Nghiên cứu một số nhân tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp ectinmethylesterase từ nấm mốc aspergillus niger

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ VĂN RIN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ NHÂN TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN
KHẢ NĂNG TỔNG HỢP PECTINMETHYLESTERASE
TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2009


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ NHÂN TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN
KHẢ NĂNG TỔNG HỢP PECTINMETHYLESTERASE
TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGs.Ts. NGUYỄN VĂN MƢỜI

LÊ VĂN RIN
MSSV: LT07107
Lớp: CNTPLT K33

Cần Thơ, 2009


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ
luận văn nào trƣớc đây.

Cần thơ, ngày 10 tháng 06 năm 2009
Tác giả


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

Chân thành cảm ơn quý thầy cô Trƣờng Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô
Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho tôi những
kiến thức cũng nhƣ những kinh nghiệm bổ ích suốt thời gian theo học tại trƣờng.
Tha thiết cảm ơn PGs.Ts NGUYỄN VĂN MƢỜI cùng với Th.s TRẦN THANH
TRÚC đã tận tình hƣớng dẫn, tìm cách giải quyết các vấn đề và tạo điều kiện thuận
lợi nhất cho tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề
tài này. Đặc biệt là chị Lê Thị Ngọc Hiếu, bạn Lê Vũ Lan Phƣơng, Phạm Thị Ngọc

Diễm và bạn Nguyễn Thanh Trúc.
Kính chúc quý thầy cô và các bạn dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc.
Xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 10 tháng 06 năm 2009
Tác giả

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM LƢỢC
Với mục tiêu tìm ra điều kiện thích hợp để sản xuất enzyme pectinmethylesterase từ
nguồn vi sinh vật trên môi trường cơ bản (trấu, cám, bột mì), đề tài: “Nghiên cứu một số
nhân tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp pectinmethylesterase từ nấm mốc
Aspergillus niger” được tiến hành với 3 thí nghiệm :
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trường nuôi
cấy nấm mốc đến sự tổng hợp pectinmethylesterase.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy nấm mốc đến khả năng sinh tổng
hợp pectinmethylesterase.
Thí nghiệm 3: Tác động của thành phần đạm bổ sung đến khả năng sinh
pectinmethylesterase từ Aspergillus niger.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính enzyme PME thu nhận cao nhất ( 78,196 U/mL)
khi A.niger được nuôi cấy trên môi trường 70% cám, 25% trấu, 5% bột mì, độ ẩm môi

trường 55%, pH môi trường 5,0 trong thời gian ủ 90 giờ ở nhiệt độ phòng. Việc bổ sung
đạm amonium sulfate (NH4 )2 SO4 với tỉ lệ 0,1% cho hiệu quả sinh PME từ A.niger cao
hơn hẳn trường hợp sử dụng diammonium hydro phosphate (NH4 )2 HPO4 ở cùng tỉ lệ.
Hoạt tính PME ước tính là 177,895 U/mL.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................ i
.....................................................................................................................ii
TÓM LƢỢC ......................................................................................................................iii
.......................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................vii
......................................................................................................viii
......................................................................................................... ix
Chƣơng 1

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................. 1

1.1

TỔNG QUAN ..................................................................................................... 1

1.2

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .............................................................................. 2

Chƣơng 2
2.1

.......................................................................... 3

GIỚI THIỆU CHUNG ...................................................................................... 3

2.1.1

Nấm mốc Aspergillus niger.......................................................................... 3

2.1.2

Enzyme pectin methylesterase...................................................................... 4

2.1.3

Nguồn tổng hợp pectinmethylesterase ......................................................... 6

2.1.4

Giới thiệu về pectin ...................................................................................... 6

2.2
CẤU TRÚC, TÍNH CHẤT VÀ CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG THỦY PHÂN CỦA

PECTIN METHYLETERASE ..................................................................................... 8
2.2.1

Cấu trúc........................................................................................................ 8

2.2.2

Tính chất ...................................................................................................... 9

2.2.3

Cơ chế hoạt động thủy phân ........................................................................ 9

2.2.4

Pectinase thương mại................................................................................. 10

2.3
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA
PECTINMETHYLESTERASE.................................................................................. 10
2.3.1

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme ................................................................ 10

2.3.2

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ................................................................ 11

2.3.3

Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................. 11

2.3.4

Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme ................................................. 12

2.3.5

Ảnh hưởng của chất hoạt hoá .................................................................... 12

2.3.6

Ảnh hưởng của các chất kìm hãm .............................................................. 13

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

2.4

Trường Đại học Cần Thơ

SẢN XUẤT PECTINMETHYLESTERASE TỪ NẤM MỐC .................... 15

2.4.1

Môi trường nuôi cấy................................................................................... 15

2.4.2

Giống vi sinh vật ........................................................................................ 16

2.4.3

Phương pháp nuôi cấy ............................................................................... 17

2.4.4

Thu nhận enzyme........................................................................................ 18

