Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống invitro lan vũ nữ (oncidium) tại hà tĩnh

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
KHOA NÔNG LÂM NGƯ
-------  -------

SINH VIÊN

PHẠM MINH CHÍNH

TÊN ĐỀ TÀI:

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ
BÀO TRONG NHÂN GIỐNG INVITRO LAN
VŨ NỮ (ONCIDIUM) TẠI HÀ TĨNH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
KỸ SƯ NGHÀNH NÔNG HỌC

VINH – 1.2009


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung
thực và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận này đã được
cám ơn và mọi thông tin được trích dẫn trong khoá luận đều đã được chỉ rõ
nguồn gốc
Tác giả khoá luận

Phạm Minh Chính


iii

LỜI CẢM ƠN !
Để hoàn thành khoá luận này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã
nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của Ban chủ nhiệm khoa Nông Lâm Ngư - Đại
học Vinh cùng với khoa Kỹ Thuật - Công Nghệ - Đại học Hà Tĩnh.
Để tôi có được kết quả như ngày hôm nay, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết
ơn sâu sắc tới ThS. Trương Xuân Sinh – khoa Nông Lâm Ngư đại học Vinh và
ThS. Trần Thị Thuý Anh – Trung Tâm ứng dụng tiến bộ khoa học công nghệ Hà
Tĩnh đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và
hoàn thành khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Khoa Học Cây
Trồng, các anh chị thuộc trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học - công nghệ Hà
Tĩnh đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài này.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, tập thể lớp 45K
Nông Học cùng toàn thể bạn bè – những người đã giúp đỡ tôi, cùng tôi chia sẻ
những khó khăn trong thời gian qua.
Vinh, ngày 25 tháng 12 năm 2008
Sinh viên
Phạm Minh Chính


iv

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................ii
Tác giả khoá luận...............................................................................................ii

PHỤ LỤC


v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
BA : 6 Benzyn amino purin
Kinetin : 6 Fufurolamino purine
IBA : Indol – 3- Butyric Acid
NAA : Naphthalene Acetic Acid
MS :Murashige - Skoog
W : White


vi


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng giai đoạn vào mẫu
Bảng 3.2 : Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân chồi
Bảng 3.3 : Ảnh hưởng của đường sacarose lên quá trình nuôi cấy
Bảng 3.4 : Ảnh hưởng của các chất phụ gia bổ sung trong môi trường nuôi cấy
Bảng 3.5 : Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân chồi
Bảng 3.6 : Ảnh hưởng của K đến quá trình nhân chồi
Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của BA kết hợp K trong quá trình nhân chồi
Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ
Bảng 3.9 : Ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng giai đoạn vào mẫu
Hình 3.2 : Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân chồi
Hình 3.3 : Ảnh hưởng của đường sacarose lên quá trình nuôi cấy
Hình 3.4 : Ảnh hưởng của các chất phụ gia bổ sung trong môi trường nuôi cấy
Hình 3.5 : Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân chồi
Hình 3.6 : Ảnh hưởng của K đến quá trình nhân chồi
Hình 3.7 : Ảnh hưởng của BA kết hợp K trong quá trình nhân chồi
Hình 3.8 : Ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ
Hình 3.9 : Ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ
Hình 10 : Hoa lan Vũ Nữ ( Oncidium)
Hình 11 : Môi trường nuôi cấy
Hình 12 : Chuẩn bị môi trường, bố trí thí nghiệm


ix

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng giai đoạn vào mẫu
Đồ thị 3.2 : Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân chồi
Đồ thị 3.3 : Ảnh hưởng của đường sacarose lên quá trình nuôi cấy
Đồ thị 3.4 : Ảnh hưởng của các chất phụ gia bổ sung trong môi trường nuôi cấy
Đồ thị 3.5 : Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân chồi
Đồ thị 3.6 : Ảnh hưởng của K đến quá trình nhân chồi
Đồ thị 3.7 : Ảnh hưởng của BA kết hợp K trong quá trình nhân chồi
Đồ thị 3.8 : Ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ
Đồ thị 3.9 : Ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ

1

MỞ ĐẦU
1.Lý do chọn đề tài
Từ xưa cho đến nay, hoa lan luôn được con người ngưỡng mộ và được xem
như là nữ hoàng của các loài hoa, loài hoa của vương giả hay vua của những loài
cỏ cây có hoa. Do có vẻ đẹp quyến rũ mê hồn về màu sắc, hương thơm đặc biệt,
các đường nét thật cầu kỳ và sắc sảo của cánh hoa thêm vào đó hoa lan có đặc
tính bền và tươi lâu nên nó không chỉ chiếm ưu thế trong đời sống tinh thần của
con người mà còn trở thành một mặt hàng mang lại nguồn thu lớn cho ngành
nông nghiệp. Đặc biệt là các nước thuộc châu Á nhiệt đới như Thái Lan,
Singapo, Malayxia, Nhật bản…
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cùng với sự phát triển nhanh chóng
của nền kinh tế - xã hội, nhu cầu sử dụng hoa nói chung và hoa lan nói riêng
cũng tăng nhanh. Hoa không chỉ dùng trong những dịp lễ tết như trước đây mà
nhu cầu về hoa trong cuộc sống thường ngày của người dân cũng rất lớn. Bên
cạnh nhu cầu về số lượng thì chất lượng cũng đòi hỏi ngày càng cao. Trong khi
thực tế sản xuất hoa ở Việt Nam cũng gặp rất nhiều khó khăn về giống, cơ sở vật
chất, kỹ thuật...dẫn đến số lượng và chất lượng hoa lan chưa đáp ứng được thị
hiếu của người tiêu dùng.
Gần đây, nhờ việc áp dụng công nghệ kỹ thuật mới trong lĩnh vực sinh học
đó là công nghệ nuôi cấy mô tế bào đã tạo ra sự đa dạng về màu sắc, phong phú
về chủng loại của các loài hoa lan.Vì vậy ngày càng đáp ứng được thị hiếu của
người thưởng thức và chơi hoa.
Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào với những ưu điểm nổi trội là: cho hệ số
nhân giống rất cao; sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diện
tích sản xuất và vật liệu nhân giống ban đầu; cây giống sản xuất ra hoàn toàn
sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, việc vận chuyển cây giống đi xa thuận

tiện, tổn thất ít, chất lượng cây được đảm bảo do đó đáp ứng được các yêu cầu về
sản xuất cây giống hoa phong lan hiện nay.


2

Vũ nữ (Oncidium) là một trong những loài phong lan quý được nhiều người
ưa chuộng và ngưỡng mộ. Việc nhân giống bằng biện pháp truyền thống xẻ thân
không mang lại hiệu quả cao mà còn làm cho giống lan này ngày một ít đi và có
nguy cơ diệt vong.
Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài: ''ứng
dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống invitro loài lan Vũ Nữ
(Oncidium) tại Hà Tĩnh ''
2. Mục đích nghiên cứu.
Mục đích của đề tài này là nhằm áp dụng cơ sở khoa học của phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật để nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống invitro
lan Vũ Nữ, sản xuất được nguồn cây giống sạch bệnh với số lượng lớn, chất
lượng cao ở tỉnh Hà Tĩnh.
3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu
- Đối tượng: Cây lan Vũ nữ: Giống Vũ nữ Oncidium Grower Ramsey, với
hoa màu vàng tươi có chấm nâu, cánh hoa nhỏ, cành có nhiều chùm hoa.
- Nội dung nghiên cứu:
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong giai đoạn vào mẫu
lan Vũ Nữ
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân
chồi của lan Vũ Nữ (Oncidium)
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của sucarose lên quá trình nuôi cấy lan Vũ Nữ
(Oncidium)
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất phụ gia bổ sung trong môi trường
nuôi cấy lan Vũ Nữ (Oncidium)

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng BA đến quá trình
nhân chồi lan Vữ Nữ (Oncidium)
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng Kinetin đến quá
trình nhân chồi lan Vữ Nữ (Oncidium)


3

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng BA kết hợp với
kinetin đến quá trình nhân chồi lan Vữ Nữ (Oncidium)
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA đến quá trình
tạo rễ lan Vữ Nữ (Oncidium)
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA đến quá
trình tạo rễ lan Vữ Nữ (Oncidium)
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Trên cơ sở xác định được các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến quá
trình nuôi cấy mô tế bào từ đó xây dựng được quy trình nhân giống lan Vũ Nữ
invitro.
- Vũ Nữ là một trong những loài lan khó nhân giống bằng phương pháp xẻ
thân truyền thống nên việc xác định và làm chủ được quy trình nhân giống
invitro là một việc làm hết sức quan trọng nhằm sản xuất hàng loạt cây giống
chất lượng cung cấp cho nghành công nghiệp sản xất lan thương mại đang phát
triển ở nước ta
- Các công trình nghiên cứu về nhân giống hoa lan ở nước ta chưa nhiều,
chưa được ứng dụng rộng rãi, đề tài này sẽ đi sâu nghiên cứu vào môi trường
nuôi cấy đặc biệt là sử dụng các chất kích thích sinh trưởng trong nhân giống hoa
lan nhằm góp phần tạo một bước đột phá trong nghành công nghiệp hoa lan ở
tỉnh Hà Tĩnh và khu vực Bắc Trung Bộ.

