SẢN XUẤT β - CYCLODEXTRIN BẰNG CGTASE CỐ ĐỊNH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH T
RƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÕ THỊ KIM LOAN

SẢN XUẤT β - CYCLODEXTRIN
BẰNG CGTASE CỐ ĐỊNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

TP HCM - 2009


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn TS. TRẦN CÁT ĐÔNG đã tận tình giúp đỡ và
hướng dẫn em thực hiện đề tài
Xin cảm ơn tập thể phòng thí nghiệm Vi sinh công nghệ dược đặc biệt là
bạn VŨ THANH THẢO đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Cảm ơn bạn BÙI HỮU TRUNG đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài
trong thời gian lưu lại trường Khoa Học Tự Nhiên.
Cảm ơn bố mẹ, gia đình tôi trong suốt thời gian qua đã động viên giúp đỡ
tôi hoàn thành đề tài này.
Và cuối cùng cảm ơn những người xung quanh luôn nhắc nhỡ động viên
và giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành tốt bài báo cáo này.
Xin cảm ơn tất cả.

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
LỜI MỞ ĐẦU

i
ii
iv
vii
ix

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

10

1.1. Tổng quan về Cyclodextrin

10

1.1.1. Tên gọi [10] ........................................................................................... 10
1.1.2. Công thức [10, 23] ................................................................................. 10
1.1.3. Cấu trúc .................................................................................................. 11
1.1.4. Tính chất ................................................................................................ 12
1.1.5. Một số dẫn xuất của cyclodextrin [7, 9, 19] .......................................... 15
1.1.6. Sản xuất β-CD [9, 23, 25] ...................................................................... 15
1.1.7. Ứng dụng của Cyclodextrin [8, 9, 23] ................................................... 19
1.1.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước............................................ 24
1.2. Tổng quan về enzym CGTase [7, 20]
25
1.2.1. Enzym 4-a-Glucanotransferase ............................................................. 25

1.2.2. Tác động của 4-a-glucanotranferase [7, 19, 20, 23] ............................. 26
1.2.3. Phân loại 4-a-glucanotranferase [7, 15] ................................................ 26
1.3. Tổng quan về enzym cố định
32
1.3.1. Khái niệm về enzym cố định [15, 22].................................................... 32
1.3.2. Đặc điểm của enzym cố định [15, 26] ................................................... 32
1.3.3. Các ưu nhược điểm của enzym được cố định [15] ................................ 33
1.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzym [4] ............................. 34
1.3.5. Các phương pháp cố định enzym [15, 21, 22] ....................................... 35
1.3.6. Vật liệu cố định enzym [15, 21] ............................................................ 43
1.3.7. Reactor (Bình phản ứng) [1] .................................................................. 48
1.3.8. Ứng dụng của enzym cố định [1, 17] .................................................... 48
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
51
2.1. Bước cố định enzym CGTase

51

2.1.1. Vật liệu ................................................................................................... 51
2.1.2. Phương pháp .......................................................................................... 52
2.2. Bước xác định hàm lượng và hoạt tính CGTase cố định
61
2.2.1. Phương pháp Bradford [12] ................................................................... 61

ii


2.2.2. Phương pháp Kaneko ............................................................................. 62
2.2.3. Xác định hoạt tính tái sử dụng của E sau cố định .................................. 66
2.3. Bước sản xuất β-CD [5]

66
2.3.1. Các giai đoạn sản xuất ........................................................................... 66
2.3.2. Định lượng β-CD ................................................................................... 67
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
70
3.1. Bước cố định CGTase

70

3.1.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford .................... 70
3.1.2. Xác định hoạt tính chế phẩm Toruzyme® 3.0L .................................... 71
3.1.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định CGTase
trên EuC ...................................................................................................... 72
3.1.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định trên
Sepharose .................................................................................................... 83
3.1.5. Khảo sát các thông số cố định CGTase trên Chitosan ........................... 86
3.1.6. Khảo sát hiệu suất tái sử dụng của CGTase cố định trên EuC .............. 91
3.2. Bước sản xuất β-CD
91
3.3. Bàn luận
93
3.3.1. Đối với bước cố định ............................................................................. 93
3.3.2. Đối với bước sản xuất β-CD .................................................................. 93
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
94
4.1. Kết luận

94

4.1.1. Đối với bước cố định ............................................................................. 94

