kỹ thuật cố định enzyme urease trên alginate, paraffin và lac

KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE TRÊN
ALGINATE, PARAFFIN VÀ LAC
MÔN: KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYME VÀ TẾ BÀO
NGÀY BÁO CÁO: T7 11/05/2013 – P.303 B6
HỌC VIÊN THỰC HIỆN:
1/ BÙI THỊ THU THẢO 12310751
2/ NGUYỄN TẤN ĐỨC 12310726


TỔNG QUAN
Hiện nay, enzyme urease (u-rê-a) được ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực quan trọng như:
+ Nông nghiệp: xúc tác quá trình thủy phân urea (u-rê) thành NH3, cung
cấp đạm cho cây trồng.
+ Môi trường: phân tích hàm lượng các kim loại năng trong chất thải rắn
và trong nước.
+ Thực phẩm: dùng để phát hiện sự tồn tại của urea trong thịt, cá, nước
giải khát, sản phẩm lên men và các sản phẩm từ sữa.
+ Cảm biến sinh học: dùng làm điện cực urease để xác định hàm lượng
urea trong dòng liên tục.
Để tăng hiệu quả sử dụng enzyme urease, người ta đã nghiên cứu cố
định enzyme nhằm:
+ tăng tính bền nhiệt
+ tăng phổ hoạt động trong pH rộng hơn
+ tăng thời gian bảo quản
+ tăng khả năng tái sử dụng


TỔNG QUAN
+ Enzyme urease có tên đầy đủ: carbamine amidohydrolase, là enzyme
xúc tác quá trình thủy phân urea thành ammonia và khí carbonic.

+ Bình thường urease tồn tại ở dạng tinh thể 8 cạnh, trong suốt không
màu, khối lượng phân tử 420 - 540 kDa.
+ Urease là enzyme có cấu trúc protein bậc 4, mỗi phân tử có từ 3 – 4 tâm
hoạt động. Trong tâm hoạt động có sự hiện diện các liên kết –SH và 2 ion
Ni2+ với vai trò tạo liên kết giữa enzyme và cơ chất ở giai đoạn tạo phức
chất trung gian, đây chính là một cofactor của urease.
Một số liên kết cộng hóa trị giữa urease và chất mang:
+ Titanium (IV) chloride + Silica === Urease
+ Chitosan + glutaraldehyde === Urease
+ Sợi tổng hợp: acrylamide + ethylene terephthalate, hoạt hóa bằng
glutaraldehyde === Urease
+ Polymethylglutamate (PMG) === Urease


TỔNG QUAN
Các loại chất mang được dùng để cố định urease:
+ PVC
+ Cellulose
+ Alginate
+ Vỏ các loại hạt (đậu phộng) hình ảnh tương ứng
+ Paraffin wax (sáp)
+ Lac film: một loại nhựa do côn trùng tiết ra trên cây
Sau khi cố định vào chất mang, người ta khảo sát các chỉ tiêu sau để
đánh giá hiệu quả cố định:
+ Hiệu suất cố định (tỷ lệ giữa hoạt tính urease tự do trong dung dịch với
urease cố định trên chất mang)
+ Khả năng tái sử dụng
+ Độ ổn định hoạt tính trong thời gian bảo quản
+ Mức độ thay đổi của các hệ số phản ứng xúc tác trước và sau cố định
+ Độ bền của chất mang sau mỗi lần phản ứng

GIỚI THIỆU NGHIÊN CỨU
+ Bài báo: “Cố định enzyme urease trên alginate, paraffin và lac” - Kespi
pithawala và cộng sự, Ấn Độ, 2009.
+ Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát sự thay đổi hoạt tính của urease cố
định trên 3 loại chất mang trên, để tìm ra chất mang phù hợp với urease.

Enzyme
urease thu
nhận từ cây
đậu jackbean
được cố định
lên alginate,
paraffin và lac
với matrix là
vải muslin, so
sánh với
enzyme tự do.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các loại vật liệu chính:
+ Enzyme urease thu nhận từ cây đậu Jackbean
+ Cơ chất urea mua từ hãng Loba Chem, Ấn Độ
+ Sodium alginate, thuốc thử Nessler, tris buffer (0,2 M) và những hóa chất
khác đều đạt chuẩn phân tích.
+ Paraffin wax (sáp), nhiệt độ nóng chảy 58-60oC mua của hãng Ranbaxy.
+ Lac thu nhận từ nhựa sâu cánh kiến trên cây bồ kết Albizzia lebbeck,
được tinh sạch và trích ly bằng methanol.