4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm thực vật học của cây hoa lan
* Rễ lan
Nhìn chung họ lan thuộc các loài cây thân thảo, sống lâu năm, chúng sống ở
đất, vách đá hoặc sống phụ, sống hoại... Vì vậy, đặc điểm rễ lan có sự khác biệt
lớn giữa các giống loài ( Vừ Văn Chi, 1969). Khi sống ở đất, chúng thường có
dạng củ nạc, rễ mập và xum xuê hoặc có chân rễ bò dài hay ngắn. Tuy nhiên, nét
độc đáo nhất của họ lan là lối sống phụ bám (bì sinh), treo lơ lửng trên các thân
cây gỗ khác. Chúng phát triển các dạng thân rễ nạc, dài, ngắn, mập hay mảnh
mai (tuỳ thuộc từng loài) đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày đặc.
Một vài loài Oncidium: Oncidium sphacelatum rễ mọc thành đám rối dày
đặc .
* Thân lan
Có hai nhóm thân chính là đơn thân và đa thân. Thân lan có thể ngắn hay
kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá hay không mang lá (Việt Chương, Nguyễn
Việt Thái, 2002), (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
Ở nhóm đa thân thì cây vừa có thân vừa có giả hành. Giả hành là nơi dự trữ
chất dinh dưỡng và nước để nuôi cây. Đây được đánh giá là bộ phận rất cần thiết
cho sự sinh trưởng và phát triển của lan đa thân. (Nguyễn Xuân Linh, 2002) .
Lan Vũ Nữ thuộc nhóm lan đa thân thường có giả hành dẹp tận cùng có 1 2 lá dẹp hay hình trụ (Dẫn theo Nguyễn Công Nghiệp, 2006) .
*Lá lan
Hầu hết các loài lan đều là cây tự dưỡng do đó nó phát triển đầy đủ hệ
thống lá mềm mại, duyên dáng và hấp dẫn. Lá mọc đơn độc hoặc xếp dày đặc ở
gốc, hay xếp cách đều đặn trên thân, trên củ giả... Hình dạng lá thay đổi rất
nhiều, từ loại lá mọng nước, nạc, dài, hình kim, hình trụ dài, tiết diện dài hay có
rãnh đến loại lá hình phiến mỏng, dài, màu xanh bóng đậm hay nhạt tuỳ theo vị

5

trí sống của cây, đặc biệt rất hiếm loại lá hình tròn thuôn dài thành bẹ ôm lấy
thân (Nguyễn Xuân Linh, 2002).
* Hoa lan
Cấu tạo hoa lan cực kỳ phong phú và hấp dẫn. Ta có thể gặp nhiều loài mà
mỗi mùa chỉ có một đoá hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơm
một bông. Tuy nhiên, đa số các loài lan đều nở rộ nhiều hoa, tập hợp lại thành
chùm phân bố ở đỉnh thân hay nách lá. Hoa lan có cấu trúc cơ bản là hoa mẫu ba,
kiểu hoa đặc trưng của hoa lớp một lá mầm nhưng đó biến đổi rất nhiều để hoa
có đối xứng qua một mặt phẳng. Hoa lan thuộc hoa lưỡng tính, rất hiếm gặp loài
đơn tính, bao hoa có dạng cánh xếp thành hai vòng (Võ Văn Chi, 1978)(Nguyễn
Xuân Linh, 2002).
Hoa lan có 3 cánh đài, thường có cùng màu sắc và kích thước. Tuy nhiên,
các loài lan khác nhau, cánh đài có hình dạng biến đổi rất khác nhau. Dạng hình
tròn như các giống Vanda, Ascocentrum, nhọn như Cattleya, xoắn như các loài
thuộc giống Laelia. Nằm kề bên trong và xen kẽ với ba cánh đài là hai cánh hoa,
thường cũng giống nhau về hình dạng, kích thước và màu sắc.Cánh còn lại nằm
ở phía trên hay phía dưới của hoa, thường có hình dạng và màu sắc đặc biệt khác
hẳn hai cánh kia gọi là cánh môi hay cánh lưỡi.Chính cánh môi quyết định phần
lớn giá trị thẩm mỹ của hoa lan (Nguyễn Xuân Linh, 1998) .
Trụ hoa là bộ phận sinh dục của hoa, bao gồm cả cơ quan sinh dục đực và
cái nên được gọi là trục - hợp - nhụy. Phần cái mang noãn hình lồi, bề mặt dính
chất nhầy. Phần đực mang phấn khối, phấn của hoa lan không tách ra thành từng
hạt nhỏ mà kết tụ lại thành những đám đặc có ít hay nhiều sáp. Số lượng phấn
khối là 2, 4, 6, 8 có dạng cong hay thuôn lưỡi liềm. Hoa phong lan có bầu hạ,
thuôn dài kéo theo xuống. Sự vặn xoắn toàn bộ hoa trong quá trình phát triển là
đặc điểm của bầu. Hoa thường bị vặn xoắn 180 o sao cho cánh môi khi hoa bắt
đầu nở hướng ra bên ngoài, thuận lợi cho côn trùng đậu. Hiếm khi hoa vặn 360 o
như ở Malayxia, Paludosa hoặc không vặn gì do cuống hoa rủ xuống như loài

