CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI BÁO CÁO
CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
NHÓM THỰC HIỆN:
• LÊ THỊ THÚY DUNG
• PHẠM MINH DUY
• DƯƠNG NGỌC KIỀU THI
• HỒ NAM VIỆT
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 05/2008
1
CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
I. CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ:
1. Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy” của DNA:
Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ
nóng chảy” (Tm) thì 2 mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối liền 2
mạch.
Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột sau khi nhiệt độ dao
động rất ít xung quanh Tm, do tính “cộng hưởng” của pjản ứng. Hiện tượng “cộng
hưởng” này giống như trên một dây kéo, khi ta tác động một lực kéo dưới một ngưỡng
nhất định thì hoàn toàn không có tác dụng. Nhưng nếu lực kéo đủ mạnh để làm bật chỉ
một nút nhỏ thì toàn bộ dây kéo sẽ bung ra mà không cần thêm một lực tác động nào.
Hình 1_đường cong Tm.
Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông
qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260nm. (h.1.1). Giá trị
mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có
2
Mạch
đôi

tên gọi là “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect). Nguyên nhân của hiện tượng này là
do trong phân tử DNA mạch đôi, các base (thành phần hấp thu ánh sáng ở bước sóng
260nm) nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song; cấu trúc đó che lấp 1
phần các base khiến chúng không hấp thu ánh sáng như những đơn vị toàn vẹn, khác
với ở DNA mạch đơn.
2. Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” của DNA:
Hai mạch đôi của phân tử DNA bắt cặp với nhau nhờ các liên kết hidro. Sự tách
rời 2 mạch tương ứng với sự phá vỡ các liên kết ấy. Do đó, số lượng các liên kết và yếu
tố làm thay đổi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi “nhiệt độ nóng chảy” của phân tử
DNA.
a. Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA:
Do số lượng các liên kết hidro giữa A và T, G và C không bằng nhau
(A=T; G C) nên thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có ảnh hưởng
rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là tỷ lệ các base G,C.
Trong điều kiện chuẩn , Tm được đánh giá bằng công thức sau:
Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C)
b. Ảnh hưởng của độ dài DNA:
Đọan DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hidro nối 2 mạch
càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng càng cao. Sự thay đổi Tm
theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau:
∆Tm = -500/số lượng cặp base
Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với
những đoạn DNA ngắn. Điều này chính là kết quả của tính “hợp tác” đã đề cập ở
phần trên.
c. Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch):
Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ
làm giảm tính ổn định của 1 phân tử lai. Thông thường người ta ước lượng Tm
giảm 1
0
C cho mỗi 1% phần trăm bắt cặp sai lệch. Nhưng cũng như thành phần các

base, các mismatch chỉ có ý nghĩa thực tiễn đối với các đoạn DNA ngắn.
3
d. Ảnh hưởng của môi trường phản ứng:
- Ảnh hưởng của nồng độ muối:
Sự giảm lực ion ( nồng độ muồi) của môi trường sẽ làm giảm rất
mạnh: nhiệt độ nóng chảy” .Tm sẽ giảm khỏang 15
0
C cho mỗi logarithm nồng độ
đối với các ion hóa trị I. Các cation hóa trị II còn có tác động mạnh hơn. Như vậy,
một dung dịch càng loãng thì càng làm mất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA.
- Ảnh hưởng của Formamide:
Hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm rất nhiều. Đối với những đoạn
dài hơn 100 cặp nucleotide, sự giảm Tm có thể được ước lượng theo
công thức sau:
∆Tm = - 0,6 x (% formamide)
Formamide được sử dụng trong các phương pháp lai phân tử nhằm
làm giảm nhiệt độ lai. Nồng độ thong dụng là 50% tương ứng với việc hạ Tm
xuống 30
0
C.
Trong thực tế, cần lưu tâm đến tất cả các chỉ tiêu nêu trên khi tính toán
Tm. Công thức thực nghiệm sau cho phép tập hợp mọi yếu tố để ước lượng Tm:
Tm = 16,6 log [M] + 0,41 (%GC) + 81,5 - %mismatch
- 675/chiều dài (cặp base) – 0,65 (% formamide).
Công thức này đúng cho những đọan DNA ngắn hơn 100 cặp
nucleotide; trrong đó [M] biểu thị nồng độ ion Na
+
.
II. KHÁI NIỆM VỀ LAI PHÂN TỬ:
1. Khái niệm về lai phân tử:

Sau khi 2 phân tử của mạch DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt
cặp trở lại sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột; lúc đó phân tử DNA
sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới 1 cấu hình không gian vô trật tự.
Ngược lại, nếu sau khi 2 mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với điều kiện
thí nghiệm thích hợp, 2 mạch sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là sự lai phân tử
(molecular hybridization), với 2 đặc điểm sau:
4
- Đặc hiệu tuyệt đối : Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự hoàn
toàn bổ sung dẫu chúng chỉ có 2 bản sao nằm lẫn giữa hàng triệu
trình tự khác.
- Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA , dẫn đến sự hình thành
các phân tử DNA_DNA, RNA_RNA, hay các pân tử lai DNA_RNA.
Hình 2a_Sự lai giữa
DNA và RNA.
Hình 2b_Quá trình lai DNA với
DNA, lai DNA với RNA.
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử:
a. Nồng độ DNA và thời gian phản ứng:
Để sự tái bắt cặp giữa 2 mạch đơn xảy ra, các trình tự bổ
sung phải tiến đến gần và ở vị trí đối diện nhau. Như vậy, tần số gặp
gỡ giữa 2 trình tự bổ sung sẽ quyết định quá trình tái bắt cặp.
5
Ở 1 nhiệt độ xác định, 2 chỉ tiêu ảnh hưởng đến tần số gặp gỡ là nồng
độ DNA và thời gian phản ứng.
Nồng độ DNA nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng
cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng, kết quả là tốc độ
phản ứng lai phân tử tăng lên.
Tương tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất trên
càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các
trình tự bổ sung đều tái bắt cặp (lai).

Hai thông số nói trên thường được xem xét đồng thời; tích số giữa
nồng độ và thời gian được gọi là Cot (C: concentration_nồng độ; t:
time_thời gian). Cot
1/2
là giá trị tại đó có 50% số phân tử lai.
b. Nhiệt độ:
Tốc độ phhản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường phản ứng lai
cực đại ở nhiệt đố thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%.
c. Độ dài của các trình tự :
Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc 2 của độ dài các trình tự bổ
sung.
d.Lực ion:
Nồng độ NACl 1M làm tằng tốc độ phản ứng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng
độ NaCl vượt quá 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng.
 Một vấn đề quan trọng trong lai phân tử là tạo một đầu dò có đánh dấu phóng xạ.
Thông thường người ta sử dụng đầu dò DNA bổ sung (cDNA).
- Sử dụng cDNA tổng hợp từ mRNA có một số ưu điểm:
1. Việc phân lập mẫu mRNA chuẩn dễ dàng hơn so với phân lập mẫu gene
DNA chuẩn cũng như tổng hợp đoạn primer và phân lập cDNA sau khi tổng hợp
dễ hơn.
6
2. cDNA có thể lai với cả RNA và DNA mã hóa nên RNA đó, rất hữu hiệu
trong phát hiện một lượng rất nhỏ RNA đặc hiệu.
Hình 3_các bước chuẩn bị cDNA.
Phương pháp chuẩn bị đoạn cDNA.
 Hầu hết mRNA chứa một chuỗi AAAA ở đuôi 3’, do đó chỉ cần tổng hợp đoạn
primer chứa khoảng 15 T và cho bắt cặp với đầu 3’ của mRNA. Enzyme phiên mã
ngược sau đó sẽ phiên mã một sợi DNA bổ sung từ đoạn primer TTTT này. Đoạn
cDNA có thể được phân lập bằng cách nâng pH của dd, nhờ đó tách mạch lai và
dùng enzyme phân hủy RNA.

III. CÁC KIỂU LAI PHÂN TỬ:
Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, tạm thời có thể chia chúng thành 3 nhóm
lớn:
- Lai trên pha lỏng.
- Lai trên pha rắn.
- Lai tại chỗ ( in situ hybridization).
1. Lai trong pha lỏng:
a. Nguyên tắc:
Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một
dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do
chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ.
Trong thực tế, nhiệt độ lai được chọn thấp hơn Tm khoảng 15
0
C; hơn
nữa, người ta còn thêm formamide để làm giảm nhiệt độ lai. Đối với
7
những trình tự ngắn, nhiệt độ lai được tính theo những công thức nêu ở
phần trên, đối với các trình tự dài, nhiệt độ lai thông dụng là 42
0
C.
b. Phân tích định lượng các phân tử lai:
Ba phương pháp thường được sử dụng là:
1. Phương pháp dùng quang phổ kế:
Như đã đề cập ở phần trên, DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng
yếu hơn DNA mạch đơn. Do đó, trong phản ứng lai, sự giảm OD
260nm tương ứng với sự tăng số lượng các phân tử lai ( do sự tái bắt
cặp giữa 2 mạch đơn bổ sung). Các giá trị OD được đo với 1 quang
phổ kế trong đó cuvet đựng mẫu đo có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ.
2. Phương pháp sử dụng Nuclease S1:
Nuclease S1 là 1 enzyme có khả năng thủy giải các nucleic

acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực
nghiệm. Dung dịch phản ứng lai được trích ra 1 phần, đem xử lý với
Nuclease S1. Các mạch đơn đều sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn
lại tương ứng với các phân tử lai. Chúng được thu nhận qua phương
pháp tủa rồi được đem định lượng.
3. Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite:
Hydroxylapatite là những tinh thể phosphate calci. Ở nồng độ
muối cao, chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn vào giá thể này, phần
nucleic kkhông gắn vào giá thể sẽ được thu nhận. Sau đó, nếu tăng
nồng độ phosphate lên, các nucleic acid đã gắn sẽ tách rời giá thể và
được thu nhận riêng. Số lượng DNA gắn (mạch đôi) và không gắn vào
giá thể (mạch đơn) được xác định bằng quang phổ kế; từ đó tính được
% tỉ lệ phân tử lai.
c. Các ứng dụng của phương pháp lai trong pha lỏng:
8