2.4.5

Kỹ thuật sản xuất pectinmethylesterase ..................................................... 18

2.4.6

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp pectin methylesterase ....... 21

2.5

MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PECTINMETHYLESTERASE .................... 22

2.5.1

Trong sản xuất nước quả và rượu vang..................................................... 22

2.5.2

Cải thiện cấu trúc rau quả ......................................................................... 24

2.5.3

Trích ly dược liệu ....................................................................................... 24

2.5.4

Trong chăn nuôi ......................................................................................... 24

2.6

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN .................................................. 25

Chƣơng 3
3.1

PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ....................... 26

PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM..................................................................... 26

3.1.1

Địa điểm, thời gian .................................................................................... 26

3.1.2

Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 26

3.1.3

Thiết bị, hoá chất ....................................................................................... 26

3.2

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 27

3.2.1

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy ................................................................... 27

3.2.2

.......................................... 27

3.2.3

Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 27

3.3

BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ................................................................................... 27

3.3.1
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi
trường nuôi cấy nấm mốc đến sự tổng hợp pectin methylesterase ........................... 27
3.3.2

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy nấm mốc đến khả năng
sinh tổng hợp pectinmethylesterase .......................................................................... 29
3.3.3
Thí nghiệm 3: Tác động của thành phần đạm bổ sung đến khả năng sinh
pectinmethylesterase từ Aspergillus niger ................................................................ 30
Chƣơng 4

KẾT QUẢ THẢO LUẬN ........................................................................ 32

4.1
ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ ẨM MÔI TRƢỜNG VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY
A.NIGER ĐẾN SỰ TẠO THÀNH PECTINMETHYLESTERASE ....................... 32

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

v


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

4.2
ẢNH HƢỞNG pH MÔI TRƢỜNG ĐẾN SỰ TẠO THÀNH
PECTINMETHYLESTERASE.................................................................................. 34
4.3
ẢNH HƢỞNG NGUỒN ĐẠM BỔ SUNG ĐẾN SỰ TẠO THÀNH PECTIN
METHYLESTERASE TỪ A.NIGER ........................................................................ 36

Chƣơng 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 38

5.1

KẾT LUẬN ....................................................................................................... 38

5.2

ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 38

PHỤ LỤC........................................................................................................................... ix

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

β-GALase: β-galactosidase
DE: degree of esterification
DP: degree of polymerization

GalA: acid polygalacturonic
HG: homogalacturonan
PG: polygalacturonase
PGL: exopolygalacturonate lyase
PI: pink
PL: pectate lyase
PE: pectinesterase
PME: pectin methyl esterase
PMEI: pectin methyl esterase inhibitor
PVP: polyvinylpyrrolidone
RG: rhamnose
RGI: rhamnogalacturonan I
RGII: rhamnogalacturonan II

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 1: Hàm lƣợng pectin của một số loại quả và dịch quả ......................................................8
Bảng 2: Thành phần dinh dƣỡng của cám ...............................................................................16
...............................27
Bảng 4: Hoạt tính PME (U/mL) thu đƣợc theo độ ẩm môi trƣờng và thời gian nuôi cấy .......32
Bảng 5: Hoạt tính PME trung bình theo pH môi trƣờng nuôi cấy ...........................................35

Bảng 6: So sánh ảnh hƣởng của thành phần đạm bổ sung đến sự thay đổi hoạt tính PME .....36

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

viii


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 1: Aspergillus niger .............................................................................................................3
Hình 2: Sự phân cắt pectin của PME bắt đầu từ nhóm carboxyl ..................................................5
Hình 3: Cấu tạo pectin ..................................................................................................................7
Hình 4: Phản ứng thuỷ phân pectin dƣới sự xúc tác của PME .....................................................9
Hình 5: Sự phát triển của nấm sợi trong nuôi cấy bề mặt ...........................................................18
Hình 6: Sơ đồ quá trình sản xuất enzyme bằng phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt ..........................19
Hình 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát độ ẩm và thời gian nuôi cấy nấm mốc .......................28
Hình 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát pH môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc .............................30
Hình 9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khoáng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc ..31
Hình 10: Ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng lên men và thời gian ủ đến hiệu quả sinh PME từ
A.niger.........................................................................................................................................33
Hình 11: Đồ thị biểu thị hoạt tính PME trung bình theo pH môi trƣờng nuôi cấy .....................35
Hình 12: Sự thay đổi hoạt tính PME do tác động của thành phần đạm bổ sung trong
môi trƣờng nuôi cấy ....................................................................................................................37

