Seminar kĩ thuật cố đinh enzyme

Cố định enzyme α-chymotrypsin trên chất mang nano

Người trình bày
Nguyễn Thị Lan Hương – 13313228
Lê Thị Mỹ Duyên - 13310294
1
BÁO CÁO
BÁO CÁO
Tháng 04.2014
Cố định enzyme α-chymotrypsin trên chất mang nano
1.
Tổng quan về α-chymotrypsin
2.
Nguồn thu nhận
3.
Phương pháp cố định
4.
Kết quả
5.
Ứng dụng
NỘI DUNG
2
1. Tổng quan về α-chymotrypsin
3
1.1. Mô tả

α-chymotrypsin = chymotrypsin A (EC 3.4.21.1)

Là một serine endopeptidase được tổng hợp từ tụy và hoạt động ở môi trường base.

Là 1 protease ngoại bào.


Hoạt hóa từ chymotrypsinogen bởi sự thủy phân liên kết peptide nhờ trypsin.

Phân cắt chọn lọc các liên kết peptide nội mạch của chuỗi polypeptide (liên kết ở các
amino acid thơm như tyrosine, phenylalanine, tryptophan).
1. Tổng quan về α-chymotrypsin
4
1.2. Lịch sử phát triển

Năm 1901, thí nghiệm phomat của Vernon xác định có ít nhất hai enzyme ổn định trong dịch tụy (Vernon
1902).

Năm 1934, Kunitz và Northrop xác nhận sự hiện diện của một loại enzyme ngoài trypsin, đặt tên là
chymotrypsin, có thể kết tinh chymotrypsin, cũng như tiền chất chymotrypsinogen.

Năm 1938, Kunitz cô lập các hình thức hoạt động khác nhau của chymotrypsin, xác định chúng như alpha,
beta, gamma (Kunitz 1938).
1. Tổng quan về α-chymotrypsin
5
1.2. Lịch sử phát triển

Năm 1948, Schwert đưa ra khối lượng phân tử của chymotrypsin và chymotrypsinogen.

Năm 1954, cơ chế ba bước của chymotrypsin thủy phân amide và ester đã được báo cáo bởi Hartley và
Kilby.

Năm 1964, Hartley xác định trình tự acid amin của chymotrypsin A và thu nhận.

Năm 1968, Smillie xác định trình tự acid amin của chymotrypsin B, trong đó có 80% tương đồng với
chymotrypsin A.

1. Tổng quan về α-chymotrypsin
6
1.2. Lịch sử phát triển

Trong những năm 1970 – 1980, nghiên cứu về cơ chế hoạt động, và xác định sự khác biệt về trình tự amino
acid giữa trypsin và chymotrypsin (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth và Polgar năm 1983, và
Graf et al . 1988).

Trong những năm 1990, chymotrypsin được tinh chế từ các nguồn khác bao gồm cả cá tuyết Đại Tây
Dương (Ásgeirsson và Bjarnason 1991), và lạc đà (Al-Ajlan và Bailey 1997).

Năm 2010, Ghaouar nghiên cứu tính gấp và biến tính của chymotrypsin trên nồng độ tác dụng, tương tác
chymotrypsin với chất hạt nano (Jordan, 2009).
1. Tổng quan về α-chymotrypsin
7
1.3. Cấu trúc
−
Dạng không hoạt động (chymotrypsinogen) gồm 245 amino acid.
−
Dipeptide 14-15 và 147-148 bị cắt bỏ, hình thành dạng hoạt động là chymotrypsin (241
amino acid).
−
Chymotrypsin gồm ba chuỗi protein liên kết với nhau bởi cầu nối disulfide:
+
Chuỗi A: 13 amino acid
+
Chuỗi B: 131 amino acid
+
Chuỗi C: 97 amino acid
8

1. Tổng quan về α-chymotrypsin
Cấu trúc trung tâm hoạt động
9
1. Tổng quan về α-chymotrypsin
Cấu trúc α-chymotrypsin
1. Tổng quan về α-chymotrypsin
10
1.4. Đặc tính

Trọng lượng phân tử: 25.6 kDa (Wilcox 1970)

pH tối ưu: 7.8 – 8.0 (Rick 1974)

Điểm đẳng điện: 8.52 (chymotrypsinogen) và 8.33 (chymotrypsin)

Trung tâm hoạt động: nhóm OH của

Histidine (H57)