4.1.2. Đối với bước sản xuất β-CD .................................................................. 94
4.2. Đề nghị
94
4.2.1. Đối với bước cố định ............................................................................. 94
4.2.2. Đối với bước sản xuất β-CD .................................................................. 95
TÀI LIỆU THAM KHẢO
96

iii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CD

Cyclodextrin

α -CD

α-Cyclodextrin

β-CD

β -Cyclodextrin

γ-CD

γ –Cyclodextrin

4αG

4α glucanotransferase

CGTase

Cyclodextrin glucanotransferase

HP-β-CD

Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin

SEM

Scaning electron microscope

BSA

Bovine serum Albimin

MOS

Maltooligosacharide

TMED

Tetramethyleneethylenediamine

EuC

Eupergit C

HEMDA

Hexamethylenediamine

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của α, β và γ-cyclodextrin ................................................................ 11
Hình 1.2. Cấu trúc thứ cấp của β-CD ............................................................................. 11
Hình 1.3. Cyclodextrin tạo phức với một phân tử ngoại lai ........................................... 14
Hình 1.4. Tóm tắt quy trình sản xuất cyclodextrin dùng dung môi ............................... 17
Hình 1.5. Quy trình sản xuất cyclodextrin không dùng dung môi ................................. 19
Hình 1.6. Cyclodextrin tạo phức với thuốc ứng dụng trong ngành dược...................... 20
Hình 1.7. Enzym CGTase từ Bacillus ............................................................................ 25
Hình 1.8. Enzym CGTase tạo ra các loại cyclodextrin từ tinh bột................................. 27
Hình 2.1. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên EuC theo phương pháp hấp phụ ......... 53
Hình 2.2. Sơ đồ các bước hoạt hóa EuC theo phương pháp cộng hóa trị ...................... 55
Hình 2.3. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên EuC họat hóa theo phương pháp
cộng hóa trị ....................................................................................................... 55
Hình 2.4. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên sepharose theo phương pháp
hấp phụ.............................................................................................................. 56
Hình 2.5. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên Chitosan theo phương pháp hấp
phụ .................................................................................................................... 58
Hình 2.6. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên Chitosan theo phương pháp
cộng hóa trị ....................................................................................................... 61
Hình 2.7Sơ đồ các bước sản xuất β-CD ......................................................................... 69
Hình 3.1. Độ hấp thu theo nồng độ albumin .................................................................. 70
Hình 3.2. Đường chuẩn độ hấp thu theo nồng độ protein .............................................. 71
Hình 3.3. Độ hấp thu theo nồng độ β-CD ...................................................................... 71

Hình 3.4. Đường chuẩn độ hấp thu theo nồng độ theo β-CD ......................................... 72
Hình 3.5. Hiệu suất cố định trên EuC theo thời gian, tỷ lệ chất mang/enzym, pH
cố định .............................................................................................................. 75
Hình 3.6. Hiệu suất hoạt tính cố định trên EuC theo thời gian, tỷ lệ chất
mang/enzym, pH cố định .................................................................................. 76
Hình 3.7. Hiệu suất cố định theo độ pH và thời gian lắc với tỷ lệ chất
mang/enzym 1.1 bằng phương pháp cộng hóa trị trên EuC ............................. 77

v


Hình 3.8. Hiệu suất hoạt tính cố định theo độ pH và thời gian lắc với tỷ lệ chất
mang/enzym 1.1 bằng phương pháp cộng hóa trị trên EuC ............................. 79
Hình 3.9. Hiệu suất cố định theo phương pháp cố định và thời gian lắc với nồng
độ đệm la` 0.1M trên EuC ................................................................................ 81
Hình 3.10. Hiệu suất hoạt tính cố định theo phương pháp cố định và thời gian
lắc với nồng độ đệm 0,1M trên EuC................................................................. 82
Hình 3.11. EuC trước khi cố định (a), sau khi cố đinh hấp phụ (b) và cộng hóa
trị (c) ................................................................................................................. 83
Hình 3.12. Hiệu suất cố định trên Sepharose theo độ pH, thời gian lắc và loại
Sepharose .......................................................................................................... 84
Hình 3.13. Hiệu suất hoạt tính cố định trên Sepharosetheo độ pH, thời gian lắc,
loại Sepharose ................................................................................................... 86
Hình 3.14. Sepharose trước (a) và sau (b) khi cố định ................................................... 86
Hình 3.15. Hiệu suất cố định trên Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm
và thời gian lắc .................................................................................................. 87
Hình 3.16. Hiệu suất hoạt tính cố định trên Chitosan theo phương pháp cố định,
pH đệm và thời gian lắc .................................................................................... 89
Hình 3.17. Chitosan trước (a) và sau (b) khi cố định, Hình (b) hình bên trái
làchitosan cố định theo phương pháp hấp phụ, hình bên phải là

chitosan cố định theo phương pháp cộng hóa trị .............................................. 90
Hình 3.18. β-CD trước (trái) và sau (phải) chưng cất và lọc .......................................... 92
Hình 3.19. β-CD của Rhodia (a) và β-CD sản xuất được............................................... 92

