TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA CHO HAI ENZYME ENDOGLUCANASE (EGI, EGII) CỦA Trichoderma reesei TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ HÒA

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA
CHO HAI ENZYME ENDOGLUCANASE (EGI, EGII)
CỦA Trichoderma reesei TRÊN HỆ THỐNG
NẤM MEN Pichia pastoris
Chuyênngành: Vi Sinh Vật Học
Mãsố: 60-42-40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUỐC BÌNH

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2012


Lời cảm ơn
―Đƣờng tuy gần không đi không bao giờ đến,
Việc tuy nhỏ không làm chẳng bao giờ nên.‖
Cảm ơn Ba Mẹ đã cho con cuộc sống, tình yêu và niềm tin để con luôn vững bƣớc
trên con đƣờng mà mình đã chọn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên
TP. HCM đã nhiệt tình dạy dỗ và thổi niềm nhiệt huyết đam mê cho sinh viên
chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
Tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quốc Bình đã dành nhiều thời gian
hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Cảm ơn ThS. Hồng Phƣớc Toàn đã luôn nhiệt tình động viên và giúp đỡ tôi thực
hiện đề tài này.

Đồng thời tôi cũng xin gởi lời cảm ơn tới anh Cƣờng, chị Thủy, chị Thuần, chị Hoa,
hai em Hiếu và Nga cũng nhƣ các bạn ở Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM,
cảm ơn các bạn Minh và Phong lớp 05CS đã luôn chia sẻ và giúp đỡ tôi.
Cảm ơn Ngƣời bạn đồng hành đã luôn động viên và chia sẻ với tôi trong suốt thời
gian qua.
Đặc biệt, Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Trung tâm CNSH TP. HCM đã
đồng ý cho triển khai và cấp kinh phí thực hiện nghiên cứu này.
Với tất cả tấm lòng, Tôi xin chân thành cảm ơn.

Trần Thị Hòa


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm các enzyme cellulase của T. reesei ...........................................10
Bảng 2.1. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu...........................................................28
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ......................................................................32
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nối DNA và plasmid pJET 1.2 ..............................33
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc.......................................................35
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI và NotI ...........................35
Bảng 2.6. Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5% ........................................43
Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc nấm men tái tổ hợp trên môi trường YPD chứa kháng
sinh G418 ..................................................................................................................63
Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng Pichia tái tổ hợp .........66

vii


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1 Nồng độ protein ngoại bào trong môi trường nuôi cấy P. pastoris theo
thời gian cảm ứng biểu hiện ......................................................................................67
Đồ thị 3.2 Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa đường khử glucose và độ
hấp thụ OD540nm .....................................................................................................70
Đồ thị 3.3 Hoạt tính endoglucanase của EGI, EGII theo thời gian .........................71

viii


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Thành phần và cấu trúc lignocelluloses của thực vật ................................3
Hình 1.2 Mô hình hoạt động của cellulase ................................................................5
Hình 1.3. Mô hình tác động của hệ enzyme cellulase trên cellulose ..........................6
Hình 1.4 T. reesei ........................................................................................................8
Hình 1.5 Cấu trúc vùng trung tâm xúc tác của EGI .................................................11
Hình 1.6 Mô hình cấu trúc CBD ở EGI của T. reesei ...............................................12
Hình 1.7 Mô hình cấu trúc 3D của enzyme EGI và EGII .........................................14
Hình 1.8 Cơ chế thủy phân của cellulase .................................................................16
Hình 1.9 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí AOX1 .........................................................18
Hình 1.10 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí his4 ..........................................................19
Hình 2.1 Thang chuẩn DNA ......................................................................................23
Hình 2.2 Thang chuẩn protein ..................................................................................24
Hình 2.3. Bản đồ plasmid tạo dòng pJET1.2 ............................................................25
Hình 2.4. Bản đồ plasmid biểu hiện pPIC9K ............................................................26
Hình 2.5. Sơ đồ mô tả quá trình OE-PCR của hai gen mã hóa EGI, EGII ..............31
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các exon của gen egl1