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

ix


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

CHƢƠNG 1
1.1

Trường Đại học Cần Thơ

ĐẶT VẤN ĐỀ

TỔNG QUAN

Enzyme có bản chất là protein, là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho
quá trình sinh trƣởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan
trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích,
trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trƣờng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Ngày
nay, trình độ khoa học kỹ thuật tiên tiến cùng với sự hội nhập kinh tế quốc tế, việc
ứng dụng công nghệ enzyme trong thực phẩm đang thực sự phát triển mạnh mẽ.
Tùy mục đích sử dụng mà enzyme sản xuất ra nhiều dạng chế phẩm: enzyme thô,
enzyme bán tinh khiết, enzyme tinh khiết. So với enzyme từ động vật và thực vật,
sản xuất enzyme từ vi sinh vật có rất nhiều ƣu điểm nhƣ:
- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh
- Enzyme thu nhận có hoạt tính rất cao
- Có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau
- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẻ tiền và dễ tìm.
Các nghiên cứu hiện nay nhằm cải thiện cấu trúc của rau quả phần lớn hƣớng vào

thành phần pectin của vách tế bào. Enzyme pectinmethylesterase (PME) đang đƣợc
ứng dụng nhƣ là một công cụ then chốt để cải thiện cấu trúc sản phẩm trong quá
trình xử lý, chế biến các thực phẩm từ thực vật. Khi ngâm PME ngoại bào cùng với
ion Calci đƣợc đề nghị nhƣ là một biện pháp tiền xử lý để cải thiện cấu trúc của trái
cây chế biến. Ngoài ra, trong công nghệ sản xuất nƣớc quả nhất là sản xuất nƣớc
quả trong, PME phân cắt nhóm methoxyl của pectin, có tác dụng làm trong dịch
chiết ép, tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật, đảm bảo
quá trình lọc diễn ra tốt hơn (Van Puren, 1979, Baker and Wicker, 1996).
Hơn thế nữa, PME đƣợc hứa hẹn là thay thế cho các hóa chất hiện đang đƣợc sử
dụng để demethoxyl hóa pectin, thu đƣợc từ phế liệu của quá trình chế biến trái cây
và đƣợc ứng dụng làm tác nhân t ạo gel trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Với việc ứng dụng ngày càng rộng rãi của PME thì quá trình sản xuất enzyme này
sẽ góp phần cải thiện đƣợc qui trình sản xuất, nâng cao chất lƣợng sản phẩm, góp
phần hạ giá thành sản phẩm, đồng thời tạo điều kiện để mở rộng sản xuất enzyme
trong thực tế, đƣa công nghệ enzyme ngày càng phát triển. Chính vai trò quan trọng
của PME trong công nghiệp chế biến, đề tài “Nghiên cứu nhân tố tác động quá
trình sinh tổng hợp enzyme pectinmethylesterase từ nấm mốc Aspergillus niger”
đƣợc thực hiện.
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

1


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

1.2

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu chủ yếu là nhằm tìm ra các yếu tố tối ƣu giúp thu đƣợc PME từ
Aspergillus niger có hoạt tính cao nhất. Cụ thể nhƣ sau:
- Xác định độ ẩm và thời gian nuôi cấy thích hợp nấm mốc sinh PME có hoạt tính
cao nhất.
- Tìm pH tối ƣu cho môi trƣờng nuôi cấy Aspergillus niger thích hợp cho sự sinh
tổng hợp PME đạt hiệu quả cao.
- Bổ sung thành phần đạm để thu đƣợc PME tối đa.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

2


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

CHƢƠNG 2
2.1
2.1.1

Trường Đại học Cần Thơ

U

GIỚI THIỆU CHUNG

Nấm mốc Aspergillus niger

Aspergillus thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi Imperfecti),
cuống đính bào tử có đầu phình ra. Nhóm nấm bất toàn là những nấm sinh sản vô
tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành
chuổi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử. Nấm Aspergillus còn gọi là mốc
tƣơng. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuỗi
bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hƣớng. Bào tử bụi có thể màu vàng
(Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger).
Nấm mốc Aspergillus niger (A. niger) là thành viên của Deuteromycetes (Fungi
Imperfecti) thuộc nhóm sinh sản vô tính. A. niger đƣợc biết đến nhƣ loại nấm mốc
có màu đen (Abarca et al., 2004).

Hình 1: Aspergillus niger

Loại nấm mốc này thƣờng thấy trong quá trình thu hoạch và bảo quản các loại thực
phẩm nhƣ đậu phộng, bắp, táo, lê, đào, nho, dâu tây, cà chua và dƣa (Pitt and
Hocking, 1985; Pitt and Hocking, 1997).
A. niger thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp để sản xuất enzyme (nhƣ
– galactosidases, lipases, protease, hemicellulase, cellulases và pectinases) và
acid hữu cơ.
Trong khi pectinases thƣờng đƣợc sử dụng trong quá trình chế biến thực phẩm có
nguồn gốc thực vật, các acid hữu cơ, nhƣ acid citric đƣợc sử dụng rộng rãi trong