Cố định urease vào paraffin và lac đều sử dụng thêm vải cotton (muslin
cloth) để làm matrix tăng độ bám.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp cố định urease vào hạt gel calcium alginate:
+ Hòa tan 200 mg sodium alginate với 10 mg urease trong 10 ml nước,
trộn đều đến khi dung dịch sánh lại.
+ Tạo gel bằng cách nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 (2% w/v), khuấy nhẹ
nhàng hạt gel trong 20 phút, sau đó loại bỏ dung dịch, rửa gel bằng buffer.
Phương pháp cố định urease vào màng sáp paraffin:
+ Làm nóng chảy 4 g paraffin wax ở bể ổn nhiệt 65oC, hòa tan 1 g bột
enzyme vào hỗn hợp trên, khuấy đều ở tốc độ thấp.
+ Vải muslin được rửa sạch bằng nước cất, phơi khô dưới nắng mặt trời,
cắt nhỏ thành từ miếng 1 cm2 rồi cho vào dịch sáp paraffin để hấp phụ
enzyme vào mạng lưới cotton bên trong.
+ Sau 3 đến 5 giây ta dùng kẹp gắp những miếng vải này ra, lắc nhẹ
nhàng để dịch sáp bên ngoài rơi xuống, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
+ Như vậy enzyme đã được cố định vào vải với sự kết dính bởi sáp
paraffin.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thànlàh gì
Lac
phầ
: n lac:
+ Lac
Nhựa
là 4%:

một Gồm
loại nhự
nhựa
a sinh
mềm
họtan
c đượ
trong
c tạether
o ra bở
(25%)
i nhữvà
ngnhựa
con sâu
cứng
cákhông
nh kiếntan
cái
khôngether
trong
di chuyể
(75%).
n cóNhựa
tên khoa
là hỗn
họchợp
Laccifier
các poliester
lacca nhằ
dẫn

mchất
bảo của
vệ chú
cácngacid
khỏbéo
i tác
độnnhóm
có
g củaOH
điềuvàkiệ
các
n bấ
acid
t lợhữ
i củuacơ.
môi trường xung quanh.
-+ Chất
Con sâu
màucá
(2-3%):
nh kiếnGồm
này các
sốngchất
ở nhiề
đỏ u
tan
loạtrong
i cây,nước
tronglàđóphức
có cây

hợpbồcủa
kếtnhiều
.
+ Rệp
loại
acid
son
laccaic,
cánh kiến
chấtlàmàu
mộtvàng
côn trùng
khôngrất
tannhỏ,
trong
dàinước,
vào khoảng
erytrolaccin
0,6-0,7mm,
(1, 2, 5,rộng
0,3
7
tetrahydroxy-4-methylantraquinon).
đến 0,35 mm hình trông giống thuyền nhỏ, trên đầu có 2 râu, miệng có vòi
-nhỏ
Sápđể(6,6%):
hút nhựa.
Trong
Con
đócái

phần
mớitan
sản
trong
xuấtcồn
ra nhựa
nóng cánh
chiếmkiến
80%
(lac),
và phần
con đực
tan cũng
tạo nhựa
trong
benzen
nhưng
chiếm
tổ nhỏ
20%.
và Các
mỏng.
muối,
Tổ nhựa
đườngcủa
(glucose,
con đựcarabinose,
hơi hình thoi,
fructose).
còn tổ

-nhựa
Tạp chất:
của con
Xáccái
sâu
hình
kiến,
tròn.
đất, cát.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp thu nhận lac:
+ Lac được lấy từ những cành cây bị sâu cánh kiến bám vào, tạo tổ. Cắt
nhuyễn các cành cây này, nung lên rồi lọc qua vải lấy dịch. Hỗn hợp sau
đó được hòa tan trong methanol, giữ trong 2 ngày.
+ Ly tâm dịch này ở tốc độ cao trong 20 phút để loại cặn. Ta lấy phần dịch
trong cho vào chén sứ rồi cho bay hơi methanol trong 2 ngày. Phần cặn
còn lại chính là tinh thể lac được dùng cho thí nghiệm.
Phương pháp cố định urease vào lac:
+ Cân 2 g lac hòa tan trong 5 ml methanol. Bổ sung 1 g bột urease vào
hỗn hợp rồi khuấy đều. Cắt vải muslin như ở phần cố định với paraffin,
cho vào hỗn hợp để hấp phụ dịch enzyme.
+ Để biết lượng enzyme hấp phụ được trong vải muslin tẩm lac này là bao
nhiêu thì ta sẽ rửa sạch enzyme trong này ra, đo dịch thu được bằng
phương pháp Lowry với thuốc thử BSA để xác định hàm lượng protein
được cố định.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp đo hoạt tính urease tự do:
+ Để đo hoạt tính urease thì ta sẽ đo lượng ammonia tạo thành ở điều kiện
ủ enzyme này với cơ chất trong một khoảng thời gian nhất định. Dùng
thuốc thử Nessler để phản ứng màu, đo OD.
+ Một đơn vị hoạt tính urease được định nghĩa là 1 mol ammonia tạo thành
trong 1 phút từ 0,1 M urea ở điều kiện tiêu chuẩn.
Phương pháp đo hoạt tính urease cố định:
+ Gel alginate: +
ta NH3
cân khoả
ng 17 hạt
cho(NH2)Hg-O-HgI
vào 1 ml dung dịch phosphate
2(2KIHgI2)
+ 3KOH
+ 7KI + 2H2O
buufer 0,2 M ở pH 7, hỗn hợp này sẽ phản ứng với 1ml dung dịch urea 3%
trong 15 phút. Sau đó lấy hạt gel ra, làm lạnh dung dịch rồi cho H2SO4
vào để dừng phản ứng. Lúc này đo ammonia trong dung dịch theo phương
pháp như trên.
+ Màng paraffin wax và màng lac cũng được làm tương tự như với gel
alginate, nhưng cho phản ứng trong 30 phút. Quy trình được lặp lại tương
tự như trên.
Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính ổn định của số liệu.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp khảo sát cách thức bảo quản:
+ Enzyme cố định được giữ ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính theo dõi trong 1
tháng, so sánh với hoạt tính enzyme cố định ở thời điểm mới tạo thành để

