mở rộng aldose chất nền.
1.5. Ứng dụng và tầm quan trọng của glucose isomerase
GI phục vụ như là một mô hình thú vị để nghiên cứu cấu trúc chức năng mối quan hệ
tiến hóa sinh và kỹ thuật di truyền. Bên cạnh tầm quan trọng học tập, nó đã nhận được
sự quan tâm của các ngành công nghiệp sử dụng của nó trong sản xuất HFCS và cho các
ứng dụng tiềm năng của nó trong sản xuất ethanol từ hemicelluloses.
1.5.1. Ưu điểm của si-rô ngô có hàm lượng fructose cao như chất làm ngọt
Tăng nhu cầu đối với đường tinh chế, kết hợp với chi phí sản xuất cao và nhận
thức về tác hại của saccharose và đảo ngược đường tiêu thụ trên sức khỏe con người, có

đòi hỏi phải tìm kiếm các sản phẩm thay thế saccharose chấp nhận được. Một số lượng
lớn chất ngọt nhân tạo như saccharine, cyclamate, acesulfame-K, apartame, và thaumatin
đã được phát hiện, miễn nhiệm trên cơ sở các mối quan tâm y tế hoặc hạn chế khác.
Sự kết hợp của các chất tạo vị ngọt làm cho nó ít ngọt hơn sau khi lưu trữ lâu dài,
bởi vì chất tạo ngọt là từ sự thủy phân chậm ở pH thấp. Thaumatin, một chất ngọt
protein lý tưởng, ngọt hơn saccharose 2000 lần nhưng có sự khác biệt là có mùi vị khó
chịu. HFCS, HFCS, một hỗn hợp cân bằng của glucose và fructose (1:1) thì ngọt hơn
saccharose 1.3 lần và glucose 1.7 lần. HFCS được sản xuất hoàn toàn từ một nonsweet
vật chất, cụ thể là tinh bột. HFCS được ưa thích trong ngành công nghiệp thực phẩm vì
nó không gây các vấn đề kết tinh là trường hợp với saccharose. Hơn nữa, D – fructose
đóng một vai trò quan trọng như một chất làm ngọt cho người bị bệnh tiểu đường vì nó
chỉ là chậm tái hấp thu bởi dạ dày và không ảnh hưởng đến mức độ glucose trong máu.
Sử dụng chủ yếu của HFCS là nước giải khát, đồ nướng, đồ hộp, bánh kẹo ngành công
nghiệp.
1.5.2. Sản xuất si-rô ngô có nồng độ fructose cao
Phát triển thị trường trong sản xuất HFCS được đánh dấu bởi một sự chấp nhận
dần dần của HFCS và HFCS được làm giàu (55% fructose) thay thế đối với saccharose
sản xuất nước giải khát. Các nguyên liệu được sử dụng phổ biến nhất để sản xuất HFCS
tại Hoa Kỳ là bột bắp sản xuất bởi quá trình nghiền ướt.
Việc sản xuất HFCS từ tinh bột bao gồm ba quá trình chính: hóa lỏng của tinh bột
bởi α - Amylase, sự đường hóa của tinh bột bằng cách kết hợp hoạt động của
amyloglucosidase và enzyme debranching và đồng phân glucose bởi GI. Các sản phẩm
cuối cùng là một si-rô ngô có chứa một hỗn hợp của glucose và fructose và do đó độ
ngọt lớn hơn là đường saccharose.
Các nguồn tinh bột khác như lúa mì, khoai mì và gạo được sử dụng ở mức độ nhỏ
trong các bộ phận khác trên thế giới. Các sản phẩm của của ngành công nghiệp xay xát
ngô là quan trọng trong việc quyết định nền kinh tế sản xuất HFCS. Việc tiêu thụ trên thế
giới hàng năm HFCS là ước tính đạt 10 triệu tấn (trọng lượng khô) vào năm 1995. Hiện
nay, HFCS đã gần như hoàn toàn thay thế saccharose ở Hoa Kỳ, và chỉ ở mức độ trung
bình (3 - 4%) tốc độ tăng trưởng sản xuất dự kiến trên toàn cầu .

1.5.3. Sản xuất ethanol
GI xúc tác đồng phân của cả glucose và xylose. Đặc tính của enzyme này được sử
dụng trong các đồng phân của xylose đến xylulose, mà có thể cuối cùng là lên men để
sản xuất ethanol bởi nấm men thông thường.
Sự biến đổi sinh học của sự tái tạo lại sinh khối sinh vật để lên men đường và
ethanol là quan trọng trong quan điểm của sự suy giảm nhanh chóng của các loại nhiên
liệu hóa thạch. Sinh khối bao gồm cellulose (40%), hemixenlulose (30%) và lignin
(30%). Tính khả thi kinh tế của việc sử dụng sinh khối sinh vật phụ thuộc vào sự thủy
phân cellulose và hemixenlulose đến glucose và xylose và sự lên men tiếp theo của nó để
sản xuất ethanol bởi nấm men.
Cho đến gần đây, các nỗ lực nghiên cứu tập trung vào sự biến đổi sinh học của
cellulose. Sau đó, nhận thức rằng hiệu quả biến đổi sinh học của lignocelluloses và các
chất thải nông nghiệp dựa chủ yếu vào việc sử dụng có hiệu quả của hemixenlulose hợp
thành sinh khối chuyển sự chú ý trên toàn thế giới đến lên men hemixenlulose. Xylan là
một thành phần chính của hemicellulose và bao gồm các đơn vị xylose liên kết bởi một
liên kết β(1,4) D – xylose có thể dễ dàng được sản xuất bởi acid hoặc thủy phân
enzymatic của xylan. Các chủng nấm men công nghiệp như Saccharomyces cerevisiae
thường lên men hexoses hiệu quả nhưng D – xylose thì không sử dụng phần dư.
Một số nấm men như Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Candida utilis, và
Candida shehatae được biết là sử dụng pentoses thông qua quá trình oxy hóa chất khử,
nhưng tỷ lệ lên men rất thấp. Hơn nữa, sự dung nạp và dị hóa ethanol thấp trong sự có
mặt của oxy hạn chế ứng dụng trong thương mại. GI đã được sử dụng để sản xuất
xylulose từ xylose, nếu không đại diện cho một khối lớn trao đổi chất trong quá trình lên
men xylose ethanol bằng nấm men thông thường như Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, và Candida tropicalis. Mặc dù tỷ lệ lên men và sản lượng
sản phẩm để sản xuất ethanol từ D - Xylose thấp hơn đáng kể hơn là từ D Glucose, công
nghệ cao bây giờ nổi lên để cải thiện quá trình bằng cách chuyển gen GI với men và tiến
hành đồng phân và lên men đồng thời xylose và ethanol.
1.6. Sản xuất gluose isomerase
1.6.1. Nguồn sinh vật

GI phân phối rộng rãi trong prokaryote. Sau khi GI phát hiện trong Pseudomonas
hydrophila, một lượng lớn vi khuẩn đã được tìm thấy để sản xuất GI có nghĩa là hoạt
động trong trường hợp không có arsenate. Trong số các axit heterolactic các vi khuẩn,
Lactobacillus brevis sản xuất Enzyme năng suất cao nhất. Enzyme được hoạt động ở độ
pH thấp nhưng không ổn định ở cao nhiệt độ và do đó không phù hợp với khai thác kinh
tế.
GI ngoại bào đã được báo cáo là sản xuất bởi Streptomyces glaucescens và S.
flavogriseus, việc tách enzyme từ các tế bào là do thay đổi tính thấm thành tế bào và sự
phân giải một phần của các tế bào. Xylose isomerase ngoại bào từ Chainia sp và vi
khuẩn Bacillus sp alkalothermophilic được tinh chế để đồng nhất bằng các kỹ thuật lọc
thông thường như lọc gel, trao đổi ion phương pháp sắc ký, và điện di gel
polyacrylamide dự bị. Cũng như Streptomyces spp., Một số loài vi khuẩn Bacillus sản
xuất tốt GI. Sự xuất hiện của GI trong một vài nấm men chẳng hạn như Candida utilis
và Candida boidinii đã được ghi nhận. Aspergillus oryzae là loại nấm duy nhất được báo
cáo có hoạt động GI. Sự tồn tại của GI trong lúa mạch nha và mầm lúa mì đã được báo
cáo. Nguồn sinh vật đóng vai trò quan trọng sản xuất GI được ghi trong bảng sau:
Sinh vật Tên thương mại Nhà sản xuất
Actimoplanes missoususriensis Maxazyme Gist Brocades and Anheuse –
Busch Inc.