và egl2 .......................................................................................................................44
Hình 3.2. Kết quả điện di khuếch đại các DNA đầy đủ của egl1 và egl2 .................45
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch egl1 và egl2......................................45
Hình 3.4 Cấu trúc plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl1 ......................................48
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α
mang plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl2 với cặp mồi pJET-F/pJET-R ...........49
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra các dòng E. coli DH5α
mang plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl2 với các cặp mồi trong ......................50
Hình 3.7. Điện di phản ứng cắt plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl2 bằng
enzyme cắt EcoRI và NotI .........................................................................................50
Hình 3.8 Cấu trúc plasmid pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 ......................................58

v


Luận văn thạc sĩ

Hình 3.9. Kết quả điện di PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α mang
pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 với cặp mồi AOX1F/AOX1R ....................................59
Hình 3.10. Điện di sản phẩm cắt giới hạn các plasmid pPIC9K-egl1 và pPIC9Kegl2 bằng enzyme EcoRI/NotI và BspEI ...................................................................60
Hình 3.11. Kết quả biến nạp plasmid pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2

vào

P. pastoris .................................................................................................................62
Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của các plasmid
pPIC9K-egl1và pPIC9K-egl2 vào bộ gen P. pastoris GS115 ..................................64
Hình 3.13 Vòng phân giải CMC của các dòng P. pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với
thuốc đỏ Congo .........................................................................................................65
Hình 3.14 Điện di SDS-PAGE dịch ngoại bào P. pastoris biểu hiện EGI, EGII .....68

Hình 3.15. Điện di SDS-PAGE dịch ngoại bào của P. pastoris tái tổ hợp EGII theo
thời gian ....................................................................................................................69
Hình 3.16 Kết quả xác định hàm lượng protein EGI, EGII trong dịch nuôi cấy P.
pastoris tái tổ hợp tại thời điểm 96 giờ .....................................................................70

vi


Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC VIẾT TẮT
AOX:

Alcohol Oxidase

BSA:

Bovine Serum Albumin

BMGY :

Buffered Glycerol-complex

BMMY :

Buffered Methanol-complex

CBD:

Cellulose Binding Domain

CMC:

Carboxylmethyl Cellulose

DNS:

3,5-Dinitrosalicylic Acid

EC:

Enzyme Commission

EGI:

Enzyme Endoglucanase I

EGII:

Enzyme Endoglucanase II

Kb:

Kilobase

kDa:

Kilodalton

LB:

Luria Beteri

MD:

Minimal Dextrose

Mut:

Methanol Utilisation

NCBI:

National Center for Biotechnology Information

OE-PCR:

Overlap Extension PCR

PDB RCDB:

Protein Data Bank

PCR:

Polymerase Chain Reaction

PDB/PDA:

Potato Dextrose Broth / Potato Dextrose Agar

SDS-PAGE:

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TE buffer:

Tris- EDTA buffer

VTCC:

Vietnam Type Culture Collection

iv


Luận văn thạc sĩ

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nguồn nguyên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, vấn đề an ninh năng lƣợng
và biến đổi khí hậu… là những nguyên nhân chính khiến các nƣớc trên thế giới tìm
mọi cách phát triển các nguồn nguyên liệu thay thế, trong đó có nhiên liệu sinh học.
Chiến lƣợc phát triển bioethanol từ vật liệu hữu cơ đang đƣợc sự quan tâm nghiên
cứu của nhiều quốc gia. Tổng sản lƣợng bioethanol toàn thế giới ngày càng tăng
lên, năm 2010 đạt 86,9 tỷ lít, tăng 75% so với năm 2007 (thống kê của RFA,
2011)... Tuy nhiên, công nghệ sản xuất bioethanol hiện nay vẫn chủ yếu từ tinh bột
và đƣờng, dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao, đồng thời còn ảnh hƣởng đến vấn
đề an ninh lƣơng thực. Trong khi đó, lignocellulose từ rơm rạ, bã mía, vỏ bắp, lá
khô, mùn cƣa,… là những phụ phế phẩm nông-lâm nghiệp phổ biến, nếu nguồn
nguyên liệu này đƣợc tận dụng trong sản xuất bioethanol sẽ mang lại nguồn lợi lớn