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

3

Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

công nghiệp chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc nhƣ một phụ gia tạo vị, điều
chỉnh acid, chất ổn định hay bảo quản (Magnuson and Lasure, 2004).
Ngay từ năm 1917, A. niger đã đƣợc sử dụng để sản xuất acid citric (Raper and
Fennel, 1965). Ngày nay, acid citric đƣợc sản xuất từ A. niger với sản lƣợng
khoảng 700.000 – 1.000.000 tấn/năm (Ikramul et al., 2004; Magnuson and Lasure,
2004; Prado et al, 2005; Vandenberghe et al., 2000). Khoảng 70% acid citric sản
xuất đƣợc sử dụng trong các loại thực phẩm và sản phẩm bia, phần còn lại thƣờng
đƣợc ứng dụng trong ngành dƣợc (Magnuson and Lasure, 2004; Prado et al., 2005;
Vandenberghe et al., 2000).
Pectinases từ nguồn nấm mốc, đặc biệt là A. niger, thƣờng đƣợc sử dụng phổ biến
trong công nghệ chế biến nƣớc quả, kế đến là cellulases và hemicellilases với
doanh số thu đƣợc từ 3 dạng enzyme này xấp xỉ 21000000 dollar Mỹ thu đƣợc
hàng năm đối với các enzyme công nghiệp khác (Bhat, 2000; Kashyap et al., 2001).
Các enzyme này thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất các loại nƣớc quả trong nhƣ
nƣớc táo, lê, nho, … và một lƣợng nhỏ sử dụng trong chế biến các dạng nƣớc quả
có độ đục ổn định nhƣ nƣớc chanh, nƣớc mận.
A. niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân
tử pectin. Chúng bao gồm pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) và pectin
acetylesterase
(EC
3.1.1.6),
endopolygalacturonase
(EC
3.2.1.15),
exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67), … Hoạt động của pectin methylesterase cần

thiết để tạo ra pectin có độ methyl ester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho
polygalacturonase và pectate lyase. Trong khi đó pectin lyase có thể sử dụng cơ
chất có độ methyl ester bất kỳ.
Hệ enzyme pectinolytic từ A.niger có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
và thức uống. Tuy nhiên, các enzyme này thƣờng ở dạng hỗn hợp, gây khó khăn
cho việc ứng dụng chúng để tác động các loại pectin công nghiệp cũng nhƣ trong
các loại gel thực phẩm.
2.1.2

Enzyme pectin methylesterase

Pectin methylesterase (PME) thuộc nhóm enzyme pectinase, nhóm enzyme xúc tác
sự thủy phân pectin. PME còn có tên khác là pectinesterase (PE) và đƣợc đánh số
trong hệ thống phân loại là 3.1.1.11.
PME xúc tác phản ứng thủy phân liên kết methyl ester ở C 6 của 1 gốc GalA trong
HG của pectin. Nó khác với các enzyme acetylesterase là các enzyme giải phóng
gốc acetyl ester ở C3 hoặc C2 của GalA trong HG (pectin acetylesterase) hoặc trong
RG (rhamnogalacturonan acetylesterase). Cho đến nay chƣa có enzyme
methylesterase nào đƣợc tìm thấy là có tác động đến nhóm methyl ester của RG
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

4


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

(Benen et al., 2003a). Các loại PME đƣợc tìm thấy trong rất nhiều loại thực vật và
cũng đƣợc sản xuất từ các loại vi sinh vật gây bệnh cho cây.
PME nội bào của thực vật đƣợc tin là liên quan đến sự chuyển hóa của pectin trong
suốt quá trình phát triển của thực vật (Bordenave, 1996). Phối hợp với các enzyme
pectinase khác, PME có trách nhiệm trong việc điều khiển sự thoái hóa của pectin
và sự mềm đi của mô thực vật trong quá trình chín. PME có ảnh hƣởng đến các quá
trình sinh lý nhƣ tăng kích thƣớc và năng suất củ (Pilling et al., 2000), sự phát triển
của rễ (Wen et al., 1999) và sự mềm của trái (Lievens et al., 2002). PME và các
enzyme làm biến đổi vách tế bào khác đƣợc sản xuất bởi các tác nhân gây hại ở các
cây bị nhiễm bệnh (Bordenave, 1996). PME từ những nguồn khác nhau có những
đặc trƣng không giống nhau. Enzyme này thƣờng tấn công vào các nhóm ester
methyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester hóa, phân cắt các
nhóm methoxyl (_OCH3) đứng cạnh các nhóm COOH tự do, tạo thành acid
pectinic hoặc acid pectic và methanol. Hiệu suất thủy phân pectin của enzyme này
rất cao, có thể đạt 98%. Emzyme này còn có tên khác là pectinesterase (PE).

Hình 2: Sự phân cắt pectin của PME bắt đầu từ nhóm carboxyl
(Nguồn: Ly Nguyen Binh, 2004)

Sự thủy phân pectin trong tự nhiên thƣờng xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme
này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và
rau quả. Enzyme PME cũng đƣợc ứng dụng nhiề u trong quá trình chế biến thực
phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nƣớc quả. Việc kiểm soát hoạt động của
enzyme cũng có thể điều chỉnh đƣợc độ nhớt của sản phẩm (Nguyễn Đức Lƣợng,
2004).