Bacillus coagulans Sweetzyme Novo – Nordisk
Streptomyces rubiginosus Optisweet Miles Kali – Chemie
Sreptomyces
phaeochromogenes
Spezyme Finnsugar
Nagase
Arthrobacter sp. Swetase Reynolds Tobacco
Streptomyces olivaceus Miles Laboratories Inc
1.6.2. Cải thiện sản lượng
Sản lượng của GI từ sinh vật sản xuất khác nhau được liệt kê trong bảng bên
dưới, dao động trong khoảng từ 1.000 đến 35.000 U liter

-1
. Tiếp tục cải thiện năng suất
và các thuộc tính của enzyme đạt được bằng cách cải thiện căng thẳng, bằng cách sử
dụng một trong hai quy ước đột biến hoặc công nghệ DNA tái tổ hợp.
Sản xuất GI với các nguồn sinh vật khác nhau
Một số chủng có tầm quan trọng trong thương mại đã phải chịu đột biến để tăng
sản lượng các men tiêu hóa hoặc cho cấu sản xuất các men tiêu hóa. Tăng 60% trong
enzyme mức độ được thu thập bởi mutagenizing Streptomyces wedmorensis với
ethyleneimine N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine.
UV chiếu xạ của olivochromogenes Streptomycestrong một dòng đột biến với
70% tăng hoạt động. Một cấu hình đột biến của vi khuẩn Bacillus coagulans hai lần với
các hoạt động khởi đầu được thu thập bằng cách chọn các đột biến trên cơ sở sức đề
kháng của 2 deoxyglucose. Cao hơn năng suất cấu hình đột biến cho thấy sản lượng cao nhất
của nó trên lactose, với một trong số họ cho thấy hoạt động cao hơn trên đường so với trên
xylose, báo cáo của Lee.
Một loạt các tổ chức và năng suất GI cao, GI - năng suất đột biến được phân lập bằng
cách áp dụng tia cực tím để chiếu xạ Streptomyces acidodurans. Một trong những đột biến được
sản xuất bởi ethyl methanesulfonate đột biến mang lại 1.500 U ml
-1
khi trồng trên đường duy
nhất trong khi phân tử cấp trên sản xuất 10 U ml
-1
dưới điều kiện tương tự.
1.6.3. Tối ưu hóa môi trường lên men
GI là sản xuất bằng cách lên men có ga ngập nước. Tối ưu hóa của môi trường lên men đã
được rộng rãi nghiên cứu với một cái nhìn cho sự phát triển về kinh tế công nghệ khả thi quá
trình lên men để sản xuất của GI. Nỗ lực nghiên cứu được hướng chủ yếu đối với thay thế của
xylose bởi một chất cảm ứng không tốn kém, đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ rẻ hơn trên
sản lượng các men tiêu hóa; tối ưu hóa độ pH và nhiệt độ cho enzyme tối đa sản xuất; và thay
thế Co

2+
bằng ion khác hóa trị hai các ion kim loại trong môi trường lên men. Có thành phần
cụ thể của môi trường sản xuất tốt nhất của enzyme từ các vi sinh vật khác nhau. Mỗi
sinh vật hoặc yêu cầu đặc biệt riêng để sản xuất enzyme tối đa.
1.6.4. Tác nhân gây cản ứng
a) Nguồn Nito
Các nguồn nitơ là một yếu tố quan trọng mà cần phải được tối ưu hóa cho từng nguồn
enzyme. Mặc dù nguồn nitơ phức tạp thường được sử dụng cho sản xuất GI, yêu cầu bổ sung
nitơ đặc biệt khác với các sinh vật. Peptone, men chiết xuất, hoặc muối amoni có thể được sử
dụng với coagulans vi khuẩn Bacillus, nhưng urê và nitrate không phù hợp. Ngô rượu dốc đã
được tìm thấy là một nguồn giá rẻ là nguồn nitơ phù nhưng sử dụng của nó là giới hạn và theo
mùa interbatch biến đổi. Nguồn nitơ thích hợp như thay thế cho ngô rượu dốc vẫn còn đang
được đánh giá. Bột đậu nành cung cấp cho 50% năng suất cao hơn hơn so với rượu ngô
dốc. Bổ sung của một số axit amin cải thiện sản lượng enzyme trong Streptomyces
violaceoruber. Một đột biến cấu thành của Streptomyces coelicolor sử dụng rượu ngô
dốc tốt hơn so với chiết xuất từ nấm men hoặc men autolysate.