về mặt kinh tế và góp phần giảm ô nhiễm môi trƣờng.
Điều kiện tiên quyết để sử dụng lignocellulose trong sản xuất ethanol là thu
nhận hiệu quả sản phẩm thủy phân glucose từ cellulose, thành phần chính của
lignocellulose. Tuy nhiên, nếu sử dụng enzyme để thủy phân cellulose thì chi phí
cho giai đoạn này chủ yếu ở khâu sản xuất enzyme cellulase. Do đó, nghiên cứu cải
thiện hoạt tính và phƣơng pháp thu nhận enzyme nhằm giảm chi phí sản xuất là điều
rất cần thiết.
T. reesei đƣợc đánh giá là một trong các sinh vật có khả năng tổng hợp
cellulase với hoạt tính cao [23]. Nhƣng hiện nay công nghệ sản xuất enzyme
cellulase ở nƣớc ta chủ yếu bằng phƣơng pháp nuôi cấy bán rắn nên hiệu quả không
cao và khó áp dụng ở quy mô công nghiệp. Ứng dụng những tiến bộ của kỹ thuật di
truyền vào sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp là một trong những hƣớng nghiên
cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lƣợng lớn.
Trên cơ sở đó đề tài: ―Tạo dòng và biểu hiện các gen mã hóa cho hai enzyme
endoglucanase (EGI, EGII) của Trichoderma reesei trên hệ thống nấm men Pichia
pastoris” đƣợc tiến hành với mục tiêu nghiên cứu khả năng biểu hiện hai gen egl1
1


Luận văn thạc sĩ

và egl2 của T. reesei trên hệ thống P. pastoris. Đây là hai enzyme endoglucanase
quan trọng trong hệ enzyme phân hủy cellulose của T. reesei. Kết quả của đề tài là
tiền đề cho các nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân hủy cellulose từ các
nguồn phụ phế phẩm nông-lâm nghiệp, từ đó, hƣớng tới việc sản xuất bioethanol.
Nội dung chính của đề tài bao gồm:
-

Thu nhận và tạo dòng các gen mã hóa cho enzyme endoglucanase I (egl1)
và endoglucanase II (egl2) từ nấm T. reesei

-

Chọn lọc các dòng nấm men P. pastoris mang nhiều bản sao của các gen
mã hóa egl1, egl2

-

Kiểm tra khả năng biểu hiện và hoạt tính hai enzyme EGI, EGII của các
dòng P. pastoris mang gen tái tổ hợp

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


Luận văn thạc sĩ

1

1.1

Tổng quan tài liệu

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Thành phần cellulose của thực vật
Cellulose là một homopolymer, cấu tạo từ các đơn phân -D-glucose (-1,4

glucose) hay còn gọi là D-anhydroglucopyranose (AGU) kích thƣớc có thể lên tới
trên 10.000 đơn vị -D-glucose. Là một polysacharide chiếm lƣợng rất lớn trong tự
nhiên, cellulose đƣợc tổng hợp chủ yếu ở thực vật, cùng với hemicellulose, lignin
và pectin cấu thành vách tế bào. Ngoài ra, ngƣời ta còn thấy chúng có nhiều ở tế
bào một số loài vi sinh vật nhƣng không có trong tế bào động vật. Ở thực vật, thành
phần cellulose thay đổi đa dạng , tùy thuộc vào các nguồn xác bã thực vật khác
nhau (rơm từ lúa gạo: 33%, rơm lúa mạch: 44%, rơm lúa miến: 31%, bã mía: 8085%...) [3].

Hình 1.1. Thành phần và cấu trúc lignocellulose của thực vật [46]
Vị trí C-1 OH tại mỗi đầu phân tử glucose là một nhóm aldehyde mang tính
khử và vị trí C-4 OH là đầu không có tính khử. Các polymer tạo thành cấu trúc vi
sợi kết tinh trong đó các chuỗi cellulose gắn kết với nhau nhờ liên kết hydro và có
3


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

tính tổ chức trật tự rất cao nên bền vững với tác động của điều kiện bên ngoài.
Ngoài ra vi sợi cellulose còn có vùng vô định hình với cấu trúc không chặt và dễ bị
tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Nhờ hai vùng này mà cellulose vừa có tính bền
vừa có tính linh động, trong đó enzyme cellulase dễ dàng tác động ở vùng vô định
hình, còn đối với vùng kết tinh cellulase hầu nhƣ chỉ có tác động bề mặt [4, 42].

