BÁO CÁO THỰC TẬP TẠI PHÒNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT THÀNH PHỐ ĐÀ NẮNG

BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................................3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP.......................................................4
1.1. Lịch sử, bộ phận chức năng của Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng..............4
1.1.1. Lịch sử của Trung tâm.........................................................................................4
1.1.2. Các bộ phận chức năng của Trung tâm...............................................................4
1.2. Giới thiệu về Phòng công nghệ tế bào thực vật..........................................................4
1.2.2. Chức năng, nhiệm vụ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật................................4
1.3.2. Sơ đồ bố trí thiết bị phòng hóa môi trường........................................................5
1.4. Các trang thiết bị, dụng cụ và máy móc của phòng..................................................6
1.4.1. Dụng cụ...............................................................................................................6
....................................................................................................................................6
1.4.2.1. Nồi hấp khử trùng........................................................................................6
1.4.2.2. Tủ sấy...........................................................................................................8
1.4.2.3. Máy đo pH....................................................................................................9
1.4.2.4. Máy khuấy từ.............................................................................................10
1.4.2.5. Cân kỹ thuật...............................................................................................11
1.4.2.6. Cân điện tử.................................................................................................12
1.4.2.7. Máy cất nước..............................................................................................12
1.4.2.8. Bếp gas.......................................................................................................13
1.4.2.9. Buồng cấy vô trùng....................................................................................14
1.4.2.9.1. Buồng cấy vô trùng 2 người AC – 312..............................................14
1.4.2.9.2 Buồng cấy vô trùng 1 người AHC-4A1..............................................14
1.4.2.10. Máy hút ẩm..............................................................................................15
1.4.2.11. Kính hiển vi OPTIKA..............................................................................15
1.4.2.12. Hệ thống nuôi cấy bán ngập chìm Rita...................................................15

1.4.2.13. Máy lắc.....................................................................................................17
1.4.2.14. Bếp từ.......................................................................................................17
Chương 2 : CÁC KỸ THUẬT TRONG PHÒNG NUÔI CẤY TẾ BÀO...........................19
2.1. Kỹ thuật pha môi trường...........................................................................................19
2.1.1. Hóa chất..............................................................................................................19
Bảng 2.1. THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS....20
2.1.2. Cách tiến hành...................................................................................................21
2.2. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng............................................................23
2.3. Vô trùng mô nuôi cấy................................................................................................24
2.4.Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy......................................................................25
2.4.1. Dụng cụ thủy tinh...........................................................................................25
2.3.2. Nút đậy...........................................................................................................26
Chương 3 :QUY TRÌNH TẠO CÂY CÚC TỪ...................................................................27
CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT....................................................27
3.1. Kiến thức chung về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật...............................27
3.1.1. Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.........................28
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 1


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

3.1.1.1. Nuôi cấy phôi.............................................................................................28
3.1.1.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời...............................................................28

3.1.1.3. Nuôi cấy mô phân sinh..............................................................................29
3.1.1.4. Nuôi cấy bao phấn.....................................................................................29
3.1.1.5. Nuôi cấy tế bào đơn...................................................................................29
3.1.1.6. Nuôi cấy protoplast....................................................................................30
3.2 Giới thiệu chung về cúc.............................................................................................30
3.2.1 Lịch sử trồng trọt............................................................................................30
3.2.2 Đặc điểm thực vật học....................................................................................31
Nhân chồi..............................................................................................................................32
3.3.2 Thuyết minh qui trình :.......................................................................................32
3.3.2.1Khử trùng mẫu.............................................................................................32
3.3.2.2.Vào mẫu.......................................................................................................33
3.3.2.3. Nhân chồi....................................................................................................35
a. Nguyên liệu......................................................................................................................35
b. Dụng cụ...........................................................................................................................35
c. Phương pháp....................................................................................................................35
KẾT LUẬN..........................................................................................................................36
KIẾN NGHỊ..........................................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................................37
NHẬN XÉT CỦA CƠ QUAN THỰC TẬP........................................................................38

SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 2


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long

CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

MỞ ĐẦU
Trên cơ sở những lý thuyết học được trên giảng đường, sinh viên rất cần có thêm
cơ hội tiếp xúc công việc trên thực tế, nhằm rèn luyện kỹ năng và tránh bỡ ngỡ khi ra
trường, trong chương trình đào tạo dành cho chuyên nghành Công nghệ Sinh học tại
trường ĐHBK Đà Nẵng, sinh viên có nhiều đợt thực tập, thí nghệm, .. mà trong đó thực
tập công nhân là một trong những kỳ thực tập khá quan trọng.
Nhận thức được tầm quan trọng của việc làm quen với phòng thí nghiệm, thực hiện
các công việc nghiên cứu, và đặc biệt hơn là mong muốn tìm hiểu sâu hơn về Công nghệ
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật – hướng phát triển mũi nhọn của nghành CNSH, em lựa
chọn và được phân về thực tập ở “Phòng Công nghệ Tế bào thực vật” thuộc Trung Tâm
CNSH Thành Phố Đà Nẵng
Hơn một tháng thực tập tuy ngắn ngủi nhưng đã giúp em có cái nhìn chi tiết hơn về
nuôi cây mô và tế bào thực vật, củng cố chắc kiến thức mà em đã được học trên ghế nhà
trường.
Em xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng, Phòng Công
nghệ Tế bào Thực vật đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện cho em được học hỏi và hoàn
thành tốt đợt thực tập này.

SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 3


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long

CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP
1.1. Lịch sử, bộ phận chức năng của Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng
1.1.1. Lịch sử của Trung tâm
Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng được tách ra từ Trung tâm Công nghệ
Sinh học và Ứng dụng Khoa học Công nghệ Thành phố Đà Nẵng theo quyết định số
8725/QD-UBND ngày 12 tháng 11 năm 2010, và chính thức thành lập vào ngày 1 tháng 1
năm 2011.
1.1.2. Các bộ phận chức năng của Trung tâm
+ Ban giám đốc.
+ Phòng Tổng hợp Hành chính.
+ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật.
+ Phòng Công nghệ Vi sinh .
+ Trạm sản xuất và kinh doanh.

1.2 . Giới thiệu về Phòng công nghệ tế bào thực vật
1.2.1. Giới thiệu
Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học. Hiện đang
ở khu dân cư Đông Phước, quận Cẩm Lệ.
1.2.2. Chức năng, nhiệm vụ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật
- Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ tế bào thực vật nhằm sản xuất giống cây trồng
chất lượng cao phục vụ các vùng trồng trọt, các nhà vườn, hộ nông dân trên địa bàn thành
phố Đà Nẵng và các vùng lân cận.
- Tham mưu cho Ban lãnh đạo Trung tâm trong sự phát triển ngành Công nghệ Tế
bào Thực vật phục vụ công tác bảo tồn và nhân nhanh các giống cây trồng, nguồn gen
thực vật quý, hiếm.
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 4


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

- Đề xuất, nghiên cứu và triển khai các chương trình ứng dụng khoa học công nghệ,
các đề tài, dự án thuộc các cấp.
- Thực hiện công tác đào tạo, chuyển giao công nghệ tế bào thực vật cho các cá
nhân, tổ chức có nhu cầu.
1.3 . Sơ đồ bố trí các phòng và các thiết bị
1.3.1. Sơ đồ bố trí các phòng
Phòng

WC Phòng hóa và môi trường

môi

trường

Phòng họp

Hành lang
Phòng nuôi cây

Phòng cấy vô

Sảnh chung

trùng

Phòng làm việc

Hình 1.1: Sơ đồ bố trí các phòng
1.3.2. Sơ đồ bố trí thiết bị phòng hóa môi trường
Máy

đo Cân kỹ thuật và

pH
Nơi

cân điện tử

Tủ sấy

Nồi hấp khử trùng

đồ

dùng

vệ

sinh chai

Bàn

lọ và các

trường

dụng

Tủ

pha

môi
Tủ lạnh

cụ

pha môi
Máy cất

Bếp gas

nước

Lò vi

Nồi

hấp

sóng

khử trùng

Hình 1.2: Sơ đồ bố trí thiết bị phòng hóa môi trường

SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 5


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

1.4. Các trang thiết bị, dụng cụ và máy móc của phòng
1.4.1. Dụng cụ

a. Bình Duran

b. Bình thủy tinh

c. Ống đong

d. Phễu thủy tinh

e. Panh kẹp

f. Kéo

g. Khay đựng dụng cụ

h. Đèn cồn

i. Dao cấy

Hình 1.3. Dụng cụ thí nghiệm
1.4.2. Trang thiết bị và máy móc
1.4.2.1. Nồi hấp khử trùng
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 6


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

*Hãng sx: Hirayama – Nhật Bản
*Model: HV110A
*Công dụng : dùng để hấp thanh trùng môi trường , dụng cụ sấy ….