b) pH và nhiệt độ tối ưu
Bản chất của nguồn nitơ ảnh hưởng đến độ pH và do đó ảnh hưởng năng suất của
các enzyme. Hầu hết các quá trình lên men sản xuất GI được thực hiện giữa pH 7.0 và
8.0 mà không có kiểm soát độ pH. Streptomyces spp... Arthrobacter sp, và missouriensis
Actinoplanes được trồng vào khoảng 30
0
C. Ưa nhiệt Bacillus spp. được ủ ở 50 đến
60
0
C . Các giai đoạn của quá trình lên men khác nhau từ 6 đến 48 giờ tùy thuộc vào loại
nuôi cấy được sử dụng cho sản xuất GI.
c) Ion kim loại yêu cầu
Cation Divalent được yêu cầu trong lên men trung bình để sản xuất tối ưu của GI. Tuy
nhiên, yêu cầu đối với các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn các men tiêu hóa. Co

2+
là cần
thiết cho sản xuất GI từ Streptomyces chủng YT-, trong khi coagulans Bacillus Mn
2+
hoặc Mg
2+
để sản xuất các men tiêu hóa. Nói chung, muối coban được sử dụng trong môi trường của
mesophilic Streptomyces loài chứ không phải các loài ưa nhiệt.
Điều quan trọng là làm giảm sự bổ sung của Co
2+
môi trường vì mối nguy hiểm sức
khỏe liên quan đến tiêu thụ HFCS của con người có chứa Co
2+
và các vấn đề ô nhiễm môi
trường liên quan đến việc xử lý các phương tiện truyền thông đã dành. Một số sinh vật như
Arthrobacter spp. và Streptomyces olivaceus, cũng như một số đột biến của Streptomyces
olivochromogenes, không yêu cầu coban để sản xuất tối ưu.
1.6.5. Thanh lọc glucose isomerase
Một số báo cáo liên quan đến việc sản xuất của GI từ vi sinh vật khác nhau có
sẵn. Tuy nhiên, vài người trong số họ mô tả thanh lọc của GI đến một trạng thái đồng
nhất. Việc thanh lọc GI là những thông tin quan trọng từ quan điểm học tập, kể từ khi nó
liên quan đến nghiên cứu cơ bản về sửa đổi hóa học, cấu trúc – chức năng mối quan hệ
và đặc điểm. GI nói chung là một loại enzyme trong tế bào, ngoại trừ trong một vài
trường hợp khi sản xuất enzyme ngoại bào. Những enzyme này chiết xuất từ các tế bào
vi khuẩn bằng sự gián đoạn cơ học (như sonication, mài, đồng nhất) hoặc bằng sự thủy
phân tế bào với lysozyme, chất tẩy rửa cationit, chất hóa học… sự lọc trong GI từ các
nguồn vi khuẩn bằng các phương pháp thanh lọc cổ điển, như xử lý niệt, sự kết tủa muối
Amoni với sulfate – acetone – Mg
2+
hoặc Mn

2+
, phương pháp sắc ký trao đổi ion hoặc
lọc gel đã được báo cáo. Mối quan hệ hấp thu xylitol – Sepha – rose được sử dụng để
làm sạch các GI từ Streptomyces spp. Một ái lực khác như Bigel – P 100 cùng với xy làm
mất hoặc mannitol bất động silochrome dựa trên các chất hút bám cũng được sử dụng.
1.7. Kỹ thuật di truyền của glucose isomerase
1.7.1. Tương đồng tế bào vật chủ
Công nghệ DNA tái tổ hợp cung cấp một công cụ tuyệt vời để cô lập và thao tác
gen của một loại protein mong muốn. Hơn 50% các enzyme công nghiệp được sản xuất
từ vi sinh vật biến đổi gen. Một trong những cách để tăng sản xuất của GI là để xác định
gen GI và nhân giống vô tính nó vào một vector multicopy có chứa một chất xúc tác
mạnh như lac, tac, hoặc p
L
.