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tóm tắt tính chất vật lý của các cyclodextrin quan trọng nhất. ..................... 12
Bảng 1.2. Một số tính chất về cấu trúc của CD ............................................................ 13
Bảng 1.3. Các tác nhân dùng sản xuất cyclodextrin trong quy trình dung môi ............. 17
Bảng 1.4. Một số dạng chế phẩm có sử dụng CD .......................................................... 21
Bảng 1.5. Tính chất enzym CGTase của một số chủng ................................................ 28
Bảng 1.6. Một số tính chất của sepharose ...................................................................... 47
Bảng 2.1. Cách pha các giai mẫu cho đường chuẩn xác định nồng độ protein.............. 61
Bảng 2.2. Cách pha giai mẫu cho đường chuẩn định lượng β-CD................................. 63
Bảng 2.3. Cách pha giai mẫu cho quá trình xác định hoạt tính enzym .......................... 64
Bảng 3.1. Độ hấp thu theo nồng độ albumin .................................................................. 70
Bảng 3.2. Nồng độ protein ban đầu dựa theo đường chuẩn ........................................... 71
Bảng 3.3. Độ hấp thu theo nồng độ β-CD ...................................................................... 71
Bảng 3.4. Hoạt tính riêng chế phẩm enzym ................................................................... 72
Bảng 3.5. Hiệu suất cố định EuC theo thời gian, tỷ lệ chất mang/enzym, độ pH ......... 74
Bảng 3.6. Hiệu suất hoạt tính cố định trên EuC theo thời gian, tỷ lệ chất
mang/enzym, pH pH cố định ............................................................................ 75
Bảng 3.7. Hiệu suất cố định EuC theo độ pH và thời gian lắc với tỷ lệ chất
mang/enzym 1.1 bằng phương pháp cộng hóa trị............................................. 76
Bảng 3.8. Hiệu suất hoạt tính cố định theo độ pH và thời gian lắc với tỷ lệ chất
mang/enzym 1.1 bằng phương pháp cộng hóa trị trên EuC ............................. 77
Bảng 3.9. Hiệu suất cố định theo phương pháp cố định và thời gian lắc với
nồng độ đệm là 0.1M trên EuC........................................................................ 80

Bảng 3.10. Hiệu suất hoạt tính cố định theo phương pháp cố định và thời gian
lắc với nồng độ đệm 0,1M trên EuC................................................................. 81
Bảng 3.11. Hiệu suất cố định trên Sepharose theo độ pH, thời gian lắc và loại
Sepharose .......................................................................................................... 84
Bảng 3.12. Hiệu suất hoạt tính cố định trên Sepharosetheo độ pH, thời gian lắc,
loại Sepharose ................................................................................................... 85

vii


Bảng 3.13. Hiệu suất cố định trên Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm
và thời gian lắc .................................................................................................. 87
Bảng 3.14. Hiệu suất hoạt tính cố định trên Chitosan theo phương pháp cố
định, pH đệm và thời gian lắc ........................................................................... 88
Bảng 3.15. Hiệu suất hoạt tính sau 5 lần tái sử dụng của CGTase cố đinh trên
EuC ................................................................................................................... 91
Bảng 3.16. Hiệu suất sản xuất và hiệu suất thu được trung bình của β-CD ................... 92

viii


LỜI MỞ ĐẦU
Trên thế giới, cyclodextrin đã được ứng dụng từ rất lâu và trong nhiều lĩnh
vực đa dạng do cấu trúc đặc biệt của chúng. Trong công nghiệp thực phẩm
được dùng để che giấu mùi, vị khó chịu, để ổn định và bảo vệ các thành phần
chức năng như acid amin, vitamin trong thực phẩm, làm phụ gia độn, tạo độ
nhớt,… Trong mỹ phẩm chúng được dùng để tạo ra các dạng hương liệu, nước
hoa có mùi bền, Trong công nghiệp hóa CD được ứng dụng trong việc tách
chiết các đồng phân quang học, làm cột sắc ký hay giá mang của phản ứng. Đối
với ngành dược CD là một tá dược quan trọng giúp tăng độ tan của các dược