1.2

Hệ enzyme phân hủy cellulose
Phân hủy cellulose là một quá trình phức tạp với sự tham gia của nhiều enzyme

ngoại bào, trong đó enzyme cellulase giữ vai trò chủ đạo. Hệ enzyme cellulase ngày
càng đƣợc phát hiện ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau nhƣ: thực vật, động vật, côn
trùng, nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn. Cellulase đƣợc tiết ra ở thực vật để loại bỏ lá và hoa
già yếu, trong quá trình chín trái cũng nhƣ trong quá trình biệt hóa của các mô mạch và
tăng trƣởng của vách tế bào thực vật. Trong đó cellulase tiết ra ở động vật và côn trùng
chủ yếu là do hệ vi sinh vật cộng sinh với chúng. Hệ enzyme cellulase đƣợc tìm thấy
phổ biến nhất là ở các nấm nhƣ: Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
Phanerochaete

và

vi

khuẩn:

Clostridium,

Cellulomonas,

Thermobifida

(Thermomonospora) và Streptomyces [4, 54].
Hệ enzyme cellulase trong tự nhiên đƣợc chia thành ba nhóm sau [4]:
-

Endoglucanase hay 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) phân
cắt liên kết -1,4-glucoside ở bất kỳ vị trí nào bên trong chuỗi cellulose tạo
ra nhiều oligosaccharide để exoglucanase tác động lên; Endoglucanase hoạt
động chính ở vùng vô định hình và tác động yếu ở vùng kết tinh.

-

Exoglucanase hay 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) phân cắt các
liên kết từ các đầu mút của chuỗi polysaccharide tạo các cellobiose;
Exoglucanase có thể tác động phân hủy cellulose ở vùng kết tinh.

-

-glucosidase hay -D-glucoside glucohydrolase hay cellobiase (EC 3.2.1.21)
phân cắt các cellobiose và các oligosaccharide hòa tan (DP < 6 – mức polymer
hóa) thành D-glucose (cellohexose).
Cấu trúc cellulase bao gồm ba domain giữ chức năng khác nhau (hình 1.2).

Thứ nhất là trung tâm hoạt động (catalytically active core) có dạng hình cầu lớn,
4


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

cấu trúc tự nhiên của trung tâm hoạt động quy định đặc tính xúc tác, độ chuyên biệt
cơ chất và sản phẩm tạo thành của enzyme. Thứ hai là domain gắn kết với cellulose
(cellulose binding domain - CBD), có vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân
vùng kết tinh của cellulose. Nếu thiếu CBD thì khả năng thủy phân vùng kết tinh
giảm đi đáng kể. Các enzyme endoglucanase và exoglucanase đều bao gồm hai
domain liên kết và CBD. Cuối cùng, domain liên kết (linker domain) là vùng đệm
dài nối CBD với trung tâm hoạt động, đồng thời tăng tính linh động của enzyme [4].

Trung tâm xúc tác

Cellulose

Hình 1.2 Mô hình hoạt động của cellulase [4]
Hệ enzyme cellulase đòi hỏi cả ba nhóm enzyme trên trong quá trình phân
hủy cellulose (hình 1.3). Hoạt tính chung khi các enzyme hoạt động hiệp lực cao
hơn hẳn so với hoạt động riêng lẻ của từng enzyme. Có ba dạng hiệp lực đƣợc đƣa
ra là: endo-exo, exo-exo và dạng nội phân tử. Trong dạng hiệp lực endo-exo, các
endoglucanase phân cắt ngẫu nhiên tạo thành các chuỗi ngắn hơn để exoglucanase
tiếp tục phân giải. Trong dạng exo-exo ở T. reesei, exoglucanase I tác động ở đầu
khử của chuỗi cellulose còn exoglucanase II tác động ở đầu không khử của

5


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

cellulose. Đối với dạng hiệp lực nội phân tử, khi domain hoạt động đƣợc gắn kết
với CBD thì có hoạt tính cao hơn hẳn khi chúng bị tách khỏi domain CBD [38].