Stanhopea. Như thế khi hoa nở, cánh môi hướng lên trên, thích nghi với loại côn


6

trùng ưa lộn đầu xuống dưới khi chui vào hoa. Bầu hoa có 3 ô gọi là 3 tâm bỡ.
Trong bầu chứa vô số các hạt nhỏ li ti gọi là tiểu noãn nằm trên 3 đường, dọc
theo chiều dài của 3 mép tâm bì. Sau khi thụ phấn, thụ tinh, các tiểu noãn sẽ biến
đổi và phát triển thành hạt trong khi đó bầu noãn sẽ phát triển thành quả. Hoa lan
Vũ Nữ thường nhỏ nhưng đặc biệt có cánh môi rất lớn. Hoa thường là màu vàng
với đốm nâu, có thể rất dài.
* Quả lan
Quả lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3 – 6 đường nứt dọc. Có dạng từ
quả cải dài đến dạng hình trụ ngắn, phình ở giữa. Khi chín quả nở ra và mảnh vỏ
còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Ở một số loài khi quả chín nứt
theo 1 – 2 khía dọc, thậm chí không nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi vỏ khi vỏ này bị
mục nát (Nguyễn Tiến Bân, 1990).
* Hạt lan
Hạt lan rất nhiều, nhỏ li ti. Hạt chỉ cấu tạo bởi một khối chưa phân hóa, trên một
mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí, sau 2 – 18 tháng hạt mới chín. Phần lớn hạt
thường chết vì khó gặp nấm cộng sinh cần thiết để nảy mầm do đó hạt nhiều, nhẹ có
thể theo gió bay phát tán rất rộng nhưng hạt nảy mầm thành cây rất hiếm. Chỉ trong
những khu rừng già ẩm ướt vùng nhiệt đới mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm.
Khối lượng toàn bộ hạt trong một quả chỉ bằng 1/10 – 1/1000 mg, trong đó không khí
chiếm xấp xỉ 76 – 96% thể tích hạt.
1.2. Thành phần môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào
Môi trường nuôi cấy là điều kiện cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân
hoá tế bào và cơ quan trong nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy phải có đầy đủ chất dinh dưỡng và các chất cần thiết
cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như cho sự sinh trưởng bình thường của

cây.
Đến nay, có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây
dựng và thử nghiệm. Hầu hết các loại môi trường đều bao gồm những nhóm chất
chính sau đây:


7

TT
1
2
3
4
5
6

Thành phần môi trường dinh dưỡng
Các loại muối khoáng đa lượng, vi lượng
Nguồn các bon
Vitamin
Các chất điều hoà sinh trưởng
5. Các nhóm chất bổ sung
Chất độn

1.2.1. Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô tế bào
thực vật được chia thành 2 nhóm theo hàm lượng sử dụng: Nhóm đa lượng và
nhóm vi lượng
a. Các nguyên tố khoáng đa lượng:
Bao gồm các nguyên tố khoáng: N, P, S, K, Mg, Ca,... được sử dụng ở nồng

độ trên 30 ppm, tức là trên 30mg/l.
- Nitơ ( N): Hai dạng NO3- và NH4+ được sử dụng riêng rẽ hoặc phối hợp
với nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành amonium thông
qua hệ thống nitrat reductase. Amonium được tế bào thực vật đồng hoá trực tiếp
để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ như amoni axit. Điều đáng lưu ý là
nếu chỉ dùng amoni thì sinh trưởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hẳn.
Nguyên nhân chính là do quá trình trao đổi ion của tế bào xảy ra lệch dẫn đến
tình trạng thay đổi pH của môi trường. Vì vậy, hầu hết các loại môi trường đều
dùng nitrat và amonium dạng phối hợp, nhưng tuỳ theo đặc tính hấp thu nitơ của
loài cây đó mà phối hợp tỷ lệ thích hợp.
- Lưu huỳnh ( S): Chủ yếu và tốt nhất là muối S042-. Các dạng ion khác như
S03 hoặc S02 thường kém tác dụng, thậm chí là độc.
- Phốtpho ( P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về photpho rất
cao. Photpho là một trong những thành phần cấu trúc của axit nucleic. Ngoài ra,
khi photpho ở dạng H2P04- còn có tác dụng như một hệ đệm, làm ổn định pH của
môi trường trong quá trình nuôi cấy.
b. Các nguyên tố khoáng vi lượng


8

Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm. Đó là: Fe,
B, Mn, I, Mo, Zn, Ni, Co, ...
- Sắt ( Fe): Thiếu sắt, tế bào mất đi khả năng phân chia. Thí nghiệm với sắt
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 59Fe cho thấy sắt được dự trữ trong nhân rất
nhiều. Thiếu sắt làm giảm ARN và giảm sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng
lượng ADN và axit amin tự do, kết quả là giảm phân bào. Sắt thường tạo phức
hợp với nhiều thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi phức hợp này
thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào.
Tốt nhất nên sử dụng sắt ở dạng phức FeCl2.FeCl3.6H20; FeS0.7H20; Fe2(S04)3;

Fe(C4H40) hoặc với EDTA ( Etylen Diamin Tetra axetic axit). Từ các phức chất
này sắt được giải phóng ra trong một phạm vi pH khá rộng.
- Mangan ( Mn):Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino axit tự do và
ADN tăng lên, nhưng hàm lượng ARN và sinh tổng hợp protein giảm, quá trình
phân bào bị ức chế.
- Bo ( B): Thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì
thực tế B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy
có biểu hiện thành mô sẹo hoá mạnh, nhưng thường là loại mô xốp, mọng nước,
kém tái sinh.
- Molypden ( Mo): Đóng vai trò co-factor trong hệ thống nittrat reductase.
Như vậy Mo tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật
1.2.2. Nguồn cacbon
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro sống chủ yếu theo phương thức dị
dưỡng. Mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều
kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Việc bổ sung vào môi
trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn cacbon thông
dụng nhất đã được kiểm chứng là saccarorose nồng độ thích hợp là 2-3% song
cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi xuống tới 0.2%
và tăng lên tới 12%


9

Glucose và maltose cũng thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy
( glucose cho nuôi cấy protoplast và mantose cho nuôi cấy bao phấn lúa), các loại
đường như fructose, raffinose, lactose ... cũng được thử nghiệm nhưng tỏ ra kém
hiệu quả và chỉ được dùng trong trường hợp đặc biệt.
1.2.3. Vitamin
Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả năng
tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do

đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B.
Bảng: Một số vitamin thường dùng trong môi trường nuôi cấy
Tên vitamin
Myo- Inositol
Axit nicotinic ( niaxin)
Pyridoxine HCl ( Vitamin B6)
Thiamine HCl ( B1)
Pandothenat canxi
Riboflavin ( B2)

Nồng độ sử dụng ( mg/l)
100
0.5 – 1
0.05 – 0.5
10 – 50
1- 5
1- 5

Các vitamin thường được pha trong hỗn hợp các dung dịch mẹ có nồng độ
cao gấp 500 – 1000 lần so với dung dịch làm việc, cần giữ trong điều kiện lạnh
dưới 00C để tránh nấm khuẩn nhiễm tạp.
1.2.4. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, một thành phần có vai trò
quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hoà sinh trưởng.
Những chất đó thuộc các nhóm sau:
- Auxin: Là một loại hoocmon thực vật ( phytohormon) do Went và
Thimanm phát hiện ( 1937), chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào, nhưng
cũng có vai trò làm tăng phân bào. Có 4 loại auxin thường được sử dụng trong
nuôi cấy mô là:
+ Indolylaxetic ( IAA)

+ Naphthyl axetic axit ( NAA)
+ 2,4 – Dichlorphenoxy axetic axit ( 2,4- D)


10

+ Indol butyric axit ( IBA)
- Xytokinin: Là hoocmon phân bào lần đầu tiên được Skoog ( 1950) phát
hiện trong một thí nghiệm chiết xuất axit nucleic bị sơ suất. Đó là những cấu trúc
của nucleic axit bị phân huỷ thành. Xytokinin thường được sử dụng trong nuôi
cấy mô là:
+ Kinietin: Cấu trúc phân tử: 6-( 2- furfuryl)- amino purin
+ BAP: 6-Benzyl amino purin
+ Zeatin: Cấu trúc phân tử 6-(hyđroxy-3-methybut-2-enyl) aminopurin
- Gibberellic axit: Được phát hiện vào những năm 1930. Loại Gibberellic
axit thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3.
Trong đời sống thực vật, Gibberellic axit đóng vai trò quan trọng đối với
nhiều quá trình sinh lý. Nhưng tác động của GA trong nuôi cấy mô và tế bào thực
vật chưa thực sự rõ ràng.
Bảng: Một số chất điều khiển sinh trưởng thường dùng
Tên chất sinh trưởng
Nồng độ sử dụng ( mg/l)
2,4 D [ dichlorophenoxy axetic]
0.2 - 5
α_NAA [ naphtyl axetic axit]
0.1 - 5
β_NAA [ indol axetic axit]
5 -20
IBA [ indol butyric axit]
0.1- 5

Kinetin [ 6 finfuryl amino purine]
0.1 -2
BA [ 6_ BAP] [6 benzylaminopurine]
0.1 - 2
GA [Gibberelic axit]
0.1 – 2
Thông thường, pha dung dịch mẹ chất sinh trưởng có nồng độ cao gấp 1000
lần so với dung dịch làm việc.
1.2.5. Các chất phụ gia tự nhiên
Các nhà khoa học nghiên cứu về nuôi cấy mô thường sử dụng môi trường
dinh dưỡng rất đơn giản, chỉ gồm nước, muối khoáng và đường. Ngày nay người
ta đã chứng minh rằng môi trường đơn giản như thế không đủ để cho tế bào sinh
trưởng bình thường. Vì vậy, thành phần môi trường ngày càng bổ sung phong
phú và phức tạp hơn nhiều. Người ta đã sử dụng một số hỗn hợp dinh dưỡng tự
nhiên như:


11

- Nước dừa: Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là
myo- inositol và một số axits amin khác. Lượng nước dừa dùng trong môi trường
cấy thường khá lớn từ 15 – 20% thể tích môi trường.
- Dịch chiết nấm men: Với dịch chiết nấm men, White ( 1934) lần đầu tiên
nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn. Thành phần
hoá học của dịch chiết nấm men ít được chú ý phân tích, chủ yếu chứa: đường,
axit nucleic, axit amino, vitamin, auxin, khoáng. tác dụng của dịch chiết nấm
men rất tốt với rễ nhưng không rõ ràng với mô sẹo.
- Ngoài ra người ta còn sử dụng các chất hữu cơ tự nhiên khác như: Khoai
tây, cà rốt, chuối có tác dụng cung cấp thêm vitamin, amino axit...
1.2.6. Chất độn thạch agar

Là một loại polysacarit thu được từ một số loài tảo ( chủ yếu là tảo hồng),
được sử dụng làm chất đệm cho môi trường rắn lại. Ở 800C, thạch ngậm nước
chuyển thành dạng sol và ở 400C trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của
thạch là 6 – 12g/1l nước.
1.2.7. Độ pH của môi trường.
Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thu
nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy đối với mỗi loại môi
trường dinh dưỡng nhất định và đối với từng trường hợp cụ thể của các loài cây,
phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu.
Đối với nuôi cấy mô của nhiều loài cây, pH thường là 5,5 – 6.
Đặc biệt khi sử dụng chất phụ gia có tính kiềm hoặc tính axit như: axit
amin, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để pH môi trường
ổn định là 5,5 – 6,5.
1.2.8. Chuẩn bị các dung dịch đậm đặc và dung dịch làm việc
Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy, người ta không cân
hoá chất mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng đậm đặc, sau đó
chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các dung dịch đậm đặc được bảo quản dài ngày


12

trong tủ lạnh.Dưới đây là thành phần MS và thành phần White được sử dụng
trong đề tài.
Thành phần môi trường MS gồm
Dung dịch

Hoá chất

Nồng độ ( g/l)

Số ml dung dịch

mẹ

mẹ cần cho 1000ml

A

EDTA

0,8

dung dịch làm việc
28

B

Fe2(SO4)3
NH4NO3

0.38
82,50

20

C

KNO3
H3PO3

95,00

5

KH2PO4

1,24

KI

1,24

Na2MoO4.2H2O

34,00

COCl2.6H2O

0,166

MgSO4.7H2O

0,016

MnSO4.4H2O
MnSO4.4H2O

0,050
0,050

ZnSO4.7H2O

0,005

CuSO4.5H2O

0,005

MgCl2
CaCl2.2H2O
Thiamine HCl

74,00
88,00
0.02

Axit nicotinic

0.10

Pyridoxine HCl

0.10

Glyxine
NAA
Kinetin

0.40
0.10

0.40

D

E
F

G
H

5

5
5

1
0.5

Thành phần môi trường White gồm:
Dung dịch

Hoá chất

Nồng độ ( g/l)

Số ml dung dịch mẹ


13

cần cho 1000ml
A

B
C

D
E

Ca(NO3)2.4H2O

3,0

Na2SO4

2,0

KNO3

0,80

KCl

0,65

NaH2PO4.H20
MgSO4.7H2O
MnSO4.H20

0,19

75,0
0,50

ZnSO4.7H2O

0,30

H3BO3

0,15

KI

0,075

CuSO4.5H2O

0,001

Na2MoO4.2H2O
Fe2(SO4)3
Thiamine HCl

0,025
0,25
0,01

Pyridoxine HCl

0,01

dung dịch làm việc
100

10
10

10
10

1.3. Quy trình chung của nuôi cấy mô tế bào- invitro
Sự thành công hay thất bại của nhân giống vô tính phụ thuộc phần lớn vào
việc thực hiện các bước trong nhân giống invitro. Quy trình này bao gồm các giai
đoạn sau:
1.3.1.Giai đoạn chuẩn bị
Đây là bước đầu tiên của quy trình nhân giống. Tuỳ theo điều kiện, giai
đoạn này kéo dài từ 3-6 tháng. Giai đoạn này gồm các khâu như: chọn lọc cây mẹ
để lấy mẫu (cây mẹ thường là cây ưu việt, khoẻ, có trí trị kinh tế, ..), chọn cơ
quan để lấy mẫu (thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, đầu rễ, ...).
Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống
nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Sau đó chọn chế độ
khử trùng thích hợp làm sao để mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả
năng sinh trưởng và phát triển vẫn tốt. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến


14

hiện nay là dùng các tác nhân hoá học. Các hoá chất thường được dùng để khử
trùng là cồn 70%, HgCl2, NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2, ... Nồng độ chất khử trùng
được chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm, theo nguyên tắc mô non nồng độ thấp,

mô già nồng độ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất khử
trùng với nhau. Cũng có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào môi
trường nhằm tăng hiệu quả khử trùng.
Thời gian khử trùng được xác định bằng thực nghiệm đối với từng loài cây,
loại mô hoặc mô nuôi cấy. Nhìn chung, mô non khử trùng trong thời gian ngắn,
mô già trong thời gian dài hơn.
1.3.2.Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Sau khi khử trùng, ta đưa mẫu vào nuôi cấy invitro trên môi trường dinh
dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy. Môi trường này được xác lập cho
từng loại cây, loại mô nuôi cấy. Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn,
nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh
sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu sẽ xuất hiện
các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc
tính gần như phôi hữu tính. Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu để cho quá trình
nhân nhanh tiếp sau đó.
1.3.3.Giai đoạn nhân nhanh
Một khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi, các
phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn nhân
nhanh. Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi
cấy và thành phần môi trường đã được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu này.
Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1-2 tháng
tùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh là vào khoảng 10-36
tháng.
1.3.4.Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng
thông thường các chồi này phải được cấy sang một môi trường khác để kích thích