xác định hiệu suất hoạt tính xem còn lại bao nhiêu.
+ Riêng enzyme cố định trên màng paraffin được khảo sát thêm 3 nghiệm
thức là: bảo quản trong buffer, trong nước cất và ở điều kiện khô.
+ Enzyme được cố định trong alginate được bảo quản trong dung dịch
CaCl2 do hạt gel ướt sẽ bền hơn hạt gel khô.
Phương pháp khảo sát nhiệt độ phản ứng thích hợp:
+ Enzyme tự do và enzyme cố định được ngâm trong phosphate buffer 0,2
M pH 7, và ủ ở nhiệt độ 30 đến 80oC trong 30 phút để xác định hoạt tính.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp xác định các thông số động học:
+ Để xác định các thông số động học, nồng độ cơ chất được thay đổi và giá
trị pH tối ưu của enzyme tự do và enzyme cố định được xác định dựa vào
sự thay đổi các giá trị pH của dung dịch đệm.
+ Hoạt tính tương đối của enzyme ở từng mức pH khác nhau được xác định
bằng phản ứng với thuốc thử Nessler như trên. Tốc độ phản ứng được đo
bằng mmole ammonia sản xuất ra trên một phút trên một mg enzyme.
+ Giá trị Kmax và Vmax xác định dựa trên giản đồ Lineweaver-Burke.


KẾT QUẢ THỰC HIỆN
6
1
2
3

5
4

Hoạt tính enzyme thay đổi
theo thời gian bảo quản
1: Màng paraffin khô
2: Màng paraffin trong buffer
3: Màng paraffin trong nước cất
4: Enzyme tự do
5: Ca-alginate
6: Lac film


KẾT QUẢ THỰC HIỆN

1

3

2

Hoạt tính enzyme thay đổi
theo số lần tái sử dụng
1: Ca-alginate
2: Màng paraffin khô
3: Lac film


KẾT QUẢ THỰC HIỆN
2

3
1

Hoạt tính enzyme ở nhiệt độ
khác nhau
1: Enzyme tự do
2: Ca-alginate
3: Lac film


KẾT QUẢ THỰC HIỆN

1
2
3

4

Hoạt tính enzyme ở pH khác nhau:
1: Enzyme tự do
2: Ca-alginate
3: Paraffin wax
4: Lac film


KẾT QUẢ THỰC HIỆN
1
2
3
4

Tương quan giữa tốc độ giải

phóng NH3 và nồng độ cơ chất:
1: Paraffin wax
2: Enzyme tự do
3: Ca-alginate
4: Lac film


KẾT LUẬN
+ Enzyme cố định thể hiện hoạt tính tốt hơn enzyme tự do.
+ Sau nhiều lần tái sử dụng, hạt gel alginate chuyển sang màu nâu và dễ bị
phân hủy, do đó thời gian bảo quản kém hơn cố định trên paraffin và lac.
+ Màng paraffin dạng khô cố định enzyme bảo quản tốt hơn dạng ướt, màng
trở nên dẻo hơn và protein ít bị rửa trôi.
+ Màng lac có đặc tính cơ học dai hơn màng paraffin, do đó sẽ bền hơn
trong các điều kiện phản ứng.
+ Tốc độ phản ứng Kmax với cơ chất ở alginate và lac tỏ ra thấp hơn so với
paraffin, trong khi đó paraffin thì thấp hơn so với enzyme tự do. Nguyên
nhân là khi cố định trên alginate ta dùng CaCl2 và trên lac ta dùng methanol
đã ức chế trong tâm hoạt động của urease. Trong khi đó cố định trên paraffin
thì trung tâm hoạt động giảm khả năng gắn với cơ chất.
Qua đề tài này, ta rút ra được những điều sau:
+ Khảo sát hiệu quả cố định của enzyme và cơ chất cần theo các bước như
trên, đi từ cơ chất đến lựa chọn phương pháp cố định.
+ Sau khi khảo sát sẽ đánh giá hiệu quả hoạt tính cố định.
+ Ghi nhận các giá trị thu được để làm tiền đề cho các thí nghiệm tiếp theo
liên quan đến enzyme đó.


XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN