Các kỹ thuật chủ yếu trong phân tích axit nucleic

Các kỹ thuật chủ yếu trong
phân tích axit nucleic
-Các phương pháp tách chiết DNA, RNA
-Các phương pháp phân tích DNA
i)Kỹ thuật PCR và nhóm phương pháp phụ thuộc
PCR
ii)Lai phân tử
iii)Giải trình tự


Tách chiết, định lượng và định tính axít nucleic
Yêu cầu:
-DNA đảm bảo độ tinh khiết
-Đảm bảo nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các bước
nghiên cứu tiếp
Các bước chính:
-Phá vỡ tế bào (vật liệu ban đầu) giải phóng các
DNA/RNA: cơ học, nitơ lỏng, chất tẩy (SDS) là phân tử
lưỡng cực kết hợp với protein màng và photpholipid làm
phá vỡ màng tế bào và nhân
-Bổ sung các chất chống các chất hoạt hóa enzyme DNAase
và làm biến tính các phân tử protein, các chất hữu cơ,..
-Tách DNA khỏi các tạp chất khác
-Thu, rửa, và hòa tan DNA


Quy trình chung:
1. Phá vỡ tế bào:
- Nghiền mẫu trong nito lỏng thành bột mịn
-Xử lý mẫu trong đệm CTAB ở 55-65 C
2. Loại bỏ protein và photpholipid:

-Ly tâm loại cặn, thu dịch nổi
-Xử lý với chloroform:isoamil
-Ly tâm loại bỏ các protein
3. Thu nhận DNA:
-Tủa DNA bằng isopropanol or ethanol
-Ly tâm thu tủa DNA và rửa lại bằng ethanol 70%
-Hòa tan DNA trong TE or nước cất
-Bảo quản 4C hoặc -20 đến -80 C


Vai trò một số chất thông dụng:
-Nito lỏng: làm cho màng (thành) tế bào cứng, giòn, dễ vỡ. Hạn
chế hoạt động của các enzyme phá hủy nucleotide
-EDTA: Hạn chế các enzyme phân hủy nội bào vì sự liên kết các
ion liên quan quá trình xúc tác thủy phân DNA (ion hóa trị 2 Mg,
Ca,..)
-Tris: điều chỉnh pH, tránh sự đứt gãy DNA trong môi trường kiềm
or acid
-CTAB (cetryl ammonium bromide): loại bỏ polysacaride hòa tan
DNA cao, hiệu quả cao ở 55-65 C.
-Chloroform: làm biến tính protein và loại bỏ liên kết DNA-CTAB
-Ethanol (2:1): tủa DNA trong điều kiện có lực ion, nồng độ muối
cao
- isopropanol (2:1) tủa DNA trong điều kiện không có muối, loại
bỏ RNA, DNA đứt gãy,..
-RNAse: loại bỏ RNA, Dnase: loại bỏ DNA
-TE/nước cất: hòa tan và bảo vệ DNA/RNA


1.1. Phương pháp tách chiết ADN

- DNA có kích thước lớn do đó cần tránh các tách
nhân gây đứt gãy.
- DNA genome (ĐV, TV) sau khi tách chiết phải có
kích thước lớn (15kb-300kb).
• Phương pháp tách chiết cơ bản gồm 4 bước:
 Bước 1. Phá vở màng tế bào và màng nhân. Ở tế
bào ĐV hoặc TV, bằng cách nghiền tế bào hoặc mô
trong nitơ lỏng – 1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy
(SDS, Sarcosyl) và proteinase K.


 Bước 2. Loại bỏ thành phần không mong muốn
trong mẫu, như các protein, polysaccharide. Mẫu
được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol:
chloroform: isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắc mạnh cho
đến khi dung dịch có dạng trắng sữa (Do protein bị
biến tính và kết tủa).


Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:
+ Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA.
+ Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa.
+ Phá dưới là dung dịch phenol: chloroform: isoamine


 Bước 3. Tủa axít nucleic
+ Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở
-20oC trong 30 phút hoặc ở 0oC qua đêm. Hầu như
toàn bộ các phân tử axít nucleic đều kết tủa.
+ Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0oC, các phân tử

DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa.
>>> Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn
được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối và isopropanol
còn lại.
 Bước 4. Hoà tan căn (DNA, RNA) và xử lý loại bỏ
RNA bằng enzyme Rnase. Sau đó kết tủa lại được
DNA.


1.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và mRNA
- Chú ý:
+ Phân tử RNA không bên, dễ bị phân huỷ bởi
enzyme Rnase.
+ Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong
nước bọt, trong không khí…).
+ Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt.
Do đó: Thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều
kiện vô trùng, tránh tiếp xúc bằng tay trần.


Phương pháp tách chiết RNA tổng số và mRNA
Tách RNA tổng số: tương tự 3 bước khi tách chiết DNA. Ngoại trừ:
-Tránh sự dễ phân hủy của RNA bởi enzyme RNase,tất cả các dung
dịch và dụng cụ thí nghiệm được xử lý DEPC và khử trùng ở nhiệt độ
cao.
-Cẩn thận các thao tác tránh sự nhiễm Rnase từ môi trường.
-Nghiền mẫu trong chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl), chất gây biến tính
(guamidium thiocyanate), chất khử (mercaptoethanol) để ức chế
Rnase nội bào và tách protein liên kết.
-Loại bỏ DNA bằng Dnase

Tinh sạch mRNA:
-rRNA (80-85%); tRNA(15-20%),mRNA(1-5%), snRNA(<1%)
-Tách mRNA bằng đuối polyA (~100A): sắc ký ái lực trên cột (or bề
mặt hạt) oligodT-cellulose


• Tách chiết mRNA
- Dựa vào phân tử mRNA có đuôi poly A
- Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần, cho qua cột
sắc ký ái lực (oligod T-cellulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn
oligod T).
- mRNA có đuôi poly A sẽ tiên kết bổ sung với đoạn oligod T.
- Dùng dung dịch rửa cột, các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ
còn mRNA được giữ lại.
- Sau đó dùng dd có nồng độ muối thấp rửa cột hoặc li tâm
sẽ thu được các phân tử mRNA.



2. Các phương pháp phân tích định tính và
định lượng axít nucleic
2.1. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế
-Các axit nucleic trong dung dịch sẽ hấp thụ ánh sáng tia cực tím
(UV) trong dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại ở
260 nm.
-Vì các DNA và RNA và các nucleotide cùng có độ hấp thụ cực
đại ở 260 nm, nên DNA không thể xác định bằng máy đo quang
phổ trong vùng cực tím khi dung dịch bị nhiễm nucleotide và
RNA. Do vậy RNA cần được loại bỏ bằng phương pháp thuỷ
phân với enzyme RNase. Các nucleotide và oligonucleotide thu

được từ thuỷ phân RNA cũng cần được loại bỏ, nếu không loại bỏ
sẽ dẫn đến đánh giá thừa hàm lượng DNA của mẫu thử. Ngoài ra
DNA xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV ít hơn DNA xoắn đơn nên
cần lưu ý đến hệ số hấp thụ khi tính toán nồng độ.


Kiểm tra bằng quang phổ kế:
DNA: OD260nm/OD280nm~1,8-2,0
RNA:
~2,0
Nồng độ: 1OD260nm~50ug/ml (DNA mạch kép)
~40ug/ml (RNA)
~33ug/ml (DNA mạch đơn)


2.2. Phân tích định tính bằng Phương pháp điện di
Nguyên tắc của điện di:
- Dựa vào đặc tính phân tử (DNA, RNA)
mang điện tích âm. DNA được phân tách
bằng phương pháp điện di dựa trên điện tích
và phân tử lượng của chính nó. Ethidium
bromide (EtBr) liên kết vào các phân tử DNA
và khi được kích thích bằng ánh sáng UV sẽ
phát huỳnh quang da cam. Do lượng huỳnh
quang tỉ lệ với lượng DNA tổng số, nên số
lượng DNA có trong mẫu có thể được ước
tính bằng cách so sánh huỳnh quang được tạo
ra bởi mẫu chưa biết với một dãy định lượng
chuẩn. Để định lượng chính xác hơn về hàm
lượng DNA thì RNA phải được loại bỏ bằng

phương pháp enzyme


- Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào:
+ Điện tích, kích thước và cấu trúc không gian của
phân tử.
+ Nồng độ của chất cấu thành gel.
- Gel sau khi điện di được nhuộm với chất ethidium
bromide, EtBr xen vào giữa các base và soi dưới tia
UV (λ ≈ 300nm) axit nucleic sẽ có màu đỏ da cam.



Có 2 loại gel sử dụng điện di:
+ Gel agarose dùng điện di axít nucleic
+ Gel polyacrylamide dùng để điện di axit nucleic và
protein.
- Việc chọn loại gel và nồng độ gel tuỳ thuộc vào kích
thước đoạn axít nucleic cần phân tách.


Kiểm tra bằng điện di: So sánh với mẫu chuẫn để
kiểm tra nồng độ (tương đối)
- agarose 0,8-1,5% và nhuộm gel bằng EtB
-Polyacrylamide: Xác định trình tự DNA, tách các đoạn
nhỏ


 Gel agarose:
- Đây là loại gel thông

dụng nhất, sử dụng đơn
giản
- Dùng để tách các đoạn
(DNA, RNA) có kích
thước từ 0,2-20Kb.
- Gel đổ trên một giá thể
nằm ngang và điện di
theo phương nằm
ngang.


 Gel polyacrylamide
- Dùng để tách các đoạn (DNA, RNA có khích thước nhỏ dưới 1000
cặp base.
- Thao tác phức tạp hơn gel agarose
- Mục đích sử dụng:
+ Tính sạch các đoạn oligonucleotide tổng hợp
+ Xác định trình tự DNA
+ Tách đoạn DNA nhỏ (trong kỹ thuật SSR, AFLP, RFLP…)
+ Điện di protein
- Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và điện di theo chiều thẳng
đứng.
- Thường nhuộm bạc,có độ nhạy cao.