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

5


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

2.1.3

Trường Đại học Cần Thơ

Nguồn tổng hợp pectinmethylesterase

PME có thể tổng hợp từ nguồn thực vật và vi sinh vật.
+ Thực vật
PME có nhiều trong hầu hết các loại trái cây. Đặc biệt có nhiề u trong cà chua,
chuối, cam, táo,…PME ở thực vật thƣờng tồn tại dạng đồng phân, tỷ lệ giữa các
dạng đồng phân thay đổi theo sự tăng trƣởng của quả. Ví dụ nhƣ ở cà chua tồn tại 2
dạng đồng phân là PME1 và PME2. Khi quả trong giai đoạn trái bắt đầu chín,
PME1 và PME2 đều tăng nhƣng ở giữa giai đoạn chín thì PME1 giảm xuống,
PME2 tiếp tục tăng đến cuối quá trình chín.
+ Vi sinh vật
Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus terrus, Aspergillus
saitoi, Penicillium glaucum, Penicillium chrysogenum, Penicillium expanam,
Penicillium Cilrimim, Fusarium monniliforme,…
- Nấm men: Saccharomyces fragilis
- Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella
aerogenes, Erwinia,…
Nấm mốc là nguồn cung cấp enzyme, đặc biệt là enzyme pectinase. PME từ nấm
mốc là các loại enzyme ngoại bào. Chúng hoạt động trong khoảng nhiệt độ tối ƣu
30 45 oC và bị vô hoạt ở nhiệt độ lớn hơn 55 o C. pH tối ƣu của nấm mốc trong

khoảng 3 5,5. PME từ các loài Aspergillus là điển hình cho các PME có điểm
đẳng điện và pH tối ƣu trong vùng acid. Hoạt động của PME từ A.niger đạt tối đa ở
pH 4,5 và nhiệt độ 40 o C. Trong khi pH tối ƣu của PME từ A.species là 3,7
PME từ A.sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.1.4

4,2 và

Giới thiệu về pectin

Pectin là một trong những chất quan trọng của vách tế bao thực vật. Loại
polysaccharide này đóng góp vào nhiều tính chất chất lƣợng của thực phẩm có
nguồn gốc thực vật, đặc biệt là đối với cấu trúc. Pectin trích ly đƣợc ứng dụng rộng
rãi trong công nghiệp thực phẩm cũng nhƣ các ngành công nghiệp khác nhƣ là một
tác nhân tạo gel. PME xúc tác cho phản ứng giải phóng methanol khỏi phân tử
pectin, làm giảm mức độ ester hóa. Cả PME nội bào và ngoại bào đều đƣợc lợi
dụng trong các tiến trình chế biến rau quả để cải thiện cấu trúc và một số tính chất
khác của sản phẩm. Bên cạnh đó, PME còn đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản
xuất pectin.
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

6


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 3: Cấu tạo pectin

Pectin là polimer của α – D – galacturonic acid nối với nhau nhờ liên kết α – 1,4.
Trong đó các nhóm acid của acid galactose bị ester hóa một phần bằng rƣợu
metylic. Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lƣợng phân tử từ 80000 –
200000. Pectin không hòa tan trong rƣợu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin hoà
tan trong nƣớc, ammoniac, dung dịch kiềm, carbonate natri và trong glycerine
nóng.
Pectin là tên chung đƣợc gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau,
trong đó acid pectinic là thành phần chủ yếu. Các pectin tự nhiên định vị trong
thành tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành
các protopectin không tan. Một trong những biện pháp thuận lợi giúp pectin tan
trong nƣớc là đun nóng pectin trong môi trƣờng acid. Vì thế, các pectin tan thu
nhận đƣợc là kết quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không
đồng dạng với nhau.
Pectin phân bố rộng rãi trong nhiều loại thực vật và tồn tại ở cả 3 dạng: pectin hoà
tan, acid pectinic và protopectin. Pectin có trong vách tế bào thực vật, là một phức
hệ sợi nhỏ trong tự nhiên. Độ bền của pectin cao nhất tại pH 3 ÷ 4.
- Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên
có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của acid polygalacturonic đƣợc ester hoá bằng
methanol. Pectin đƣợc ester hoá cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong
dung dịch đƣờng có nồng độ 65%.
- Acid pectinic là acid polygalacturonic có một phần nhỏ các nhóm carboxyl đƣợc
ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của acid pectinic. Acid pectic là acid
polygalacturonic đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxyl, tức là trong đó
có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị acid galacturonic. Pectate là
muối của acid pectic.
- Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nƣớc và có cấu tạo hoá
học phức tạp. Trong thành phần pectin có các phân tử pectin, các phân tử