15

tạo rễ. Ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân,
lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống.
1.3.5.Giai đoạn vườn ươm.
Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống invitro
khi chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Khi
đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng “sốc” do
thay đổi về điều kiện môi trường cần có giai đoạn thích nghi. Quá trình thích
nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai
đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và
giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và trong điều kiện cách ly bệnh
để các cây con đạt tỷ lệ sống cao.
1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất invitro hoa lan trên thế giới và ở Việt
Nam
1.4.1 Trên thế giới.
Hiện nay Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu hoa lan, có 18 phòng
nuôi cấy invitro hoa lan thương mại hoạt động ở Băng Cốc và các vùng phụ cận. Hàng
năm sản xuất 31,6 triệu cây con trong đó Dendrobium chiếm 80%, Mocara 5% còn lại
là các loại hoa khác (Đồng Văn Khiêm, 1995).
Nhờ khả năng thực hiện công nghệ mới trong nuôi cấy mô và lai tạo, với giá lao
động thấp, khí hậu thuận lợi, giao thông tốt cho phép Thái Lan sản xuất quanh năm và
xuất đi 50 nước trên thế giới. Năm 1993, Thái Lan xuất đi 70,7% cho thị trường Anh,
81,4% cho Hà Lan về lan cắt cành, 64 triệu cành cho Ý, 5 triệu cành cho Nhật ( Ngô
Quang Vũ, 2002) .
Ở Singapo nghề trồng hoa lan xuất khẩu trên quy mô lớn bắt đầu từ năm 1987.
Trên cơ sở phân tích và thấy rằng tiềm năng xuất khẩu loài hoa này trên thế giới nên
Singapo đã mở trang trại trồng hoa phong lan. Năm 1992 xuất khẩu hơn 18 triệu USD
ra nước ngoài. Hiện nay Singapo chiếm 12% thị trường phong lan thế giới, năm 1995
đạt 37 triệu USD (Phan Thúc Huân, 1989) .

16

Hà Lan đã đầu tư 20 triệu USD vào Ấn Độ để lắp đặt các thiết bị máy móc đầu tư
cho sản xuất hoa lan xuất khẩu.
Nhật Bản đã đầu tư 6,6 triệu USD cho Thái Lan để mở rộng cơ sở sản xuất với
công suất 10 triệu cây hoa lan mỗi năm. Hiện nay, Nhật cũng là khách hàng lớn nhất
của Singapo với khả năng tiêu thụ 60% số cây lan của nước này (Phan Thúc Huân,
1989) .
Cùng với các quốc gia trên, ở Đài loan lan Hồ điệp được cả thế giới ngưỡng mộ
và được tiêu thụ khắp toàn cầu. Nguyên nhân chính của sự thành công là do Đài loan đã
thành lập được một hệ thống tiên tiến hàng đầu thế giới trong việc lai tạo giống lan mới.
Đài loan trở thành nơi sản xuất chủ yếu lan Hồ Điệp của thế giới.
Theo nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trong nhân giống lan Hồ
Điệp của Zhu Gen Fa (Trung Quốc) khi sử dụng các đốt cành hoa làm mẫu cấy trên
môi trường MS + 3-5 mg BA/l thì tỷ lệ các mẫu hình thành chồi sinh dưỡng đạt 90%
trở lên. Nuôi cấy các chồi dinh dưỡng đó trên môi trường MS + 10mg/l khoai tây +
NAA 5mg/l + 10% nước dừa + đường mía 20g/l để tạo thể tiền chồi ( Nguyễn Quang
Thạch, 2005).
1.4.2. Ở Việt Nam
Nhìn chung sản xuất hoa lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh
phía Nam, đặc biệt là ở Đà Lạt và Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2004 Lâm
Đồng đã thành lập Hiệp hội hoa lan với tên gọi giao dịch là Dalat Orchid Asscociation
với mục đích là tập hợp những người yêu mến và có kinh nghiệm trồng lan tiến tới phát
triển nhân rộng, sản xuất theo hướng hàng hóa. Hiện nay mỗi năm Đà Lạt mới chỉ sản
xuất khoảng 200.000 đơn vị lan cắt cành. (Cao Liên - Việt Nam Hương sắc T8/2004) .
Trong những tháng đầu năm 2007, mặc dù kim ngạch xuất khẩu lan cắt cành đã
giảm đáng kể so với những tháng trước nhưng vẫn ở mức khá cao. Theo số liệu thống
kê của Tổng cục Hải quan kim ngạch nhập khẩu phong lan cắt cành qua đường chính
ngạch của nước ta trong tháng 02/2007 là 26,515 nghàn USD, giảm 20,17% so với
tháng 01/2007 nhưng vẫn tăng 51,76% so với tháng 12/2006. Thị trường xuất khẩu hoa