Hình 1.3. Mô hình tác động của hệ enzyme cellulase trên cellulose [31]
Dạng cấu trúc tồn tại là đặc điểm khác biệt duy nhất giữa hệ enzyme cellulase
của nhóm vi sinh vật hiếu khí và nhóm vi sinh vật kỵ khí. Ở nhóm nấm sợi, xạ khuẩn
và một vài vi khuẩn hiếu khí thì các enzyme cellulase đƣợc tiết ra ngoại bào ở dạng
tự do trong khi hệ enzyme cellulase ở nhóm vi khuẩn kỵ khí tồn tại ở dạng phức hợp
đƣợc gọi là cellulosome gắn trên màng tế bào. Sự khác biệt giữa hai hệ cấu trúc
cellulase là do vi sinh vật kỵ khí bị giới hạn năng lƣợng so với vi sinh vật hiếu khí
nên chúng cần phải giữ lại sản phẩm thủy phân cellulose. Các vi sinh vật kỵ khí gắn

chặt với cellulose nhờ phức hệ cellulosome, sản phẩm phân giải sẽ đi vào vùng
không gian giới hạn giữa cellulose với vi sinh vật và đƣợc sử dụng trong các quá
trình biến dƣỡng khác. Trong khi đó ở hệ cellulase tự do, các sản phẩm phân giải có
thể đƣợc sử dụng bởi nhiều loài sinh vật khác nhau [54].

1.3 Ứng dụng của enzyme cellulase
Cellulase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dệt, giặt tẩy nhƣ làm sáng,
làm mềm vải và giảm độ thô của vải. Trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy,
6


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

cellulase giúp làm sáng giấy và loại bỏ mực in. Cellulase cũng đƣợc sử dụng trong
chế biến thức ăn gia súc để làm giảm độ nhớt cửa thức ăn có chứa beta-glucan của
lúa mì và lúa mạch. Bên cạnh đó, cellulase cũng đƣợc sử dụng nhiều trong công
nghiệp chế biến bia, rƣợu, nƣớc trái cây và sản xuất bánh kẹo cũng nhƣ đƣợc ứng
dụng trong tách chiết dầu oliu, carotenoid. Trong nông nghiệp các enzyme này còn
đƣợc dùng để kiểm soát dịch hại nhờ khả năng phân hủy vách tế bào nấm bệnh từ
đó ức chế sự phát triển của chúng. Ngoài ra cellulase còn đƣợc ứng dụng trong tạo
tế bào trần nấm hay thực vật. Nhờ khả năng gắn với cellulose mà CBD đƣợc sử
dụng nhƣ một thẻ ái lực trong tinh sạch protein tái tổ hợp. Đặc biệt nhờ khả năng
phân hủy cellulose thành đƣờng đơn nên các enzyme cellulase có tiềm năng ứng
dụng trong công nghệ sản xuất ethanol sinh học [24, 53].
Sản xuất ethanol từ cellulose mang lại nhiều lợi ích cho ngành nhiên liệu
sạch nhƣ: hạn chế lƣợng CO2 và N2O làm giảm mức ô nhiễm khí thải, giảm hiệu
ứng nhà kính và giảm lƣợng xăng dầu tiêu thụ đồng thời tận dụng đƣợc các phụ phế
phẩm có chứa cellulose trong nông-lâm nghiệp [53].