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

7


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

cellulose và các ion Ca2+ , Mg2+ , các gốc acid phosphoric, acid acetic và đƣờng.
Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan.
Bảng 1: Hàm lƣợng pectin của một số loại quả và dịch quả

Nguồn pectin

Pectin (%)

Nho
Dịch nho

0,2 ÷ 1
0,01 ÷ 0,09

Táo

0,5 ÷ 1,6

Dịch táo

Khối nghiền nho đen
Vỏ chanh
Thịt chanh

20,0
1,6
32,0
25,0

Vỏ cam

20,0

- Vỏ lụa
- Dịch quả

29,0
16,0

Củ cải đƣờng

30,0

( Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

Các chất protein có trong bào tƣơng, màng tế bào và gian bào. Pectin chứa
polygalacturonic acid, araban và galactan. Trong đó lƣợng acid polygalacturonic
chiếm tới 40 ÷ 60%. Khi thủy phân, pectin tách thành hai phần: phần trung tính
(phức chất galactanoaraban) và phần acid (acid pectic).
Trong bào tƣơng, pectin nằm ở dạng hoà tan. Trong màng tế bào và gian bào,

chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin. Protopectin ở màng gian bào
có chứa lƣợng kim loại khá cao và một lƣợng nhóm methoxyl đủ để làm
protopectin bền vững. Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lƣợng kim loại
không nhiều, có độ methoxyl hoá cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trƣơng
nở tốt (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Pectin thƣơng mại có hàm lƣợng acid galacturonic thƣờng hơn 75% và độ ester hóa
từ 30 ÷ 80% (Van Puren, 1979).
2.2

CẤU TRÚC, TÍNH CHẤT VÀ CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG THỦY PHÂN
CỦA PECTIN METHYLETERASE

2.2.1

Cấu trúc

PME có 2 dạng cấu trúc bậc I và bậc II. Ở cấu trúc bậc I, PME là một chuỗi acid
amin cao. Trung tâm hoạt động cố định gồm các acid amin: 2 acid aspartic,
arginine, 2 glutamine và các acid amin có nhân thơm liên kết với khớp phản ứng.
Cấu trúc bậc II của PME là dạng cấu trúc β – helix. Đây là cấu trúc dạng vòng xoắn
có gấp nếp β-helix theo hƣớng phải, bao gồm 3 chuỗi β – sheet song song và có
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

8


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

những đoạn dạng vòng đƣợc kéo ra từ lõi của vòng xoắn, nó tạo ra một vùng sâu
giống nhƣ khe nứt. Khe nứt thƣờng tạo nên bởi những gốc có vòng thơm và 2 gốc
aspartate, tƣơng ứng với trung tâm hoạt động của PME (Jenkins et al., 2001;
Johansson et al., 2002; D’Avino et al., 2003).
2.2.2

Tính chất

Enzyme PME thủy phân cắt liên kết ester giữa methanol và nhóm carboxyl của
acid galacturonic. Pectinmethylesterase sẽ thủy phân trƣớc nhất là nhóm
methylester nằm giữa 2 nhóm carboxyl tự do, s au đó sẽ thủy phân lần lƣợt các liên
kết ester dọc theo phân tử pectin. Kết quả là tạo thành acid pectinic, acid pectic và
methanol.

Hình 4: Phản ứng thuỷ phân pectin dƣới sự xúc tác của PME
(Nguồn: Sila. et al, 2003)

PME có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methyl ester của acid polygalacturonic.
Các ester khác chỉ bị tấn công rất chậm, còn các nhóm methylester của acid
polymanuronic thì không hề bị tấn công. PME nguồn gốc thực vật khử ester của
pectin từ đầu khử hoặc không khử, hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc
theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối acid galacturonic không bị
ester hoá rất mẫn cảm với calcium. Pectinesterase thu đƣợc từ các nguồn khác nhau
có giá trị pH khác nhau. Nếu enzyme thu đƣợc từ nguồn vi sinh vật thì pH tối ƣu là
4,5 ÷ 5,5, còn nếu là nguồn thực vật thì có pH tối ƣu là 5,0 ÷ 8,5 (Denes et al.,
2000; Ly Nguyen Binh, 2004). PME thƣờng đƣợc hoạt hóa bởi các ion Ca2+ và
Mg2+ (Bordenave, 1996).
2.2.3

Cơ chế hoạt động thủy phân

Enzyme PME thủy phân các liên kết ester của các đơn vị ester galacturonic tạo
thành polymer mang điện tích âm và methanol. Khi enzyme hoạt động không phải
toàn bộ cấu trúc enzyme tham gia hoạt động xúc tác mà chỉ có trung tâm hoạt động

