KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ ĐỘ XỬ LÍ DEMECOLCINE LÊN KẾT QUẢ LOẠI NHÂN TẾ BÀO TRỨNG LỢN PHỤC VỤ CHO NHÂN BẢN VÔ TÍNH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯƠNG XUÂN ĐẠI

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ ĐỘ
XỬ LÍ DEMECOLCINE LÊN KẾT QUẢ
LOẠI NHÂN TẾ BÀO TRỨNG LỢN
PHỤC VỤ CHO NHÂN BẢN VÔ TÍNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010


LỜI CẢM ƠN
Franklin Roosevelt đã từng nói một câu nói bất hủ: “Trong đời người có một điều tệ
hại hơn cả thất bại, đó là không dám thực hiện việc mình muốn làm”. Trước khi
thực hiện đề tài này tôi cũng đã suy nghĩ rất nhiều và cũng được cảnh báo rằng có
thể tôi sẽ gặp thất bại, nhưng với tình yêu và sự đam mê dành lĩnh vực nhân bản vô
tính, tôi đã bắt tay vào thực hiện việc mình muốn làm. Dù kết quả thế nào đi chăng
nữa, tôi cũng cảm thấy rất vui mừng vì qua 1 quá trình làm việc tôi được tích lũy
thêm kiến thức, kinh nghiệm và được làm công việc mình yêu thích. Tôi không biết
công trình của mình thành công tới đâu nhưng có một điều chắc chắn rằng kết cuộc
tôi vẫn sẽ là người thất bại nếu không có sự dạy dỗ, động viên, chỉ bảo của thầy, cô,
bạn bè và những người thân trong gia đình. Vì vậy bằng tất cả tấm lòng của mình
tôi xin gửi đến lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất.

Trước tiên, để hoàn thành cuốn luận văn này tôi xin bày tỏ sự ngưỡng mộ và lời
cảm ơn sâu sắc đến TS. Bùi Xuân Nguyên – Trưởng phòng công nghệ phôi - Viện
công nghệ sinh học, người hướng dẫn khoa học cho tôi trong thời gian thực hiện đề

tài. Mặc dù rất bận rộn với công việc nhưng thầy vẫn dành thời gian chỉ bảo và
truyền đạt những kinh nghiệm quí báu, tận tình giúp đỡ, sửa từng câu, chữ cho một
người chưa có kinh nghiệm viết văn phong khoa học như tôi để tôi có thể hoàn
thành luận văn. Thầy còn truyền cho tôi niềm đam mê khoa học, sự nghiêm túc,
trách nhiệm trong công việc nghiên cứu.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Phan Kim Ngọc đã tạo điều kiện
cho tôi được thực hiện đề tài luận văn này. Xin cảm ơn thầy vì những lời chỉ dạy bổ
ích, tôi đã học được rất nhiều từ một người tâm huyết với khoa học như thầy.


Qua gần 3 năm được học tập, làm việc dưới mái trường Đại học Khoa học Tự nhiên
TPHCM tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong BGH, Khoa Sinh học, Phòng
Sau đại học…Đặc biệt, tôi xin gửi lời tri ân đến PGS.TS. Nguyễn Tường Anh,
PGS.TS. Phạm Thành Hổ, những người thầy đã định hướng, dạy bảo, nhắc nhở tôi
từ những ngày đầu khi làm luận văn.

Qua đây cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Dương Tấn Nhựt (Viện sinh học Tây
nguyên) đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian làm đề tài, có những chỉ dẫn
khoa học quí báu cùng với những nhận xét thẳng thắn để giúp tôi làm việc được tốt
hơn.

Cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Thuận (Đại học Konkuk) đã truyền đạt cho tôi những
kinh nghiệm quí báu trong lĩnh vực nhân bản vô tính.

Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Thị Ước, anh Cao Xuân Hiếu, Luyện Quốc
Hải, anh Nguyễn Xuân Hưng (Viện CNSH) đã có những chỉ dẫn quí báu.

Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Lê Thị Loan (Viện Pasteur Đà Lạt), TS. Nguyễn Xuân
Tùng, ThS. Lương Văn Dũng, ThS. Nguyễn Bích Liên (Khoa Sinh học- Đại học Đà

Lạt) đã động viên nhắc nhở tôi.


Cảm ơn các bạn trên diễn đàn sinhhocvietnam.com: Nguyễn Trường Khoa (Viện di
truyền nông nghiệp), Nguyễn Xuân Cường (Viện Lâm nghiệp), Huỳnh Như Ngọc
Hiển, Nguyễn Văn Cương, Nguyễn Hữu Hoàng, Nguyễn Khuê (ĐHKHTN
TPHCM), Dương Văn Cường (ĐH Thái Nguyên), Lê Ngọc Hưng (ĐH Bách khoa
Hà Nội), Trần Giang Vũ Vi (ĐH Bách khoa Đà Nẵng), Nguyễn Ngọc Lương (ĐH
Huế) đã hỗ trợ các bài báo quốc tế trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài
Trong suốt hơn 1 năm làm việc cùng với các bạn phòng thí nghiệm Nghiên cứu và
Ứng dụng tế bào gốc tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Phạm Văn Phúc, Chị Thương
Huyền cùng các bạn Lê Trầm Nghĩa Thư, Lê Thành Long, Phạm Quốc Việt, Chung
Tố Nhi, Trương Hải Nhung, Nguyễn Mai Hương, Ngô Duy Bình, Nguyễn Thị Diệu
Hằng, Đặng Thị Tùng Loan, Trần Thị Như Mai, Nguyễn Thành Trung, Vũ Bích
Ngọc, Lê Thành Tâm đã luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên tôi.
Đặc biệt, xin cảm ơn đến các cộng sự Nguyễn Mỹ Anh, Nguyễn Khánh Hòa, Trần
Thị Thu Phương, Võ Hồ Diệp Khánh đã cùng tôi thức trắng đêm trong hơn 1 năm
để thực hiện đề tài.
Cảm ơn các bạn Nguyễn Thanh Hiền (ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội), Nguyễn Xuân
Đồng, Lê Bá Cung, Nguyễn Đức Huy, Nguyễn Thị Phương Mai (ĐH Đà Lạt) đã
động viên, giúp đỡ, góp ý.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Đinh Thiện Mỹ, Đinh Văn Tí và 2 em Thiện
Phú, Huyền Cơ.
Cảm ơn các bạn Hồng Phúc, Hoàng Anh, Hữu Duy, Giang, Băng, Tâm, Nhàn, Thi,
Chi, Sen, Hân, Thùy, Lâm, Khương, Thảo lớp SLĐV K17.
Xin cảm ơn tập thể lãnh đạo Công Ty VISSAN, các cô chú bảo vệ, các anh chị
trong công ty, chúc công ty ngày càng phát triển. Cảm ơn các bạn trong lab của IVF
Vạn Hạnh. Cảm ơn các anh, chị, cô, chú phục vụ ở thư viện trung tâm thuộc ĐHQG
TPHCM, thư viện Cao học ĐHKHTN, thư viện Khoa học tổng hợp TPHCM.

Cảm ơn em đã bên cạnh, động viên anh trong những lúc khó khăn…

Cảm ơn em Đoàn đã động viên anh hai.

Và hơn hết, từ đáy lòng mình, Con xin cảm ơn Ba, Má đã nuôi con khôn lớn, tạo
mọi điều kiện tốt nhất cho con được học hành, làm việc và là chỗ dựa cho con mỗi
khi khó khăn.

TPHCM, ngày 23 tháng 8 năm 2010

Trương Xuân Đại


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các từ viết tắt
Danh mục hình
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Đặt vấn đề
Phần I: Tổng quan tài liệu
1.1. Tế bào trứng, vai trò của nhân, nguyên sinh chất trong quá trình hình thành,
phát triển tế bào trứng và nhân bản vô tính .............................................................. 1
1.1.1. Sự hình thành và phát triển tế bào trứng .................................................... 1
1.1.2. Sự thành thục của tế bào trứng .................................................................. 2
1.1.2.1. Sự thành thục nhân ........................................................................... 3
1.1.2.2. Sự thành thục tế bào chất ................................................................. 3
1.1.3. Hoạt động phân tử của tế bào trứng ........................................................... 4

1.1.3.1. MPF-nhân tố phát động chín trứng .................................................. 4
1.1.3.2. CSF-nhóm ức chế tế bào .................................................................. 5
1.1.3.3. MAP kinase ...................................................................................... 6
1.1.3.4. APC- phức hợp phát động anaphase ................................................ 6
1.1.4. Sự tái thiết lập chương trình khi thực hiện cấy nhân ................................. 6
1.2. Đại cương về loại nhân trong nhân bản vô tính động vật ................................. 7
1.2.1. Loại nhân bằng phương pháp “mò mẫm” (“Blind” enucleation) .............. 7
1.2.2. Loại nhân với thuốc nhuộm Hoechst và ánh sáng tia cực tím ................... 8
1.2.3. Loại nhân bằng phương pháp li tâm thang nồng độ (Centrifugation
enucleation) .......................................................................................................... 8
1.2.4. Loại nhân bằng phương pháp telophase (Telophase enucleation)............. 9
1.2.5. Loại nhân bằng phương pháp sử dụng hóa chất hỗ trợ (Chemical assistant
enucleation) .......................................................................................................... 10
1.2.5.1. Tổng quan về demecolcine............................................................... 11


1.2.5.2. Tính chất của demecolcine ............................................................... 11
1.3. Nhân bản vô tính lợn ......................................................................................... 12
1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân bản vô tính ở lợn ..................... 14
1.3.1.1. Tế bào cho ........................................................................................ 14
1.3.1.2. Kĩ thuật chuyển nhân ....................................................................... 14
1.3.1.3. Hoạt hóa ........................................................................................... 15
1.3.1.4. Sự tái thiết lập chương trình và phát triển phôi lợn ......................... 16
1.3.2. Những thay đổi khi loại nhân bằng phương pháp sử dụng demecolcine
trong nhân bản vô tính ở lợn ................................................................................ 17
1.3.3. Chuẩn bị tế bào nhận ................................................................................. 17
1.4. Nhân bản vô tính ở Việt Nam ........................................................................... 21
Phần II: Vật liệu- phương pháp
2.1. Đối tượng thí nghiệm .................................................................................... 23
2.2. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 23

2.2.1. Dụng cụ ............................................................................................... 23
2.2.2. Thiết bị ................................................................................................ 24
2.3. Hóa chất và môi trường ................................................................................ 25
2.3.1. Hóa chất .............................................................................................. 25
2.3.2. Môi trường .......................................................................................... 25
2.3.2.1. Môi trường thu nhận buồng trứng .................................................... 25
2.3.2.2. Môi trường thu nhận và rửa tế bào trứng ..................................... 26
2.3.2.3. Môi trường nuôi thành thục trứng in vitro ................................... 26
2.3.2.4. Môi trường ủ tế bào trứng trước khi loại nhân ............................ 26
2.3.2.5. Môi trường loại nhân tế bào trứng ............................................... 26
2.4. Phương pháp ................................................................................................. 27
2.4.1. Phương pháp thu nhận buồng trứng lợn.............................................. 28
2.4.2. Thu nhận tế bào trứng lợn ................................................................... 29
2.4.2.1. Thu nhận bằng phương pháp chọc hút......................................... 29
2.4.2.2. Thu nhận bằng phương pháp cắt nang ......................................... 29


2.4.3. Phương pháp nuôi thành thục trứng in vitro ....................................... 30
2.4.4. Phương pháp loại tế bào cumulus ....................................................... 31
2.4.5. Phương pháp khảo sát nồng độ demecolcine thích hợp cho loại nhân32
2.4.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian thích hợp cho việc loại
nhân ............................................................................................................... 32
2.4.7. Ảnh hưởng của thời gian IVM đến kết quả loại nhân ......................... 32
2.4.8. Khảo sát ảnh hưởng của demecolcine kết hợp cytochalasin B lên tế bào
trứng ............................................................................................................ 33
2.4.10. Phương pháp loại nhân tế bào ........................................................... 33
2.4.10.1. Phương pháp ép đẩy................................................................... 34
2.4.10.2. Phương pháp xử lí demecolcine và kết hợp hút nhân ................ 35
2.4.11. Phương pháp nhuộm Hoechst 33342 ........................................... 37
2.4.12. Phương pháp thống kê .................................................................. 37

Phần III: Kết quả -biện luận
3.1. Kết quả thu và nuôi trứng thành thục ........................................................... 38
3.1.1. Kết quả thu trứng ................................................................................ 38
3.1.2. Kết quả nuôi trứng thu được bằng phương pháp cắt nang .................. 40
3.1.3. Kết quả nuôi trứng thu được bằng phương pháp chọc hút.................. 41
3.1.4. So sánh hiệu quả của 2 phương pháp .................................................. 42
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ demecolcine lên tế bào trứng ................................ 45
3.3. Kết quả khảo sát thời gian xử lí demecolcine thích hợp cho loại nhân ........ 48
3.4. Ảnh hưởng của thời điểm xử lí loại nhân tế bào trứng bằng demecolcine ... 49
3.5. So sánh hiệu quả loại nhân giữa phương pháp ép- đẩy và phương pháp xử lí
demecolcine kết hợp với hút nhân ....................................................................... 52
3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của demecolcine và cytochalasin B lên hiệu quả
tạo chỗ nhô của tế bào trứng ................................................................................ 56
Phần IV: Kết luận-đề nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APC
BSA
CB
CNSH
COCs
CSF
De
DNA
eGF
FBS
GV

GVBD
hCG
IVM
MAPK
MI
MII
MPF
MT
NCSU23
NST
NT
PB2
PB1
PMSG
PVP
SCNT
TCM
UV

anaphase promoting complex
bovine serum albumin
cytochalasin B
công nghệ sinh học
cumulus oocyte complex
cytostactic factor
demecolcine
deoxyribonucleic acid
epidermal growth factor
fetal bovin serum
germinal vesicle

germinal vesicle breakdown
human chorionic gonadotropin
in vitro maturation
mitogen-activated protein kinase
metaphase I
metaphase II
maturation promoting factor
microtubule
north california state university 23
nhiễm sắc thể
nuclear transfer
polar body 2
polar body 1
pregnant mare’s serum gonadotropin
polyvinyl pyrolidone
somatic cell nuclear transfer
tissue culture medium
ultra violet


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

Cấu tạo tế bào trứng lợn ....................................................................... 1

Hình 1.2.

Các giai đoạn của quá trình sinh trứng ................................................ 2

Hình 1.3.

Các giai đoạn thành thục của nhân ...................................................... 3

Hình 1.4.

Hoạt động của phân tử MPF trong tế bào trứng .................................. 4

Hình 1.5.

Vai trò của CSF trong tế bào trứng ...................................................... 5

Hình 1.6.

Công thức cấu tạo demecolcine ........................................................... 11

Hình 1.7.

So sánh giữa sinh sản tự nhiên và sinh sản vô tính.............................. 12

Hình 1.8.

Mô hình gen trị liệu khi sử dụng lợn nhân bản vô tính........................ 13

Hình 1.9.

Các bước trong kĩ thuật nhân bản vô tính lợn...................................... 14

Hình 2.1.

Hệ thống vi thao tác và kính hiển vi đảo ngược .................................. 24

Hình 2.2.

Tủ đựng hóa chất.................................................................................. 25

Hình 2.3.

Máy mài kim ........................................................................................ 25

Hình 2.4.

Máy tạo dáng kim ................................................................................ 25

Hình 2.5.

Máy kéo kim ....................................................................................... 25

Hình 2.6.

Tủ thao tác vô trùng ............................................................................. 25

Hình 2.7.

Buồng trứng lợn ................................................................................... 28

Hình 2.8.

Hình dạng các tế bào trứng loại A, B, C ............................................. 30

Hình 2.9.

Các bước loại bỏ tế bào cumulus của tế bào trứng .............................. 31

Hình 2.10.

Các bước loại nhân bằng phương pháp ép- đẩy ................................... 35

Hình 2.11.

Đĩa 4 giếng có vi giọt và đĩa Φ90 có phủ dầu khoáng ...................... 35

Hình 2.12.

Các bước loại nhân tế bào trứng bằng cách hút ................................... 37

Hình 3.1.

Tế bào trứng đã xử lí demecolcine....................................................... 47

Hình 3.2.

Hình dạng tế bào trứng thay đổi theo thời gian xử lí demecolcine.......49

Hình 3.3.

Tế bào trứng ở các thời gian IVM khác nhau ...................................... 51

Hình 3.4.

Tế bào trứng 30-32 giờ (xử lí demecolcine) ........................................ 52


Hình 3.5.

Hình dạng tế bào trứng sau khi loại nhân ép - đẩy .............................. 52

Hình 3.6.

Kết quả nhuộm với Hoechst 33342 sau khi loại nhân ......................... 53

Hình 3.7.

Hình dạng tế bào trứng sau khi loại nhân bằng cách hút ..................... 54

Hình 3.8.

Kết quả nhuộm Hoechst 33342 sau khi xử lí demecolcine, loại nhân . 54

Hình 1.

Máy kéo................................................................................................ iii

Hình 2.

Hệ thống máy mài và ảnh kim đang được mài qua thị kính ................ iv

Hình 3.

Kĩ thuật cắt đầu kim ............................................................................. v

Hình 4.

Kĩ thuật tạo kim giữ ............................................................................. v

Hình 5.

Kĩ thuật tạo đầu nhọn kim tiêm............................................................ vi

Hình 6.

Bẻ cong kim thao tác và góc bẻ cong .................................................. vi


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.

Thành tựu nhân bản vô tính lợn từ 2000-2006 .................................... 19

Bảng 2.1.

Các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm ................................................ 23

Bảng 2.2.

Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm.................................................. 24

Bảng 2.3.

Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ De và CB ... 33

Bảng 3.1.

Kết quả phương pháp cắt nang và phương pháp chọc hút. .................. 38

Bảng 3.2.

Kết quả nuôi trứng in vitro thu được ở phương pháp cắt nang ............ 40

Bảng 3.3.

Kết quả nuôi trứng in vitro thu được ở phương pháp chọc hút ........... 41

Bảng 3.4.

So sánh 1 số chỉ tiêu của 2 phương pháp ............................................. 42

Bảng 3.5.

Kết quả khảo sát nồng độ demecolcine ............................................... 45

Bảng 3.6.

Ảnh hưởng thời gian xử lí demecolcine .............................................. 48

Bảng 3.7.

Ảnh hưởng của thời điểm xử lí demecolcine ...................................... 50

Bảng 3.8.

Kết quả loại nhân bằng phương pháp ép - đẩy .................................... 53

Bảng 3.9.

Kết quả xử lí loại nhân bằng demecolcine kết hợp với hút nhân......... 54

Bảng 3.10.

Ảnh hưởng của De và CB lên hiệu quả tạo chỗ nhô ............................ 56


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. So sánh tỉ lệ trứng của 2 phương pháp................................................. 43
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ demecolcine.................................................. 46
Biểu đồ 3.2. So sánh 2 phương pháp loại nhân ........................................................ 55


ĐẶT VẤN ĐỀ
Không phải ngẫu nhiên mà các nhà khoa học đều dự đoán rằng thế kỉ XXI sẽ
là thế kỉ của công nghệ sinh học. Những năm cuối của thế kỉ XX và đầu của thế kỉ
XXI nhân loại đã bắt đầu chứng kiến những thành tựu mang tính bước ngoặt và đột
phá trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Ngày 5/7/1996, đã đi vào lịch sử ngành
công nghệ sinh học thế giới với sự ra đời của cừu Dolly, động vật có vú đầu tiên
trên thế giới được sinh ra bằng phương pháp nhân bản vô tính. Sự kiện này đánh
dấu một bước tiến nhảy vọt trong lĩnh vực nhân bản vô tính, đồng thời mở ra một
trang sử mới cho nhân loại. Tiếp theo cừu Dolly các nhà khoa học của các nước
Mỹ, Nhật Bản, Ý, Anh, Hàn Quốc,… đã bắt đầu điền tên mình lên bản đồ nhân bản
vô tính động vật trên thế giới bằng những thành công trên các đối tượng động vật

khác như: bò, chuột, ngựa, lợn, dê, thỏ, khỉ,… Những thành công bước đầu này sẽ
góp phần quan trọng vào việc sử dụng các cơ quan thay thế cho con người, tìm hiểu
cơ chế của sự lão hóa, nghiên cứu mô hình bệnh lí, bảo tồn động vật quí hiếm hoặc
đã bị tiệt chủng.
Mặc dù có những bước đầu thành công đáng khích lệ nhưng tế bào động vật
luôn được xem là “Cỗ máy kì diệu và bí ẩn của tự nhiên”. Vì thế, những khám phá
và thành công chỉ mới là bước đầu. Bên cạnh đó, những khiếm khuyết về mặt di
truyền cũng như về kĩ thuật và phương pháp dẫn đến tỉ lệ thành công của phương
pháp nhân bản vô tính hiện nay rất thấp, chỉ từ 1-2% vào năm 2000, (Tsunoda và
cs., 2000), tới 7-8% năm 2006 (Vajta và cs.,2006). Trong đó, tỉ lệ thành công trong
nhân bản vô tính lợn cũng không phải là ngoại lệ. Mặc dù vậy nhưng nhân bản vô
tính lợn lại rất được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm với hi vọng chúng sẽ trở
thành cứu tinh cho con người trong việc thay thế và ghép nội tạng. Con lợn đầu tiên
ra đời bằng phương pháp nhân bản vô tính trên thế giới được ghi nhận năm 2000.
Từ đó, đã có nhiều cải tiến về mặt kĩ thuật và phương pháp để dần hoàn thiện nhằm
nâng cao tỉ lệ thành công.
Hai loại tế bào cần thiết cho quá trình nhân bản vô tính là tế bào cho nhân
(donor nucleus - karyoplast) và tế bào trứng nhận (recipient oocytes - cytoplast) rất


được quan tâm. Tế bào trứng nhận chứa đầy đủ các thành phần cần thiết cho phép
nhân tế bào cho tái lập trình (reprogramming). Vì vậy, loại nhân là chìa khóa quan
trọng cho sự thành công của nhân bản vô tính động vật. Trong qui trình nhân bản vô
tính thì khâu loại nhân (enucleation) là một khâu then chốt, nó có ảnh hưởng rất lớn
đến sự phát triển phôi cũng như tỉ lệ thành công trong kĩ thuật nhân bản vô tính
(Ibánẽz và cs., 2003). Có nhiều phương pháp loại nhân được đưa ra, bổ sung, phát
triển và hoàn thiện với mục đích nhằm nâng cao tỉ lệ thành công trong việc tạo động
vật nhân bản vô tính. Tại Việt Nam, cùng với xu thế khoa học trên thế giới, các nhà
khoa học trong nước tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia TPHCM cũng đã

từng bước tiếp cận với kỹ thuật nhân bản vô tính và đã có những thành công đáng
khích lệ.
Mặc dù demecolcine hay colcemid là một hóa chất hỗ trợ rất tốt để xử lí loại
nhân tế bào động vật trên thế giới, nhưng tại Việt Nam, việc sử dụng hóa chất hỗ trợ
demecolcine để loại nhân chưa được đề cập nhiều. Nhằm góp một phần nhỏ bé của
mình vào những nghiên cứu nhân bản vô tính ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề
tài “Khảo sát ảnh hưởng của chế độ xử lí demecolcine lên kết quả loại nhân tế
bào trứng lợn phục vụ cho nhân bản vô tính”.
Với mục tiêu nâng cao hiệu quả tạo tế bào trứng lợn đã được loại nhân thông
qua:
Kết quả khảo sát nâng cao hiệu quả thu và nuôi thành thục tế bào
trứng lợn in vitro
Kết quả khảo sát nồng độ demecolcine và thời gian thích hợp để xử lí
tế bào trứng lợn
Kết quả khảo sát thời điểm thích hợp để xử lí demecolcine với tế bào
trứng lợn đạt hiệu quả cao.
Kết quả so sánh hiệu quả loại nhân bằng phương pháp ép - đẩy và
phương pháp xử lí demecolcine kết hợp với hút nhân.
Sử dụng cytochalasin B kết hợp với demecolcine để nâng cao hiệu
quả loại nhân


PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. Tế bào trứng, vai trò của nhân, nguyên sinh chất trong quá trình hình
thành, phát triển tế bào trứng và nhân bản vô tính
1.1.1 Sự hình thành và phát triển tế bào trứng
Buồng trứng lợn có dạng hình hạt đậu, cấu tạo gồm hai phần chính: vỏ và

tủy. Buồng trứng được nối với ống dẫn trứng để nhận các tế bào trứng và vận
chuyển trứng đến nơi thụ tinh. Cấu trúc của buồng trứng gồm nhiều nang trứng, mỗi
nang trứng có chứa tế bào trứng. Trong tế bào trứng, bao quanh nhân là nguyên sinh
chất, tiếp đến là khoảng không quanh bào tương, bên ngoài là lớp màng trong suốt
(zona pellucida). Ngoài cùng là lớp tế bào hạt (cumulus) (hình 1.1)

Hình 1.1. Cấu tạo tế bào trứng lợn

Sau khi sinh, các tế bào trứng của cá thể cái bước vào chu kì giảm phân và
dừng ở giai đoạn prophase I, hình thành tế bào trứng sơ cấp. Giai đoạn này được gọi
là giai đoạn túi mầm (germinal vesicle stage), bên trong tế bào trứng toàn bộ nhiễm
sắc thể (NST) được bao bọc bởi túi mầm và tế bào trứng dừng phát triển cho đến
khi cơ thể đạt độ tuổi thành thục sinh dục.
Đến giai đoạn tiếp theo, một hoặc vài tế bào trứng sơ cấp sẽ tiếp tục quá
trình giảm phân và phát triển thành tế bào trứng thứ cấp. Trong suốt giai đoạn này
màng nhân bắt đầu gấp lại, các lỗ trên màng nhân biến mất, màng nhân bị phân rãnh
và được đóng gói lại trong các túi nhỏ rồi sau đó bị tiêu hủy. Hiện tượng này được
gọi là sự phá vỡ túi mầm (germinal vesicle breakdown - GVBD), đây là tín hiệu đầu


tiên cho thấy hoạt động giảm phân của tế bào trứng được tiếp tục. Sau khi tiếp xúc
với tế bào chất, NST cô đặc lại, tâm động xuất hiện và bộ NST phân bố trên thoi vô
sắc, giai đoạn này được gọi là giai đoạn metaphase I (MI). Sự phân chia bộ NST
tương đồng và hai nửa bộ NST di chuyển về hai cực của tế bào đây là giai đoạn
anaphase I. Tuy nhiên, thoi vô sắc không nằm ở trung tâm mà di chuyển ra phía rìa
của tế bào và kết quả là sau telophase I, một trong hai tế bào giữ lại hầu hết tế bào
chất và tế bào còn lại chỉ chứa 1 phần vật liệu di truyền gọi là thể cực thứ nhất
(polar body 1-PB1) (hình 1.2)

Hình 1.2. Các giai đoạn của quá trình sinh trứng (B. Cummings, 2001)

1.1.2. Sự thành thục của tế bào trứng
Sự thành thục của tế bào trứng (oocyte maturation) bao gồm sự thành thục
nhân và tế bào chất. Theo Schoevers, sự thành thục về tế bào chất và nhân không
thể tách rời nhau mà nó có mối liên hệ chặt chẽ, tương tác qua lại trong tế bào trứng
(Schoevers và cs., 2005).


1.1.2.1. Sự thành thục nhân
Quá trình này được thể hiện trong nhân và trải qua các giai đoạn: giai đoạn
phá vỡ túi mầm, metaphase I, metaphase II và cuối cùng là sự phóng noãn (hình
1.3)

Hình 1.3. Các giai đoạn thành thục của nhân (Wilson, 1925)

Khả năng giảm phân của trứng có liên quan mật thiết với kích thước tế bào
trứng hay của nang chứa tế bào trứng đó. Ở lợn, các nang trưởng thành có kích
thước từ 2 đến 3 mm. Tế bào trứng ở giai đoạn MII có đường kính khoảng 110 -120
µm. Đây là cơ sở cho việc chọn nang để thu trứng cho nuôi chín trứng in vitro nhằm
đạt hiệu quả cao.
1.1.2.2. Sự thành thục tế bào chất
Sự thành thục tế bào chất là yếu tố đánh giá gián tiếp khả năng thụ tinh của
trứng, phân chia tế bào và phát triển đến giai đoạn phôi nang (blastocyst). Sự thay
đổi hình thái, vị trí một số bào quan của trứng có ý nghĩa quan trọng đến sự thành
thục tế bào chất và chuẩn bị cho quá trình phát triển tiếp theo của tế bào trứng.
Trong đó, bộ phận quan trọng nhất để đánh giá sự thành thục của tế bào chất là bộ
máy Golgi. Trong tế bào trứng, bộ máy Golgi sẽ đảm nhiệm việc hình thành các tế
bào hạt và màng trong suốt. Số lượng thể Golgi hiện diện trong trứng tăng theo
đường kính của nang (Sosnowski và cs., 2003).

1.1.3. Hoạt động phân tử của tế bào trứng
Quá trình chuyển nhân tế bào sinh dưỡng (somatic cell nuclear transfer SCNT) trong nhân bản vô tính động vật đạt hiệu quả cao hay thấp một phần được
quyết định bởi hoạt động của các yếu tố phân tử của tế bào trứng. Hiện nay, một số
yếu tố phân tử được biết đến và có vai trò quan trọng như:
1.1.3.1. MPF - Nhân tố phát động chín trứng
Năm 1971, Massui và Markert đã chứng minh rằng tất cả các hiện tượng có
liên quan đến tế bào trứng như: sự phá vỡ túi mầm, sự cô đặc của NST khi tiếp xúc
với tế bào chất, giai đoạn MI, MII đều được điều hòa bởi 1 nhân tố gọi là nhân tố
phát động trứng chín (maturation promoting factor - MPF). MPF là một protein
kinase có cấu trúc dị phân tử kép (heterodimer) được mã hóa bởi gen cdc2 và điều
hòa bởi tiểu đơn vị cyclin B (Nurse, 1990). Hoạt tính kinase của MPF khởi đầu cho
hàng loạt phản ứng dẫn đến sự phá vỡ màng nhân, đóng xoắn NST, tái cấu trúc bộ
xương tế bào. Ở tế bào trứng động vật có vú, MPF là nguyên nhân gây ức chế sự
phát triển trứng ở giai đoạn MII. Sự bất hoạt MPF và phân hủy cyclin B cũng gây ra
sự chuyển trạng thái trứng từ MII sang anaphase II (hình 1.4)

Hình 1.4. Hoạt động của phân tử MPF trong tế bào trứng (Staveley, 2004)


Cơ chất chính của MPF là protein histone H1 tham gia đóng gói NST. Trong
trường hợp cấy nhân hoạt tính MPF trong nội bào rất cao sau khi nhân của tế bào
cho được chuyển vào trong tế bào chất của tế bào trứng nhận. Ở đó sẽ xảy ra hiện
tượng phá vỡ màng nhân và đóng xoắn NST. Sự đóng xoắn của NST trong nhân tế
bào cho sẽ được cảm ứng bởi tế bào chất nhận. Mức độ đóng xoắn sớm hay muộn
phụ thuộc vào hoạt tính MPF và thời gian tiếp xúc giữa chúng. Hoạt tính của MPF
được điều hòa bởi yếu tố có tên gọi là nhóm ức chế tế bào (cytostatic factor - CSF)
(Endo và cs., 2008).
1.1.3.2. CSF - Nhóm ức chế tế bào
Trong các tế bào trứng ở giai đoạn MII, hoạt tính MPF cao hay thấp được

duy trì bởi các nhân tố thuộc nhóm ức chế tế bào. Hoạt tính CSF liên quan tới
protein khác nhau như: MAP kinase (mitogen-activated protein kinase), cdk2
(cyclin-dependent kinase 2), các proto-oncogen c-mos… Trong đó, Mos là thành
phần quan trọng của CSF, có vai trò ức chế sự phân hủy cyclin B, duy trì hoạt tính
MPF đồng thời hoạt hóa MAP kinase. Sự hoạt hóa MAP kinase lại ức chế hoạt tính
phân hủy protein của ubiquitin và dẫn đến ức chế sự phân hủy cyclin B. Do đó sự
bất hoạt CSF làm cho quá trình phân hủy cyclin trở nên dễ dàng hơn từ đó làm giảm
hoạt tính MPF (Cibelli và cs., 2002) (hình 1.5a)

Hình 1.5. Vai trò của CSF trong tế bào trứng (Inoue, 2007)


1.1.3.3. MAP kinase
MAP kinase giữ nhiều vai trò quan trọng trong điều hòa chu kì tế bào trong
quá trình phát triển của tế bào trứng, đặc biệt là điều hòa sự cấu thành hệ vi ống.
Sau giai đoạn GVBD, MAP kinase phân bố ở các vị trí xảy ra sự tổng hợp các hệ
thống vi ống như: (i) xung quanh vị trí các NST đóng xoắn, (ii) trong các thoi phân
bào giảm ở giai đoạn MI, (iii) trong các vùng cực ở giai đoạn anaphase sớm, (iv)
trong các vị trí trung tâm của thoi vô sắc được kéo dài ở giai đoạn chuyển tiếp từ
anaphase sang telophase I và (v) trong thoi vô sắc ở giai đoạn MII (Fulka và cs.,
2001). Ngoài ra, MAP kinase còn giữ trạng thái phosphoryl hóa cao từ giai đoạn MI
đến MII (là khoảng thời gian các vi ống lắp ráp hình thành thoi vô sắc) trong khi
hoạt tính MPF lại giảm trong khoảng thời gian từ anaphase I đến telophase I. Ức
chế sự hoạt hóa MAP kinase khi chuyển từ MI đến MII đã gây ra sai hỏng trong
việc hình thành thể cực thứ nhất và thoi vô sắc (hình 1.5b). Vì vậy, việc hoạt hóa
MAP kinase giữ một chức năng quan trong trong việc điều hòa hình thành hệ thống
vi ống. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc tái cấu trúc lại hệ thống bộ xương thế
bào và tái lập chương trình sau khi thực hiện chuyển nhân.
1.1.3.4. APC - Phức hợp phát động anaphase
APC (Anaphase promoting complex) ở tế bào sinh dưỡng là 1 phức hợp

protein nó gồm nhiều tiểu phần điều hòa chu kì tế bào (Peters, 2002). Trong giai
đoạn MII của tế bào trứng một phần là do CSF ức chế APC từ việc giảm cyclin B.
Việc giữ cho cyclin B-cdc2 ở mức độ cao sẽ làm cho tế bào trứng ở giai đoạn nghỉ
cho đến khi sự thụ tinh xảy ra. Vào lúc thụ tinh, 1 chuỗi các tín hiệu Ca2+ tràn vào
và kết thúc bằng việc phân hủy cấu trúc cyclin B để bắt đầu chi kì phân chia tiếp
theo của tế bào (Nixon và cs., 2002).
1.1.4. Sự tái thiết lập chương trình khi thực hiện cấy nhân
Ở động vật có vú, sự rụng trứng diễn ra ở giai đoạn MII và nghỉ ở kì này cho
đến khi được thụ tinh, sau đó tiếp tục quá trình giảm phân, đẩy thể cực thứ 2 ra
ngoài, hình thành tiền nhân đực và tiền nhân cái. Phôi đi vào quá trình nguyên phân


liên tục, biệt hóa thành các tế bào riêng biệt, kết quả là hình thành các mô và cơ
quan. Chương trình phát triển sinh học luôn đảm bảo sự chuyển tiếp thành công từ
tế bào trứng đến thế hệ con. Thông thường, khi một chương trình đã bắt đầu không
thể quay ngược lại được. Sau trạng thái này, những tế bào riêng lẻ sẽ không thể phát
triển thành những cá thể mới do có nhiều biến đổi xảy ra trong DNA, kéo theo sự
biểu hiện gen trong quá trình phát triển tự nhiên. Tuy nhiên, khi chuyển nhân in
vitro các tế bào sinh dưỡng vào tế bào trứng, các yếu tố điều khiển của nguyên sinh
chất có thể làm quay ngược lại chương trình phát triển của các tế bào này. Người ta
gọi đây là quá trình tái thiết lập chương trình của nhân (nuclear reprogramming).
Nói cách khác khi DNA được tái thiết lập chương trình thì nó có thể phát triển theo
chiều hướng tạo thành phôi. Khi đó các tế bào cấu thành cơ thể sinh vật đa bào đều
thừa hưởng thông tin DNA nhân tương tự từ trứng đã thụ tinh. Điều này cho thấy tế
bào chất của trứng có khả năng giúp khôi phục lại tính toàn thế của tế bào sau khi
chuyển nhân (Don và cs., 2001).
1.2. Đại cương về loại nhân trong nhân bản vô tính động vật
Loại nhân tế bào trứng hay loại nhân (enucleation) là một trong những khâu
quan trọng nhất của quá trình chuyển nhân (nuclear transfer) trong nhân bản vô tính
động vật. Cho đến nay, có rất nhiều phương pháp loại nhân khác nhau về nguyên lí

và bản chất. Có thể chia một số phương pháp loại được sử dụng phổ biến trong nhân
bản vô tính động vật như sau:
1.2.1. Loại nhân bằng phương pháp “Mò mẫm” (“Blind” enucleation)
Phương pháp này được McGrath và Solter sử dụng lần đầu tiên năm 1983
trên tế bào trứng chuột. Đối với tế bào trứng của các động vật như: thỏ, cừu, dê, lợn,
chuột…, một đặc điểm rất dễ nhận thấy là vùng nhân (nuclear zone) của chúng rất
khó nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học. Do đó, muốn thực hiện mục tiêu loại bỏ
vật chất di truyền (chủ yếu là DNA) của các loài này để thực hiện nhân bản vô tính
là hết sức khó khăn.


Tuy nhiên, đúng như tên gọi của phương pháp này, hiệu quả loại nhân của
phương pháp này rất thấp. Theo Cheong, khi thực hiện phương pháp này khoảng
30% nguyên sinh chất của trứng bị loại bỏ trong quá trình thực hiện thao tác
(Cheong và cs., 1993). Điều này ảnh hưởng không tốt đến sự phục hồi của tế bào
trứng và sự tạo thành phôi nhân bản vô tính sau này. Một nhược điểm nữa là ở một
số loài vị trí của nhiễm sắc chất thường không nằm vị trí dưới PB1. Ở bò, 40,7%
nhiễm sắc chất được tìm thấy gần với vị trí của PB1 khi tế bào trứng ở giai đoạn
MII (Nour và Takahashi, 1999). Nghiên cứu trên thỏ, Mitalipov cho thấy rằng hơn
50% nhiễm sắc chất có vị trí khác với vị trí của PB1 (Mitalipov và cs., 1999). Do
những nhược điểm như vậy nên phương pháp này ít được lựa chọn để thực hiện
nhân bản vô tính động vật.
1.2.2. Loại nhân với thuốc nhuộm Hoechst và ánh sáng tia cực tím
Do nhược điểm khó dựa vào vị trí PB1 của phương pháp loại nhân “mò
mẫm” để có thể loại nhân 1 cách chính xác nên các nhà nghiên cứu đã cố gắng tiến
hành loại nhân dưới ánh sáng kính hiển vi huỳnh quang hay kết hợp với tia cực tím
(Wilmut và cs., 1997). Đối với phương pháp này, khi di chuyển vật chất di truyền ra
khỏi tế bào trứng chỉ một lượng nhỏ tế bào chất xung quanh thoi vô sắc bị loại ra,
do đó bảo vệ tế bào trứng ít bị ảnh hưởng đến khả năng phục hồi sau khi loại nhân.
Tuy nhiên, một thách thức đặt ra cho phương pháp này là tia UV có năng lượng cao

sẽ ảnh hưởng và có thể dẫn đến tổn thương các bào quan trong tế bào chất. Mặc dù
đa số các ý kiến đều cho rằng thuốc nhuộm Hoechst và ánh sáng UV đều có ảnh
hưởng không tốt và làm tổn hại đến tế bào trứng và thao tác loại nhân cần thực hiện
trong thời gian ngắn sẽ giảm đáng kể các tác hại nói trên.
1.2.3. Loại nhân bằng phương pháp li tâm thang nồng độ (Centrifugation
enucleation)
Phương pháp này chủ yếu dựa vào sự chênh lệch khối lượng giữa vật chất di
truyền của tế bào và tế bào chất để li tâm. Thuận lợi chủ yếu của phương pháp này
là có thể thực hiện loại nhân với số lượng lớn tế bào trứng mà không bị hạn chế về


thời gian (thời gian cho mỗi lần li tâm rất ngắn 2 - 4 phút). Tuy nhiên, phương pháp
này cũng mang tính ngẫu nhiên vì kích thước và độ tương đồng giữa vật chất di
truyền và tế bào chất của mỗi trứng không đồng đều dẫn đến số lượng trứng loại
nhân và chất lượng phôi không cao. Năm 1995, Tatham lần đầu tiên sử dụng
phương pháp này để loại nhân của trứng bò. Sau khi trứng được li tâm ở giai đoạn
MII, các tế bào chất được xếp thành từng lớp và dễ dàng nhận thấy (Tatham và cs.,
1995)
1.2.4. Loại nhân bằng phương pháp Telophase (Telophase enucleation)
Nguyên lí của kĩ thuật này là loại bỏ các nhiễm sắc chất ở giai đoạn
telophase, bằng cách hút bỏ PB2 và tế bào chất xung quanh nó sau khi tế bào trứng
được hoạt hóa (oocyte activated). Để thực hiện phương pháp này, các tế bào trứng
được nuôi thành thục điều kiện in vitro (in vitro maturation - IVM) trong 30 giờ
(Bordignon và Smith, 1998) hoặc 32 giờ (Liu và cs., 2000). Ở giai đoạn telophase
nhiễm sắc chất trong tế bào chất bên cạnh PB2 sẽ được loại ra. Sau đó, trứng sẽ
được hoạt hóa với thể mang ion canxi (calcium ionophore) A23187 và
cycloheximide. Kết quả thu được trên trứng bò là 100% nhiễm sắc chất ở gần PB2
bị loại bỏ, trong đó tỉ lệ loại nhân là 91,5% (Nour và Takahashi, 1999). Đây được
xem là một phương pháp loại nhân khá hiệu quả. Khi thực hiện loại nhân ở trứng bò
giai đoạn telophase II thì tỉ lệ phát triển phôi đến giai đoạn phôi dâu/ phôi nang

(morula/blastocyst) cao hơn khi loại nhân ở giai đoạn MII (Liu và cs., 2000).
Phương pháp này có lợi thế là diễn ra tương tự quá trình sinh học của tế bào trứng,
vì trứng được loại nhân sau khi đã kích hoạt. Ngoài ra, NST được liên kết chặt chẽ
với PB2, do đó, có thể loại bỏ chúng mà không dùng thuốc nhuộm như Hoechst
33342. Tuy nhiên, việc giảm hoạt động của MPF sẽ làm giảm khả năng chuyển
nhân và tái cấu trúc của tế bào với nhân tế bào sinh dưỡng nhận (Louis, 2003)