chất không tan trong nước, giúp tăng độ hấp thu và sinh khả dụng hoặc kiểm
soát tốc độ phóng thích thuốc, ngoài ra nó còn giúp che dấu mùi, vị khó chịu
của nhiều hoạt chất. Tuy nhiên, tá dược này rất đắt tiền và hiện nay phải nhập
ngoại hoàn toàn.[11, 16, 18, 24]
Việc sản xuất CD hiện nay được thực hiện duy nhất bằng cách chuyển hóa
tinh bột với xúc tác của enzym cyclodextrin glucanotransferase (CGTase).
Nhưng nếu sản xuất β-CD theo phương pháp cổ điển là dùng enzym tự do thì
sản phẩm không đảm bảo độ tinh sạch. Mặt khác, việc sử dụng CGTase theo
phương pháp cổ điển chỉ sử dụng enzym 1 lần gây lãng phí. Do đó việc cố định
CGTase trên giá mang không những giúp tiết kiệm được chi phí sản xuất (tăng
sự ổn định và khả năng thu hồi enzym) và β-CD thu được tinh khiết hơn
(enzym không lẫn vào sản phẩm) mà còn là một hướng đi mới nhiều tiềm năng
tiếp cận về mặt công nghệ kỹ thuật, nhất là công nghệ enzym.
Việc sản xuất được β-cyclodextrin trong nước sẽ giúp tự chủ được nguồn
nguyên liệu làm thuốc và tạo điều kiện để công nghiệp dược phẩm trong nước
ứng dụng bào chế các chế phẩm có chất lượng cao, cạnh tranh được với các
sản phẩm ngoại nhập. Mặt khác, nguyên liệu để sản xuất β-cyclodextrin từ
tinh bột giúp tạo ra giá trị gia tăng mới cho tinh bột, qua đó thúc đẩy sự phát
triển ngành công nghiệp chế biến nông sản.

ix


Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Sản xuất β-CD bằng CGTase cố
định” nhằm khảo sát các loại chất mang, các phương pháp cố định khác nhau
v.v.. để đạt hiệu quả tối ưu nhất cho quá trình sản xuất.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Cyclodextrin
1.1.1. Tên gọi [10]

-

Cyclodextrin: oligosaccharide vòng, cycloamylose, glucan vòng,
Schardinger dextrin.

-

α-Cyclodextrin:

alfadex,

α-cycloamylose,

α-dextrin,

cyclohexaamylose, cyclomaltohexose.
-

β-Cyclodextrin:

betadex,

β-cycloamylose,

β-dextrin,

cycloheptaamylose, cyclomaltohepto, cycloheptaagglucan.
-

γ-Cyclodextrin: cyclooctaamylose.

1.1.2. Công thức [10, 23]
-

α-Cyclodextrin: C36H60O30, phân tử lượng: 972,85

-

β-Cyclodextrin: C42H70O35, phân tử lượng: 1135,00

-

γ-Cyclodextrin: C48H80O40, phân tử lượng 1297,14

x


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

1.1.3. Cấu trúc
1.1.3.1. Cấu trúc phân tử [10, 23]

Hình 1.1. Cấu trúc của α, β và γ-cyclodextrin
CD là các oligosaccharide vòng có số đơn vị C-glucose xác định nối với
nhau qua liên kết α-1,4 glycosid. Tùy vào số đơn vị glucose tạo thành mà
đường kính vòng khác nhau từ đó có thể chọn lọc phân tử phù hợp.
CD được tạo thành do kết quả của phản ứng chuyển nhóm glucan nội
phân tử từ quá trình phân cắt tinh bột bằng cyclodextrin glucotransferase.

Dạng phổ biến của các CD trong tự nhiên là α-CD, β-CD, γ-CD chứa lần
lượt 6, 7 và 8 phân tử D-glucopyranose nối với nhau qua liên kết α-1,4gycosid.
CD chứa nhiều đơn vị hơn glucose hơn cũng được mô tả nhưng cho đến giờ
vẫn chưa thấy vai trò quan trọng trong công nghiệp.
1.1.3.2. Cấu trúc thứ cấp [23]
Lõi kỵ nước

Vỏ háo nước

Hình 1.2. Cấu trúc thứ cấp của β-CD
Võ Thị Kim Loan

11


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

Cấu trúc 3 chiều của CD có dạng khuyên, khoang nội phân tử có tính kỵ
nước trong khi bề mặt bên ngoài lại thân nước. Khoang nội phân tử có thể chứa
các chất thân dầu. Cấu trúc này có thể làm thay đổi tính tan, khả năng phản ứng
hay tính ổn định của phân tử nằm trong khoang, do đó CD có rất nhiều ứng
dụng trong công nghệ thực phẩm, hóa học và dược phẩm.
Trong số các CD đã biết thì β-CD là chất được dùng nhiều nhất, rẻ nhất
và hữu ích nhất. Dựa vào khả năng này người ta xếp CD vào trong nhóm chất
ổn định và chất tan.
1.1.4. Tính chất
1.1.4.1. Tính chất vật lý [9, 23]
Các cyclodextrin tồn tại ở dạng tinh thể không màu hay bột kết tinh trắng

không mùi. Các CD không tan trong alcol, ceton, ether, các hydrocarbon thơm
và béo. Tính chất một số β-CD ứng dụng:
-

α-Cyclodextrin: tỷ trọng khối là 0,526 g/cm3, tỷ trọng thật 1,521
g/cm3, điểm chảy 250-261oC, [α]D+150,5o.Độ tan: 1g trong 7ml nước
ở 20oC , 20 ml ở 50oC. Độ ẩm 10,2% kl/kl. Liều gây chết tiêm tĩnh
mạch chuột (LD50): 0,79g/kg

-

β-Cyclodextrin tỷ trọng khối là 0,523 g/cm3, tỷ trọng thật 1,378 g/cm3,
điểm chảy 255-265oC, [α]D+162o, 1g trong 200ml propylenlycol, 50ml
nước ở 20oC , 20 ml ở 50oC, hầu như không tan trong acetone, ethanol
95% và methylen chloride. Độ ẩm 13-15% kl/kl. Liều gây chết tiêm
tĩnh mạch chuột (LD50): 1g/kg.