Hình 1.4. Nồi hấp Hirayama HV-100
* Hướng dẫn sử dụng
- Bật nguồn , mở nắp nồi

- Thêm nước cất vào sao cho ngập thanh ngang của mâm
- Kiểm tra mức nước ở bình xả hơi, luôn đảm bảo ở mức LOW
- Cho giỏ hấp chứa môi trường,dụng cụ cần hấp vào nồi và đóng nắp
- Bật nguồn điện
- Chọn chế độ hấp khử trùng, có nhiều chế độ hấp:
+ MODE 1, 2: ( Dùng để tiệt trùng môi trường )
+ MODE 3: ( Dùng tiệt trùng dụng cụ )
+ MODE 4: ( Dùng để rã đông Agar )
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 7


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

- Bấm START
- Nồi bắt đầu hoạt động ( chữ Heat nháy )
- Quá trình hấp kết thúc khi nhiệt độ hiển thị nhỏ hơn 97ºC, nhấn STOP
- Mở nắp và lấy giỏ hấp ra
1.4.2.2. Tủ sấy
* Model: OF-22G
* Xuất xứ: Jeiotech – Hàn Quốc
* Công dụng: dùng để sấy các thiết bị, dụng cụ nuôi cấy…

Hình 1.5. Tủ sấy

* Hướng dẫn sử dụng
- Ấn nút Power
- Cài đặt nhiệt độ
+ Ấn nút Temp
+ Ấn nút ↓↑ để điều chỉnh giá trị nhiệt độ cần cài đặt và ấn nút □ để lưu
giá trị cài đặt
- Cài đặt thời gian
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 8


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

+ Ấn nút Time
+ Ấn nút ↓↑ để chọn chế độ thời gian cài đặt và ấn nút □ để lưu giá trị thời
gian cài đặt
- Ấn nút Start để bắt đầu hoạt động
- Ấn nút Stop để máy ngưng hoạt động trước khi mở cửa máy
* Chú ý: Trong quá trình sấy chú ý đến nhiệt độ vật dụng cần sấy, tránh xảy ra
cháy nổ
1.4.2.3. Máy đo pH
* Model

: HI-2211

* Xuất xứ

: HANNA – Ý

* Công dụng : dùng để đo pH trong môi trường nuôi cấy

Hình 1.6. Máy đo pH
* Hướng dẫn sử dụng
- Bật máy
- Tháo nắp đậy bảo quản điện cực pH
- Rửa đầu điện cực đo pH bằng nước cất, thấm khô bằng giấy mềm
- Nhúng điện cực đo pH và điện cực đo nhiệt độ vào dung dịch cần đo (ngập ít nhất
4 cm) và khấy đều
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 9


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

- Điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl hoặc NaOH về giá trị cần đo
- Khi giá trị đo đã ổn định, đọc giá trị hiển thị trên màn hình
- Sau khi đo, rửa điện cực bằng nước cất, thấm khô điện cực bằng giấy mềm, đậy
nắp bảo quản lại

- Tắt nguồn
- Vệ sinh thiết bị sau khi sử dụng
* Chú ý: Nếu thiết bị yêu cầu hiệu chuẩn, phải hiệu chuẩn lại thiết bị cho kết quả
đo chính xác
1.4.2.4. Máy khuấy từ
* Model: IKA- RH basic 2
*Hãng: IKA-Đức
*Xuất xứ: Malaysia
*Công dụng: dùng để khuấy đều môi trường nuôi cấy

Hình 1.7. Máy Khấy Từ
* Hướng dẫn sử dụng
- Bật nguồn
- Đặt môi trường lên máy
- Dùng cá từ đã được rửa sạch bằng nước cất bỏ vào môi trường
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 10


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

- Điều chỉnh tốc độ tại nút Mot
- Điều chỉnh nhiệt độ tại nút Temp
- Khuấy xong tắt nguồn, vớt cá từ ra rửa lại với nước cất

- Vệ sinh chỗ làm
1.4.2.5. Cân kỹ thuật
* Model: AND-GF 300
* Xuất Xứ: Nhật Bản
*Công dụng: Cân hóa chất

Hình 1.8 . Cân kỹ thuật
*Thông số kỹ thuật
- Giới hạn cân: 310g
- Sai số: 0.001g
* Hướng dẫn sử dụng
- Bật nguồn
- Lấy nắp ở phía trên của hộp cân ra
- Đặt vật đựng lên đĩa
- Ấn nút O/T để điều chỉnh khối lượng ban đầu về 0
- Đưa mẫu vật cần đo vào vật đựng rồi đậy nắp hộp cân lại
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 11


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

- Cân xong tắt nguồn
- Vệ sinh bàn cân sau khi sử dụng

1.4.2.6. Cân điện tử
* Model: TE 612
* Xuất xứ: SARTORIUS – Germany
*Công dụng: Cân hóa chất

Hình 1.9. Cân điện tử
*Thông số kỹ thuật
- Giới hạn cân : 610g
- Sai số : 0.01g
*Hướng dẫn sử dụng
- Bật nguồn
- Đặt vật đựng lên đĩa cân
- Ấn nút Tare để điều chỉnh khối lượng ban đầu về 0
- Đưa chất cần cân khối lượng vào vật đựng
- Cân xong tắt nguồn
- Vệ sinh cân sau khi sử dụng
1.4.2.7. Máy cất nước
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 12


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

* Model : DZ 5

* Xuất xứ: Trung Quốc
*Công dụng:Tạo ra nước cất từ nước thong thường

Hình 1.10. Máy cất nước
* Hướng dẫn sử dụng
- Mở nước cấp vào không quá 1/3 (ly từ đáy lên). Quan sát đến khi nước thoát ở
đầu ra thành từng dòng liên tục khoảng 5 phút
- Bật công tắc điện chờ đến khi nước sôi
- Cho ống vào bình hứng để lấy nước cất
- Tắt máy khi cất nước xong
1.4.2.8. Bếp gas
* Model : GS – XU2006GEP
* Xuất xứ : GOLDSUN - Việt Nam
* Công dụng : dùng để nấu môi trường

SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 13


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

Hình 1.11. Bếp gas
1.4.2.9. Buồng cấy vô trùng
1.4.2.9.1. Buồng cấy vô trùng 2 người AC – 312

* Model: AC – 312
* Xuất xứ: Trần Vũ Corp – Việt Nam

Hình 1.12. Buồng cấy vô trùng 2 người AC – 312
1.4.2.9.2 Buồng cấy vô trùng 1 người AHC-4A1
* Model : AHC- 4A1
* Xuất xứ : ESCO - Singapore

Hình 1.10. Buồng cấy vô trùng 1 người AHC-4A1
* Hướng dẫn sử dụng
- Vệ sinh lau chùi box trước khi làm việc
- Bật nguồn
- Bật đèn UV trong vòng 30 phút
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 14


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

- Tắt đèn UV và bật quạt gió ( nên chờ khoảng 30 phút sau khi tắt đèn mới bắt đầu
làm việc)
- Bật đèn huỳnh quang bắt đầu làm việc
- Sau khi kết thúc quá trình làm việc, tắt đèn, quạt, nguồn
- Vệ sinh box sau khi làm việc xong

1.4.2.10. Máy hút ẩm
* Model: Winix SDH-3401V
* Xuất xứ : Winix - Hàn Quốc

Hình 1.14. Máy hút ẩm
1.4.2.11. Kính hiển vi OPTIKA

Hình 1.15. Kính hiển vi
1.4.2.12. Hệ thống nuôi cấy bán ngập chìm Rita
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 15


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

*Mục đích : Đây là phương pháp nuôi cấy mẫu trên môi trường lỏng nhằm giảm tỷ lệ
nhiễm bệnh, giảm chi phí giá thành, tăng hệ số nhân giống. Trong hệ thống này mẫu sẽ
được ngập trong môi trường lỏng ở một thời gian nhất định sau đó lấy ra rồi cứ theo 1
chu kỳ chúng tiếp tục lặp lại
* Xuất xứ : Cirad - Pháp

Hình 1.16 .Hệ thống nuôi cấy bán ngập chìm Rita
* Nguyên tắc hoạt động

SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 16


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

Hình
1.17. Sơ
đồ hoạt
động hệ
thống
RITA
Pha 1: mô
không ngập
trong

môi

trường
Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy
môi trường lỏng lên ngập mô cấy
Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA
Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới.
1.4.2.13. Máy lắc

* Model: JSOS 700

Hình 1.15. Máy lắc JSOS 700
1.4.2.14. Bếp từ
* Hãng xuất xứ: Media
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 17


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

Hình 1.19. Bếp từ
* Hướng dẫn sử dụng
- Cắm phích điện
- Đặt nồi lên bếp
- Bập bếp tại nút ON/OFF
- Điều chỉnh nhiệt độ tại nút - +
- Nấu xong tắt bếp, rút phích cắm
- Vệ sinh chỗ làm
1.4.2.15. Lò vi sóng
* Hãng sản xuất: Brew wave – LG

SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 18


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

Hình 1.20.Lò vi sóng

Chương 2 : CÁC KỸ THUẬT TRONG PHÒNG
NUÔI CẤY TẾ BÀO
2.1. Kỹ thuật pha môi trường
2.1.1. Hóa chất
* Thành phần môi trường dinh dưỡng
-

Nước cất

-

Chất hữu cơ
Đường- Acid amin- Vitamin (B1, B6, H, PP…)
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Auxin, Cytokinin,Gibberellin…)

-

Chất vô cơ

Đa lượng N, P, K, Ca, Mg, S
Vi l ượng Fe, Zn, B ,Co ,N ,Mn, Cu ,Al ,Mo, I

SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 19


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN
-

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

Các hợp chất không biết rõ thành phần
Nước dừa, nước khoai tây, nước chuối, casein, hydrolysalt, trypton, pepton…
Bảng 2.1. THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG
MS
Nồng độ
(mg/L)
KNO3
1900
KH2PO4
170
NH4NO3
1650
MgSO4.7H20
370

CaCl2.2H2O
440
H3BO3
6,2
MnSO4.4H2O
22,3
CoCl2.6H2O
0,025
CuSO4.5H2O
0,025
ZnSO4.4H2O
8,6
Na2MoO4.2H2O
0,25
KI
0,83
FeSO4.7H2O
27,8
Na2-EDTA
37,3
myo-inositol
100
Thiamine.HCl
0,1
Pyridoxine.HCl
0,5
Nicotinic acid
0,5
Glycine
2

Dung dịch stock
MS1:

MS2:
MS3:

MS4:
MS5:

Nồng độ trong dung
dịch mẹ (g/200 mL)
19
(× 10)
1,7
16,5
3,7
(×20) 8,8
0,124
0,446
0,5 mg
(× 20)
0,5 mg
0,172
5 mg
16,6 mg
(× 20)
0,556
0,746
2

2 mg
(× 20)
10 mg
10 mg
40 mg

Dung tích dùng cho
1 L môi trường
20 mL

10 mL

10 mL

10 mL

10 mL

* Thành phần vitamin
Dung dịch pirydoxine (B6) (10mg/mL)
Dung dịch Biotin (H) (1mg/mL)
Dung dịch Nicotinic Acid (P.P) (10mg/mL)
Dung dịch Thiamin-HCl (B1) (10mg/mL)…………..
* Thành phần các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (tính theo mg)
Dung dịch BAP (1mg/mL)
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 20

BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

Dung dịch IAA (1mg/mL)
Dung dịch IBA
Dung dịch Kinetin (1mg/mL)
Dung dịch NAA ( 1mg/mL)
Dung dịch 2,4-D (1mg/mL)
2.1.2. Cách tiến hành
Có 2 cách pha môi trường

Môi trường

Cách 1
Định mức thể tích bằng nước cất

Chuẩn pH

Bổ sung agar
và than hoạt tính (nếu có)

Đun sôi

Chia vào các dụng cụ
chứa môi trường

Đậy kín bình

Tiệt trùng môi trường
(121oC trong 20 phút)
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 21


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

Cách 2

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

Môi trường

Định mức thể tích bằng nước cất

Chuẩn pH

Chia vào các dụng cụ
chứa môi trường

Cân agar

Đậy kín bình

Tiệt trùng môi trường
(121oC trong 20 phút)

* Tiến hành như sau:
Đong chính xác MS cơ bản (môi trường MS( MS I ÷ V)), Vitamine, chất điều hoà
sinh trưởng, nước dừa (nếu có), đường vào bình đựng. Định mức đến thể tích cần pha
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 22


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

bằng nước cất, sau đó chuẩn độ đến pH 5.8 (môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật).
Môi trường đã được chuẩn pH, bổ sung Agar và than hoạt tính (nếu có) rồi đem đun đến
khi sôi (trong quá trình đun phải khuấy đều để không bị cháy agar và cho agar phân tán
đều trong môi trường). Sau đó chia môi trường vào các dụng cụ chứa môi trường, đậy kín
bình bằng cách dùng nút bông kèm nắp giấy hoặc dùng nắp nilon cột dây thun cột chặt
miệng bình.
Ở cách pha thứ hai, khi pha môi trường bỏ qua công đoạn nấu môi trường. Cân
Agar và chia đều vào trong các bình. Đổ môi trường đã được chuẩn pH vào các bình có
chứa agar. Sau đó đậy kín bình.
Các bình đã được đậy kín cho vào tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút.
Ngoài các dụng cụ chứa môi trường bằng thủy tinh chúng ta có thể sử dụng các túi

nilon để đựng môi trường. Các túi nilon và kẹp phải được thanh trùng và đưa vào tủ cấy
đã vô trùng. Thao tác đổ môi trường vào túi nilon được tiến hành trong box cấy vô trùng
giống như đối với vi sinh.
Đối với môi trường có chứa than hoạt tính, sau khi hấp xong. Trước khi đặt lên kệ
phải lắc vài vòng cho than hoạt tính không lắng xuống đáy.
2.2. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thủy
tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng
nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này.
Buồng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15 m 2, có hai lớp cửa để
tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch
men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử
lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác
vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ
formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH 3 25% cũng trong 24
giờ. Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 90%.

SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 23


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mũ vải, khẩu

trang của người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất... Trên bàn cấy
thường xuyên có một đèn cồn (hoặc đèn gas) để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng
cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc.
Trước khi cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay
bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy cần có một đèn tử
ngoại 40W treo trên trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi không có người trong phòng cấy.
Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của không khí
trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải
chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại, ra vào buồng cấy nhiều lần.
2.3. Vô trùng mô nuôi cấy
Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như: hạt giống,
phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ... Tùy theo sự tiếp xúc với
điều kiện môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Hầu
như không thể vô trùng mô nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong
chứ không hạn chế ở bề mặt.
Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa chất
có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời
gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẻ ngách lồi lõm trên bề
mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy.
Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường
người ta xử lý mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn 70% sau đó mới xử lý trong
dung dịch diệt khuẩn.
Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và có
ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy.
Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối
với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng dưới
dòng nước chảy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3-5
lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 24


BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN

GVHD:TS.Đặng Đức Long
CBHD:Nguyễn Thanh Hưng

khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên
mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp
cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy,
nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử, chắc
chắn sẽ đạt kết quả.
Thời gian xử lý

STT Tác nhân vô trùng

Nồng độ

1

Calcium hypochlorite

9-10%

5-30

Rất tốt

2

Sodium hypochlorite

2%

5-30

Rất tốt

Nước Bromine

1-2%

2-10

Rất tốt

4

H2O2

10-12%

5-15

Tốt

5

HgCl2

0,1-1%

2-10

Khá

6

Kháng sinh

4-50 mg/L

30-60

Khá

3

(phút)

Hiệu quả

Bảng 2.1. Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt khuẩn
để xử lý mô cấy thực vật
2.4.Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy
2.4.1. Dụng cụ thủy tinh

Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải là loại thủy tinh
trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ thủy tinh gây
ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy.
Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng. Thông thường, chỉ cần
xử lý dụng cụ thủy tinh bằng sulfochromate một lần đầu khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ
cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước máy nhiều lần và cuối cùng tráng bằng
nước cất. Sau khi để ráo nước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng để do thể tích) cần
được vô trùng khô bằng cách sấy ở 60-70 oC/2 giờ. Sau khi nguội được lấy ra cất vào chỗ
ít bụi.
SVTH:Nguyễn Đại Tùng

Lớp:09SH

Trang 25