Aspartate (D102)

Serine (S195)
1. Tổng quan về α-chymotrypsin
11
1.4. Đặc tính

Hóa chất kích hoạt

Cetyltributylammonium bromide (Spreti, 2008)


Dodecyltrimethylammonium bromide (Abuin, 2005)

Hexadecyltrimethylammonium bromide (Celej, 2004)

Tetrabutylammonium bromua (Spreti, 2001)
1. Tổng quan về α-chymotrypsin
12
1.4. Đặc tính

Chất ức chế:

Hydroxymethylpyrroles (Abell và Nabbs 2001)

Axit boronic (Smoum, 2003)

Các dẫn xuất Courmarin (Pochet, 2000)

Peptidyl aldehyde (Lesner, 2009)

Peptide từ các nguồn tự nhiên (Telang, 2009)

Peptide có chứa một acid amin tự nhiên (Legowska, 2009)
13
1.5. Cơ chế tác dụng
14
1.5. Cơ chế tác dụng

1. Tổng quan về α-chymotrypsin
15
1.6. Ứng dụng


Thực phẩm

Đông tụ sữa trong sản xuất pho mát

Chế biến thịt, cải biến giá trị cảm quan, làm tăng giá trị sản phẩm được thuỷ phân, làm
mềm nguyên liệu hoặc thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các dạng dịch thuỷ phân dễ hấp
thu, dễ tiêu hoá.

1. Tổng quan về α-chymotrypsin
16
1.6. Ứng dụng

Y học

Thủy phân protein giúp hỗ trợ phẫu thuật.

Chống phù nề và kháng viêm dạng men và giảm đau hạ sốt.

Làm lỏng các dịch tiết đường hô hấp ở người bệnh hen, viêm phế quản, các bệnh viêm phổi
và viêm xoang.

Đẩy nhanh hoạt động của tuyến bã và đào thải chất ứ.

2. Nguồn thu nhận
17

α-chymotrypsin thu nhận bằng cách hoạt hóa chymotrypsinogen, chiết xuất từ tụy bò.

Ngoài ra còn có thể thu nhận ở cơ thể động vật có xương sống bậc thấp và côn trùng như

dịch tụy cá tuyết, lạc đà, bê, cừu, heo.

Từ phế phụ liệu lò mổ động vật để sử dụng trong công nghệ thực phẩm.

Vi sinh vật chuyển gen chymotrypsin từ bê: Aspergillus niger, Kluyveromoces lactic.
18

3. Phương pháp cố định

Enzyme cố định: α-chymotrypsin

Vật liệu cố định: hạt Fe
3
O
4
nano

Chất liên kết: EDC.HCl (1-ethyl-3-(3-dimethylaminepropyl) carbodiimide hydrochloride)
19

3. Phương pháp cố định

Phản ứng cố định:
Phủ polyacrylamide lên hạt Fe
3
O
4
nano
Hoạt hóa nhóm amino trên hạt nano gel
Cố định enzyme

20

3. Phương pháp cố định

Các bước cố định: 3 bước
21

3. Phương pháp cố định
Bước 1: Phủ polyacrylamide lên
hạt Fe
3
O
4
nano
22

3. Phương pháp cố định
Bước 2: Hoạt hóa nhóm amino trên
hạt nano gel
23

3. Phương pháp cố định
Bước 3: Cố định enzyme
24

4. Kết quả
−
Hoạt tính riêng: 0.93 UI/mg
−
% hoạt tính so với enzyme tự do: 59.3%

−
Lượng enzyme cố định: 102 mg enzyme/g nanogel
−
Số lần tái sử dụng: 6
−
Nhiệt độ biến tính: >85
0
C (cao hơn so với enzyme tự do).
−
Thời gian bảo quản : 36 ngày ở 4
0
C hoạt tính không thay đổi, ở 25
0
C mất khoảng 10%
hoạt tính.
25

5. Ứng dụng
α-chymotrypsin cố định được sử dụng để:
−
Nghiên cứu mức độ phosphoryl hóa porcine pepsin A, mô hình protein và
phosphoprotein có tính acid (Barbora et al. 2009).
−
Xúc tác sự tổng hợp các liên kết peptide trong hỗn hợp phản ứng hữu cơ có hàm lượng
nước thấp ở nhiệt độ dưới 0
0
C (Marion et al, 1999).