Gen GI đã được nhân bản vô tính từ một số vi sinh vật với các mục tiêu chính sản
xuất dư thừa enzyme bởi hiệu ứng liều lượng gen, trực tiếp còn phiên bản của xylose để
sản xuất ethanol bằng nấm men, và kỹ thuật protein để thay đổi thuộc tính của nó cho
phù hợp với công nghệ sinh học của nó ứng dụng. Phân tử nhân bản và biểu hiện của GI
đã được thực hiện trong máy cả hai tương đồng và dị và nấm men.
a) Sự tương đồng tế bào vật chủ
Tương đồng tế bào vật chủ cung cấp một số lợi thế cho việc nhân bản và biểu
hiện của DNA ngoại sinh. Có một vài báo cáo về sự tương đồng nhân bản của GI từ loài
Escherichia coli và Streptomyces. E. coli. Báo cáo đầu tiên về sự cô lập của gen GI từ E.
coli bởi Ho et al. D - Xylose isomerase và hoạt động xylulokinase đã được khuếch đại
bằng cách chuyển đổi của một GI- thiếu E. coli biến dạng với các pMB9 plasmid mang
một HindIII hạn chế mảnh của E. coli DNA nhiểm sắc thể.
Các gen GI từ E. coli được giải trình tự và hiển thị mã GI bằng cách thanh lọc
của sản phẩm gen nhân bản vô tính. Nhân bản phân tử, trình tự, và biểu hiện của gen GI
trong E. coli cũng đã được báo cáo của Briggs et al Lawlis et al. và Ueng et al. GI đã
được sản xuất nhiều hơn trong E. coli bởi nhiều công nhân. Ho và Stevis quan sát thấy

rằng hyperexpression của gen này đã không được thực hiện bằng cách chỉ đơn thuần là
nhân bản nó trên một số cao sao chép plasmid, có lẽ bởi vì sự biểu hiện của gen ở E. coli
là rất cao quy định thông qua tế bào chủ tự nhiên của nó. Sự hợp nhất của gen cấu trúc
với chất xúc tác mạnh mẽ như lac hoặc tac trong 20 lần hơn sản xuất các men tiêu hóa.
Các gen mã hóa chịu nhiệt GI trong thermosulfurogenes Clostridium đã được nhân bản
vô tính trong E. coli bởi một tấm khảo nghiệm phương pháp mới. Các biểu hiện của các
protein trong E. coli cao hơn (0.46 U mg
-1
) so với tế bào chủ (0.19 U mg
-1
) và được cấu
thành. Gen GI từ thermophile Clostridium thermohydrosulfuricum đã được nhân bản vô
tính trong E. coli với một gen vi khuẩn Bacillus GI là một thăm dò cho chiếu
recombi-nants. Nhân bản, trình tự, và biểu hiện của gen GI từ brevis Lactobacillus,
Ampullariella sp. biến dạng 3876, Arthrobacter sp. biến dạng NRRL B3728, Kleb siella
pneumoniae năm 1033, và Thermus thermophilus E. coli đã được báo cáo.
b) Các tế bào vi khuẩn chủ khác
Bacillus thường được coi là vi sinh vật an toàn. Do đó, gen GI từ E. coli được
nhân bản trong các loài vi khuẩn Bacillus bằng cách sử dụng một plasmid bifunctional .
Tuy nhiên, biểu hiện của gen này đã không quan sát thấy. Sự hợp nhất các gen cấu trúc
của E. coli của các chất xúc tác của penicillinase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis kết
quả chức năng biểu hiện của GI Bacillus subtilis.
Các gen GI từ Thermosulfurogenes Clostridium đã được nhân bản vô tính trong
vi khuẩn Bacillus subtilis với E.coli - Bacillus pMG1 qua lại plasmid. Sự biểu hiện của
gen GI trong B. subtilis đã được cấu thành và cao hơn (1.54 U mg
-1
) so với sản xuất
trong C. thermosulfurogenes (0.29 U mg
-1
).

c) Nấm men
Nhiều loại vi sinh vật có thể sử dụng xylose, nhưng không loài nào trong số nó có
thể lên men thành ethanol. Lối đi hẹp chính nằm trong chuyển đổi của xylose vào
xylulose, đó là thực hiện trong đường hiếu khí, trong Candida utilis. Các nấm men
pentose sử dụng như Pachysolen tannophilus có thể lên men xylose anaerobically, nhưng
tỷ lệ lên men formidably thấp và được đi kèm với một lượng đáng kể các sản phẩm phụ.
Saccharomyces cerevisiae và Schizosaccharo- myces pombe cung cấp một tỷ lệ lên men
cao, cao hơn năng xuất cuối cùng, và sản lượng ethanol tăng.
Chuyển đổi của gen GI đẻ nấm men chủ đảm bảo cho sự phát triển một cơ quan
mà có thể lên men xylose để sản xuất trực tiếp để sản xuất ethanol. Một mảnh DNA 2.4 -
kb chứa gen GI từ E. coli là iso- lated từ ngân hang gen Clarke-Carbon và được đưa vào
S.pombe thông qua plasmid. Plasmid tái tổ hợp cho thấy sự bù với GI-thiếu E. coli và
biểu hiện của các gen trong nắm men. Sự chuyển đổi S.pombe là có thể để lên men 10%
(wt/wol) xylose để sản xuất 3.0 (wt/vol) ethanol. Nghiên cứu các quá trình trao đổi chất
của D – Xylose trong nấm men được chuyển đổi cho thấy rằng xylytol, một sản phẩm
của quá trình lên men xylose trong nấm men, không có hiệu quả trên hoạt động của GI.
Các hoạt động thấp của GI trong nấm men là do suy thoái thủy phân protein của
men protease và là hạn chế trong quá trình lên men xylose của nấm men. Gen GI từ vi
khuẩn Bacillus subtilis và missouriensis Actinoplanes iso- lated bằng cách bù GI đột biến
E. coli. Các mã hóa khu vực của gen GI từ B. subtilis đã được hợp nhất, men pyruvate
decarboxylase xúc tác. Các Saccharomyces cerevisiae sản xuất protein xylose isomerase
5% của tổng số protein của tế bào, nhưng nó đã được ức chế không hoạt động. Vùng mã
hóa của GI từ A.missouriensis được hợp nhất để xúc tác nấm men GALI. Sự chuyển đổi
cho thấy sự hiện diện của mARN xylose isomerase cụ thể nhưng không có hoạt động
enzyme. Đầu vào để nghiên cứu thêm là cần thiết để cải thiện sự biểu hiện của gen GI
trong nấm men và ngăn chặng các enzyme bị suy thoái từ protein sở tại.
d) Thực vật
Gen GI từ E. coli đã được nhân bản vô tính trên một plasmid pBR322 bắt nguồn
từ phía ra của các gen nopaline synthetase xúc tác của Agrobacterium tumefaciens
plasmid pTiC58. Nhân bản của gen GI từ E. coli trong khoai tây (Solanum tuberosum) và

cà chua (Lycopersi cum esculentum) đã đạt được và sự hiện diện của gen xyl đã được xác
nhận bởi sự biểu hiện của hoạt động tiêu hóa.
1.7.2. Quy chế di truyền và sinh tổng hợp glucose ispmerase
D-Xylose, mặc dù không phổ biến như đường như glucose, là một thành phần
chính của hemicelluloses thực vật . Các vi sinh vật sống sót trên các nguyên liệu thực vật
mục nát đã phát triển hiệu quả trên con đường sinh hóa để đồng hóa D-Xylose.
D-Xylose như là một nguồn năng lượng được sử dụng bởi các vi khuẩn thông qua
một con đường involving vận chuyển qua màng tế bào chất và isomerization để D-
Xylose. Dư lượng pentulose là phosphoryl hóa bởi xylulokinase đến năng suất D-
Xylose-5-phosphate và coj đường Embden – Meyer – Hoff.
a) Tổ chức di truyền của gen xyl
Salmonella typhimurium và E. coli: Nghiên cứu di truyền trên Sal - monella
typhimurium cung cấp bằng chứng về sự tồn tại của bốn nhóm gen (xyl operon) chịu
trách nhiệm về xy – mất dị hóa; đây là những xylT, một gen quy định cụ thể việc vận
chuyển xylose qua màng tế bào; xylA, glucose / xylose isomerase gen; xylB, gen