-

γ-Cyclodextrin: tỷ trọng khối là 0,568 g/cm3, tỷ trọng thật 1,471
g/cm3, điểm chảy 240-245oC, [α]D+177,4o, 1g trong 4,4ml nước ở
20oC , 2ml ở 45oC. Độ ẩm 8-18% kl/kl. Liều gây chết tiêm tĩnh mạch
chuột (LD50): 4g/kg.

Bảng 1.1. Tóm tắt tính chất vật lý của các cyclodextrin quan trọng nhất.

Võ Thị Kim Loan

12

Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

α-Cyclodextrin

β-Cyclodextrin

γ-Cyclodextrin

Công thức

C36H60O30

C42H70O35

C48H80O40

Khối lượng phân tử

9712,85

1135,00

1297,14

14,5

1,85

23,2

Độ ẩm(%)

10,2

13-15

8-18

[α]D20

+150,5

+162,0

177,4

Điểm chảy, oC

250-260

255-265

240-245

pKa (25oC)

12,331

12,202

12,081

Độ tan (25oC, g/ml
H2O)

1.1.4.2. Tính chất hóa học [9, 23]
CD là các oligosaccharid dạng vòng không có tính khử. Bằng cách oxi
hóa để tách lần lượt các glucose trong vòng người ta không thu được acid
formic hay formaldehid. Sản phẩm thoái hóa duy nhất của tất cả các CD trong
dung dịch acid là glucose. Tính thân nước của các CD theo thứ tự giảm dần
γ>β>α. Trong điều kiện acid, các CD bị thủy phân chậm hơn các
maltoseligosaccharid. Liên kết glycosid trong phân tử CD bị thủy phân bởi
enzym α-amylase mà không bị thủy phân bởi β-amylase. Tốc độ thủy phân
nhanh nhất xảy ra với γ-CD, sau đó là β-CD và α-CD.
Các CD rất bền và dể tan trong dung dịch kiềm (pH>14). Độ tan trong
nước của chúng tăng đáng kể trong dung dịch kiềm. Dưới khí quyển nitơ, các
CD bền tới 250oC.
Bảng 1.2. Một số tính chất về cấu trúc của CD
a-Cyclodextrin

b-Cyclodextrin

g-Cyclodextrin

Đường kính trong (A0)

4,7-5,3

6,0-6,5

7,5-8,3

Chiều cao vòng (A0)

7,9

7,9

7,9

Đường kính ngoài (A0)

14,6

15,4

17,5

104

157

256

0,1

0,14

0,20

Thể tích của khoang trên
mỗi mol cyclodextrin
Thể tích của khoang trên

Võ Thị Kim Loan

13


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

mỗi gam cyclodextrin(ml)

1.1.4.3. Quá trình tạo phức của cyclodextrin với một phân tử ngoại lai (hostguest) [19, 23]

+

Hình 1.3. Cyclodextrin tạo phức với một phân tử ngoại lai
Đặc tính đáng chú ý nhất của CD là khả năng tạo được các phức vùi rắn
(solid inclusion complexations) với nhiều chất ở dạng rắn, lỏng, khí. Dựa vào
đặc tính quan trọng này để sản xuất và cũng như ứng dụng CD. Trong quá trình
tạo phức này, không có bất kỳ liên kết đồng hoá trị hoặc liên kết ion nào tạo
thành. Trong dung dịch, sự hình thành hay phân ly phức là một quá trình cân
bằng động học.
Hằng số tốc độ K2 của quá trình tạo phức khoảng 100 – 108 mol/s. Do đó

việc tạo phức thường xảy ra rất nhanh, trong khoảng phần nghìn giây, và là
phản ứng toả nhiệt (DH<0). Độ bền của phức giảm khi nhiệt độ tăng lên.
Điều kiện quan trọng cho tạo phức vùi của một phân tử lạ với các CD
chính là cấu trúc lập thể của chúng. Khi kích thước của cấu trúc này phù hợp
với đường kính của khoang, trong đó đường kính này được quyết định bởi số
đơn vị glucose có trong vòng. Các phân tử lạ sẽ được giữ lại trong khoang của
CD. Khoang này có tính thân dầu, nó tạo ra một vi môi trường ở đó phần không
phân cực của chất có kích thước thích hợp có thể chui vào để hình thành ra
phức hợp. Với những phân tử lớn hơn thì chỉ có một phân tử đi vào được trong
khoang.