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

9


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

của enzyme tham gia phản ứng. Trung tâm hoạt động của enzyme do cấu trúc của
enzyme tạo ra.
Dựa trên cấu trúc của PME carrot, Johansson et al. (2002) đề nghị cơ chế hoạt động
nhƣ sau: trung tâm hoạt động của PME cà rốt bao gồm Asp157, Arg225, Gln113,
Gln135 và Asp136. Trong đó, Asp157 có liên kết hydro gắn với cả oxy và Arg225.
Arg225 đƣợc xem là một phần tử ái điện tử tấn công chủ yếu vào nhóm carbon t ừ
carboxymethyl và carbonyl của pectin. Asp136 liên kết với Phe160, có tính acid
trong giai đoạn đầu phản ứng và methanol đƣợc tách ra. Tiếp theo, Asp 136 có khả
năng phản ứng nhƣ một base tách hydro của một phân tử nƣớc để cắt liên kết hóa
trị giữa cơ chất và Asp157 và phục hồi lại trung tâm hoạt động cho enzyme
(Johansson et al., 2002).
Pectinase thƣơng mại

2.2.4

Enzyme thƣơng mại là các chế phẩm enzyme của nấm mốc, đƣợc điều chế chủ yếu
từ các loài Aspergillus. Chúng thƣờng là hỗn hợp của các PE, PG và PL,
hemicellulase và endo – β – glucanase. Các enzyme pectinase đóng vai trò quan
trọng trong quá trình chế biến nƣớc ép trái cây.
Một số chế phẩm đƣợc sử dụng trong chế biến ra và quả: Pectinex Ultra SP – L,
Pectinex 3XL và Pectinex AR, Visscozyme120L. Sử dụng chế phẩm enzyme có thể
xem là một trong những phƣơng hƣớng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất
nƣớc quả và nƣớc uống không cồn. Khi ấy cần phải lựa chọn các chế phẩm enzyme
có chứa một lƣợng nhất định các phức hợp enzyme. Ngoài ra, chế phẩm enzyme sử
dụng cũng cần phải thỏa mãn các yêu cầu công nghệ sản xuất từng loại sản phẩm
cụ thể không chỉ về dạng phản ứng xúc tác mà cả điều kiện tác dụng tức là pH,
nhiệt độ, độ ổn định và một số yếu tố khác (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004; Schmitz,
2002).
2.3

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA
PECTINMETHYLESTERASE
Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme

2.3.1

Khi có đầy đủ cơ chất thì vận tốc của phản ứng enzym tỷ lệ thuận với nồng độ
enzyme. sự liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ enzyme có thể đƣợc biểu diễn
bằng biểu thức sau:
V= K[E]
Trong đó:

V : Tốc độ phản ứng
[E] : Nồng độ enzyme

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

10


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lƣợng cơ chất bị biến đổi càng nhiều bấy
nhiêu. Tuy nhiên, một vài trƣờng hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản
ứng chậm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.3.2

Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất

Phản ứng khi có enzyme xảy ra ba giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tƣơng tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai
đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với
nồng độ cơ chất.
E+ S

ES

+ Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ đƣợc tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn

toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất.
+ Giai đoạn 3: enzyme sẽ đƣợc giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tƣợng này
đƣợc xem xét trên cơ sơ phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất.
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)
2.3.3

Ảnh hƣởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Cũng nhƣ các phản ứng hoá
học thông thƣờng, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ. Tuy nhiên, do
enzyme có bản chất là protein nên nó kém bền với nhiệt độ nên tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản
ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá nhiệt độ đó, tốc độ
phản ứng enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến mức triệt tiêu. Đa số enzyme bị mất hoạt
tính ở nhiệt độ trên 70 o C.
Ngƣời ta thƣờng sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tốc
độ phản ứng. Nhiệt độ tƣơng ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất đƣợc gọi là
nhiệt độ tối thích của enzyme. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40
÷ 50 oC. Nhiệt độ tối ƣu của những enzyme khác nhau thì hoàn toàn khác nhau tuỳ
thuộc vào nguồn gốc của chúng. Một số enzyme có nhiệt độ tối ƣu ở 60 oC, một số
khác lại có nhiệt độ tối ƣu ở 70 oC. Enzyme pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ
tối ƣu là 30 ÷ 45 oC và bị vô hoạt ở 55 ÷ 62 oC (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Nếu
đƣa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó
enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngƣợc lại, ở nhiệt độ 0 oC
enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhƣng khi đƣa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính
enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ƣu. Nhiệt độ tối ƣu của enzyme phụ thuộc rất
nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

11


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

Đối với phần lớn enzyme PME thì khoảng nhiệt độ tối thích là 35 ÷ 60 oC, hoạt
động mạnh ở 45 ÷ 50 o C. Khi nhiệt độ vƣợt quá 70 o C thì enzyme này sẽ bất hoạt
(Patil and Dayanand, 2006).
Khi nhiệt độ cao thƣờng gây cho enzyme mất hoạt tính. Phản ứng vô hoạt của
enzyme dƣới tác dụng của nhiệt độ thƣờng biểu diễn theo phƣơng trình b ậc một.