Võ Thị Kim Loan

14


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

Động lực chính cho việc tạo phức này là lực Van der Waals, các tương tác
kỵ nước, sự thay đổi năng lượng của cả hai thành phần và phần nào có liên
quan đến các liên kết hydro. Sự ổn định của phức phụ thuộc vào đặc tính kỵ
nước của phân tử lạ. Các phân tử phân cực mạnh tạo thành phức yếu.
1.1.5. Một số dẫn xuất của cyclodextrin [7, 9, 19]
Bằng cách thay thế hoặc gắn thêm các nhóm chức vào vị trí của các nhóm
hydroxyl trên bề mặt của b-CD. Người ta thu được các dẫn xuất như dimethylb-CD, 2-hydroxylethyl-b-CD, 2-hydroxypropyl-b-CD, 3-hydroxypropyl-b-CD,
trimethyl-b-CD…Vai trò và công dụng của chúng cũng tương tự như b-CD,
tuy nhiên các dẫn xuất có cải thiện về độ tan trong nước và giảm độc tính so
với CD.

Dẫn xuất của CD được chia thành các nhóm chính sau.
-CD-OH àCD-O-R
Với R – akyl, hydroxyalky (ether)
R=acyl(ester)
R = glycosyl
R – SO3, PO3
-CD –OHàCD-X
Với X – I, Br
X – NH2, NHR, NH2
X= SH, SR.
-CD-CH2-OHàCD-CO2H
Oxi hoá ở C6
1.1.6. Sản xuất β-CD [9, 23, 25]
CD được sản xuất bằng cách phân giải tinh bột với CGTase ở 25-90oC.
Trong công nghiệp người ta thường sử dụng tinh bột bắp và tinh bột khoai tây,
ngoài ra cũng có thể dùng tinh bột mì hoặc bột sắn. Các chủng vi khuẩn dùng
để sản xuất CD trong công nghiệp có thể kể đến như Bacillus macerans,

Võ Thị Kim Loan

15


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus circulans,
Bacillus coagulans , Klebsiella pneumonia, Klesiella oxytaca,……
Các bước trong quá trình sản xuất CD:

- Hồ hóa tinh bột
- Thuỷ phân tinh bột với amylase
- Cho tinh bột phản ứng với CGTase
- Bất hoạt enzym bằng nhiệt
- Tách CD ra khỏi hỗn hợp phản ứng
- Tinh chế và kết tinh CD từ nước
Về mặt công nghệ có 2 cách sản xuất CD là dùng dung môi và không
dùng dung môi.
1.1.6.1. Sản xuất cyclodextrin dùng dung môi
Thường thì CGTase tạo ra cả 3 loại CD trong dung dịch, phụ thuộc vào
enzym của từng chủng vi khuẩn và điều kiện phản ứng. Người ta có thể thêm
vào một số tác nhân để tăng hiệu suất và thay đổi tỉ lệ các CD thu được. Hầu
hết các tác nhân sẽ tạo thành phức vùi rắn với một loại CD nào đó theo nguyên
lý host – guest, làm cân bằng phản ứng dịch chuyển về phía tạo ra CD mong
muốn, sau đó phức này tách ra dễ dàng ra khỏi hỗn hợp phản ứng lỏng. Để thu
được CD người ta chưng cất lôi cuốn theo hơi nước hoặc chiết phức hợp với
dung môi hữu cơ.
Hiệu suất sẽ tăng đáng kể nếu sử dụng các enzym chuyên biệt. Ví dụ, αCGTase của Klebsiella oxytoca sản xuất chủ yếu α-CD trong giai đoạn đầu. Để
thu được γ-CD trên quy mô công nghiệp, một enzym γ-CGTase chuyên biệt
được phát triển.

Võ Thị Kim Loan

16


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

Bảng 1.3. Các tác nhân dùng sản xuất cyclodextrin trong quy trình dung
môi
α-CD

β-CD

1-decanol

Tricycloethylene

Toluen

Cyclohexan

Ethanol

n-butanol

γ-CD
Bromobenzen
α-napthol
Cyclohexadec-8-enzym-1-on

Dịch tinh bột
(làm nóng)
CGTase

Dung môi
Enzym
chuyển hóa

Tạo phức
hợp

Làm sạch
phức hợp

Thu dịch

Phá phức hợp
(chưng cất)

Thu hồi dung môi

Xử lý với
than hoạt

Thu dịch

Làm khô

Hình 1.4. Tóm tắt quy trình sản xuất cyclodextrin dùng dung môi

Võ Thị Kim Loan

17


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

1.1.6.2. Sản xuất cyclodextrin không sử dụng dung môi
Ở Nhật quy trình này phát triển từ lâu, chủ yếu sản xuất β-CD để làm chất
phụ gia trong thực phẩm. Hỗn hợp phản ứng chỉ gồm nước, tinh bột và enzym.
Quy trình có thêm một bước cho việc đường hoá tinh bột không được chuyển
hoá, đó là thuỷ phân chúng thành maltose và glucose dưới tác dụng của
glucoamylase. Quy trình kết tinh CD thu được cuối cùng sẽ khó hơn quy trình
trên. Chỉ có β-CD là sản xuất có hiệu quả nhờ quy trình này. Nhưng nhìn chung
nó vẫn có giá thành sản phẩm cao hơn phương pháp dùng dung môi.

Dịch tinh bột
(làm nóng)
CGTase
Enzyme
chuyển hóa
Glucoamylase
Đường hóa
hết tinh bột

Xử lý với
than hoạt

Làm sạch
Cô đặc với áp
suất thấp

Làm kết tinh

Ly tâm làm

sạch
Làm khô

Võ Thị Kim Loan

18


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

Hình 1.5. Quy trình sản xuất cyclodextrin không dùng dung môi
1.1.7. Ứng dụng của Cyclodextrin [8, 9, 23]
Một trong những vấn đề luôn được quan tâm hàng đầu của công nghệ và
kỹ thuật sinh học là việc tạo ra được phức vùi ở mức phân tử, điều này có ý
nghĩa đặc biệt cho việc chọn lọc, ly trích hay hòa tan các phân tử sinh học khác
nhau. Có khá nhiều chất đóng vai trò là tác nhân tạo phức hữu cơ trong tự
nhiên như protein, kháng thể hoặc chất vô cơ như zeolit, nhưng chỉ có CD là
tác nhân tạo phức có nhiều ứng dụng nhất.
Nhờ các đặc điểm sau mà CD được ứng dụng nhiều:
· Giúp ổn định, chống lại sự phân hủy của ánh sáng, oxy và nhiệt độ.
· Tăng tính tan trong nước.
· Phóng thích có kiểm soát.
· Giảm sự bay hơi.
· Che giấu mùi.
· Tăng sinh khả dụng.
· Độc tính trên tế bào không đáng kể
1.1.7.1. Ứng dụng cyclodextrin trong công nghiệp dược
Phức tạo thành giữa CD và thuốc khá bền, tăng tính tan và sinh khả dụng,

giảm được tác dụng phụ. Vì vậy các CD được dùng làm hệ thống chuyển giao
thuốc bên cạnh hệ thống polyme ( các màng bao phim polyme, nonosphere,
microsphere,….) do khả năng có thể làm thay đổi các tính chất lý, hóa, sinh học
của thuốc. Chúng được sử dụng trong nhiều đường đưa thuốc vào cơ thể như
đường uống, tiêm trực tràng, mũi, mắt, da….

Võ Thị Kim Loan

19


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

Hình 1.6. Cyclodextrin tạo phức với thuốc ứng dụng trong ngành dược

Võ Thị Kim Loan

20


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

Bảng 1.4. Một số dạng chế phẩm có sử dụng CD
Đường uống
Đường uống

Thuốc
Ketoconazol, testosreron
Piroxicam
Traconazol

Loại CD

Tác dụng

β-CD, 2 HPCD

Tăng độ hấp
thu

β-CD

Giảm tác dụng
phụ

HP-β-CD

Tăng tính tan
Đường mũi

Morphin, thuốc kháng
vius và insulin

2HP-β-CD

Tăng độ hấp

thu

Đường trực tràng

Flubiperfen

2HP-β-CD

Tăng độ hấp
thu

Đường tai

Dexamethason, chất ức
chế enzym

β-CD, 2HP-β- Tăng độ hấp
CD
thu

Carbonicanhydrase
Qua da:

Prostaglandin E1

O – ethyl βCD

Tăng độ bền
và độ hấp thụ

1.1.7.2. Trong công nghiệp thực phẩm
Đa số các chất tạo mùi tự nhiên hay nhân tạo đều là dầu bay hơi hoặc chất
lỏng không ổn định nên việc tạo phức vùi với CD là chất bảo vệ mùi đầy hứa
hẹn thay thế cho các kỹ thuật nang hoá. Nó giúp cho mùi vị của thực phẩm
được bền lâu qua nhiều công đoạn chế biến. Ở Nhật CD được xem như là “ tinh
bột biến tính” dùng trong công nghệ thực phẩm nhiều thập niên qua, là chất che
dấu mùi của thực phẩm tươi sống, chất ổn định dầu cá … bản thân CD cũng là
chất làm ngọt có nhiều ưu điểm. Phức giữa nó và các đường aspartam,
steviosid, glycyrrhizin và rubusosid loại bỏ được vị đắng thường gặp sau khi
uống. Một số phối hợp của nó với các flavonoid và terpenoid cung cấp cho con
người nhiều dạng thực phẩm có tác dụng kháng khuẩn và chống oxi hoá tốt.
CD cũng được dùng để phát hiện aflatoxin trong mẫu thực phẩm.

Võ Thị Kim Loan

21


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

1.1.7.3. Mỹ phẩm
Phức hợp của CD với chất làm thơm giúp mùi hương được kéo dài, người
ta đã ứng dụng đặc tính này cho nước hoa, bột giặt, nước thơm xịt phòng……
1.1.7.4. Trong công nghiệp môi trường
CD cũng đóng vai trị đáng kể trong công nghiệp môi trường. Nó giúp hoà
tan và di chuyển các tạp chất hữu cơ và kim loại nặng ra khỏi đất, nước, không
khí. Người ta đã sử dụng CD để loại các hợp chất nhân thơm như phenol, pcholorophenol và benzen ra khỏi nước thải, dùng trong lọc thông khí cho các
nhà máy hoá chất hữu cơ, làm tăng tính tan trong nước của các chất kháng nấm

như thiabendazol, carbendazol và fuberidazol, làm cho chúng dể hấp thu vào
đất.
1.1.7.5. Hóa học
Hiện nay CD và các dẫn xuất của nó được dùng để tách các hợp chất vòng
trong hóa phân tích, nó được dùng làm pha tĩnh tẩm vào chất mang hoặc làm
chất thêm vào pha động để chạy HPLC. Dùng làm tác nhân tách các đồng phân
quang học
1.1.7.6. Trong công nghiệp vi sinh.
Do khả năng nhũ hoá các cơ chất thân dầu, giảm tính độc của cơ chất
hoặc sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chuyển hoá CD được dùng cho một số quy
trình lên men và chuyển hóa sinh học. Sự có mặt của phức β-CD-steroid làm
chuyển hoá cholesteron thành ra androst-4-ene-3,7-diol đến 90%. Có vẻ như
việc thêm vào khoản 0,1% CD trong môi trường nuôi cấy giúp tăng sự vận
chuyển của cơ chất steroid qua màng tế bào vi khuẩn. Ngoài ra CD còn kích
thích quá trình lên men của nhóm kháng sinh lankacidin của Streptomyces
sp…, làm tăng hiệu suất tạo penicilin G từ phenylacetic acid và 6aminopencillanic acid khi penicillin acylase được gắn với β-menthyl-γ-CD
1.1.7.7. Cyclodextrin và kỹ thuật nano
Hiện nay cyclodextrin được biết đến là một chất host cơ bản có nhiều tính
năng cao trong hoá học host-guest. Trong lĩnh vực vật liệu mới tạo ra những
Võ Thị Kim Loan

22


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

hợp chất với kích thước nano. Cyclodextrin là những phân tử dạng ống có kích
thước nano. Với nhiều nghiên cứu hiện nay thì cyclodextrin được ứng dụng tạo

ra các vật liệu trong lĩnh vực máy tính. Việc sắp xếp và kết hợp cyclodextrin
với hợp chất khác tạo thành những sợi polyme ứng dụng tạo ra các vạt liệu bán
dẫn có giá thành rẻ hơn và độ bền cao.

Võ Thị Kim Loan

23


Khóa luận thạc sĩ sinh học

Tổng quan tài liệu

1.1.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Lịch sử nghiên cứu cố định enzym bắt đầu từ năm 1916, khi Nelson và
Griffin quan sát khả năng thủy phân đường saccharose của invertase nấm men
hấp thụ trên than hoạt tính. Enzyme cố định đầu tiên được ứng dụng trong quy
mô công nghiệp vào năm 1969 do Chibana và các cộng sự (aminoacylase được
cố định trên DEAE-sephadex nhờ liên kết ion để chuyển hóa hỗn hợp D,L-acid
amin thành L-acid amin). Nhất là chúng đã được áp dụng thành công trong quy
mô công nghiệp với sản lượng sản phẩm hàng năm rất cao. Một trong những
bằng chứng thuyết phục là sử dụng enzyme glucoisomerase cố định trong sản
xuất fuctose từ glucose, theo số liệu thống kê năm 1988 có khoảng trên 7 triệu
tấn fuctose siro/ năm được sản xuất ra thế giới nhờ công nghệ này.
Ở Việt Nam, những nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu trong vài
năm gần đây, kết quả thu được vẫn còn rất hạn chế. Năm 1994-1995 Viện Sinh
học nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu cố định enzyme
glucoisomersase trên các hạt silochrom B2 họat hóa bằng glutaraldehyde, sử
dụng chế phẩm glucoisomerase cố định của Novo để sản xuất fructose, tuy
nhiên mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm.

Võ Thị Kim Loan

24