Trong đó:
K: hằng số tốc độ phản ứng
: nồng độ enzyme hoạt động ở thời gian t
: nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động
Ngƣời ta thƣờng sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và
tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm.
2.3.4

Ảnh hƣởng của pH đến phản ứng enzyme

Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trƣờng, mỗi enzyme chỉ hoạt
động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH môi trƣờng thƣờng
ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt là ảnh hƣởng đến độ
bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hƣởng rất mạnh đến phản ứng của
enzyme.

Các enzyme từ các nguồn gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau. Nhiều
enzyme hoat động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên, cũng có nhiều enzyme hoạt
động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid.
Enzyme pectinesterase của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ƣu nằm trong
khoảng acid, hoạt động của PE đạt tối đa ở pH 4,5 và nhiệt độ 40 oC. Khi pH > 7,
pectin tự khử nhóm ester và tăng cƣờng độ hoạt động của PME. Đối với pectinase
có nguồn gốc từ nấm mốc, pH hoạt động tối thích nằm trong khoảng 3 ÷ 5 (Nguyễn
Đức Lƣợng, 2004).
Ngƣời ta thƣờng sử dụng ảnh hƣởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản,
chế biến lƣơng thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật,…
2.3.5

Ảnh hƣởng của chất hoạt hoá

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme gọi là các chất hoạt hoá enzyme.
Những chất hoạt hóa có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

12


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn. Các chất hoạt
hóa thƣờng có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể là:

- Các chất hữu cơ phức tạp làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyển gốc hóa học
- Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm hoạt động của trung tâm hoạt động
enzyme
- Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại
bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại gần nhau để hình
thành trung tâm hoạt động
- Ngoài ra, một số cation kim loại có bán kính từ 0,34 ÷ 1,65 A° ( Na+, K +, Ca2+,
Mg2+) và các anion Cl -, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình
hoạt hóa, các ion kim loại có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu
nối giữa enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần
cho sự xúc tác của enzyme.
Đối với PME, ion kim loại phản ứng với nhóm mang điện tích âm (nhóm carboxyl)
để enzyme tấn công liên kết ester. Ở nồng độ cao, ion kim loại ức chế hoạt động
của enzyme. Ion Na+ , Ca2+ , các loại muối NaCl, KCl, CaCl 2 hoạt hóa enzyme này,
các ion hóa trị 3 và 4 thì kìm hãm hoạt tính của chúng (Jans.Tkacz, 2004). Với
NaCl, nồng độ tối ƣu cho hoạt động PME là 0,2M. Và trong những ion hóa trị 2,
Calci là một trong những ion quan trọng nhất. Ion Calcium làm tăng khả năng hoạt
động của PME khi ở nồng độ thấp 5 ÷ 25nM, còn khi lên đến nồng độ cao sẽ làm
tốc độ phản ứng giảm có thể do hình thành gel pectate. Hoạt động PME đạt tối đa
khi CaCl2 ở nồng độ 20nM.
2.3.6

Ảnh hƣởng của các chất kìm hãm

Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng
của enzyme. Các chất kìm hãm có thể là các ion kim loại, các anion, các hợp chất
hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein. Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận
nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trƣờng hợp các chất kìm hãm thuận
nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt đƣợc trạng thái
cân bằng:

K1
E+ I

EI
K -1

Trong đó :

E: enzyme
I: chất kìm hãm

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

13


Luận văn tốt nghiệp Đại học lớp LT K33

Trường Đại học Cần Thơ

K1, K -1: hằng số tốc độ phản ứng thuận nghịch
Tùy thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất kìm hãm, ngƣời ta chia ra
những chất kìm hãm sau:
2.3.6.1

Các chất kìm hãm cạnh tranh

Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc của

cơ chất. Chúng thƣờng là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng
kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ
chất trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không còn cơ hội tiếp cận với trung
tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và cơ chất làm giảm số lƣợng
của các enzyme kết hợp với cơ chất. Do đó, cơ chất mất một phần khả năng tƣơng
tác, làm cho tốc độ phản ứng không tăng. Phản ứng trong trƣờng hợp có chất cạnh
tranh của phản ứng enzyme sẽ nhƣ sau:
K1
E+ S

K2
ES

E+P

K -1
K1
E+ I

EI
K -1

2.3.6.2

Các chất kìm hãm không cạnh tranh

Chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị trí khác với trung tâm
hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, làm giảm hoạt
động xúc tác của nó dẫn đến giảm vận tốc phản ứng.
Nhƣ vậy, phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hƣớng không có lợi cho hoạt động xúc

tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI,
enzyme vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS nhƣ
phản ứng sau:
E+ S

ES

E+ I

EI

ES + I

EIS

EI + S

EIS

E+P

+ Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng
Các sản phẩm phản ứng có thể đóng vai trò nhƣ chất kìm hãm không cạnh tranh.
Nếu nhƣ phản ứng xảy ra do chất A và chất B, có sự tham gia của enzyme để tạo

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang

14