Hiện nay đã có nhiều nƣớc nghiên cứu sản xuất bioethanol nhƣ Brazil, Hoa
Kỳ, Khối liên minh Châu Âu, Canada, Thái Lan, Úc, Trung Quốc, Colombia, Ấn
Độ, Việt Nam,… Trên thế giới sản lƣợng bioethanol tăng lên hàng năm. Theo số
liệu thống kê của Hiệp hội Nhiên liệu tái sinh (RFA - Renewable Fuels Association)
từ năm 2007 đến 2010 sản lƣợng cồn sinh học thế giới liên tục tăng từ 49,6 tỷ lít lên
86,9 tỷ lít. Trong đó, Hoa Kỳ có sản lƣợng cao nhất và ở vị trí thứ hai là Brazil; năm
2010 hai nƣớc này đóng góp 50 và 26 tỷ lít bioethanol, chiếm 88% sản lƣợng
bioethanol thế giới (Thống kê của RFA, 2011).

1.4

Tổng quan về Trichoderma reesei

1.4.1 Vị trí phân loại
Giới:

Nấm (Fungi)

Ngành:

Nấm túi (Ascomycota)

Phân ngành:

Pezizomycotina

Lớp:

Sordariomycetes
7

Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

Bộ:

Hypocreales

Họ:

Hypocreaceae

Chi:

Trichoderma

Loài:

Trichoderma reesei

Hình 1.4 Trichoderma reesei
a: Nấm T. reesei sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA [6]; b: sợi nấm T. reesei

T. reesei (dạng teleomorph Hypocrea jecorina) thuộc ngành nấm túi
(Ascomycota). Nấm T. reesei đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme công
nghiệp nhƣ cellulase và hemicellulase nhằm phân hủy các polysaccharide của vách
tế bào thực vật. T. reesei đƣợc Reese và Mandel phát hiện trong thời kì chiến tranh
thế giới thứ hai [32]. Hiện nay bộ gen của T. reesei đã đƣợc giải mã với kích thƣớc

34Mbp và 9129 gen mã hóa [32]. Các thông tin từ bộ gen đƣợc giải mã của
T. reesei tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu chuyên sâu về loài nấm này.
1.4.2 Hệ enzyme cellulase của T. reesei
T. reesei là loài nấm sợi quan trọng trong sản xuất enzyme cellulase. Nhiều
nghiên cứu cho thấy đây là sinh vật có khả năng phân hủy cellulose mạnh do chúng
tạo đƣợc lƣợng lớn enzyme cellulase có hoạt tính xúc tác cao [23].
Theo Saloheimo (1997), hệ enzyme cellulase của T. reesei bao gồm 2
enzyme thuộc nhóm exoglucanase (CBHI và CBHII), 8 enzyme thuộc nhóm
endoglucanase (EGI, EGII, EGIII, EGIV, EGV, CEL5B và CEL61B) và 2 enzyme
nhóm -glucosidase (BGLI và BGLII). Trong đó exoglucanase chiếm 70-80%,
8


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

endoglucanase chiếm khoảng 20% và -glucosidase chiếm khoảng 1% thành phần
trong hệ enzyme cellulase (bảng 1.1) [48, 51]. Ba nhóm enzyme này tác động bổ trợ
lẫn nhau để chuyển hóa cellulose thành đƣờng một cách hiệu quả nhất. Ngoài ra T.
reesei còn có các protein không phải enzyme nhƣ swollenin (SWO) có tác dụng hỗ
trợ phân hủy cellulose thông qua tác động phá vỡ cấu trúc tinh thể, từ đó giúp các
enzyme cellulase dễ dàng hoạt động hơn trong quá trình phân hủy cellulose [51].
Nhƣ các sinh vật khác, các enzyme cellulase của T. reesei cũng đƣợc điều
hòa ở nhiều cấp độ khác nhau nhƣng hầu hết vẫn ở mức phiên mã. Theo Ilmen
(1997) và Foreman (2003), các gen mã hóa các enzyme cellulase khác nhau đƣợc
đồng điều hòa biểu hiện, nghĩa là ở tất cả các môi trƣờng chúng đều biểu hiện với tỉ
lệ tƣơng đối nhƣ nhau. Sự điều hòa biểu hiện cellulase theo nguồn carbon biến
dƣỡng - CCR (carbon catabolite regulation) có thể xảy ra ở nhiều mức độ nhƣ: tiếp
nhận chất cảm ứng, hình thành chất cảm ứng và ức chế trực tiếp cellulase hoặc sự

biểu hiện các yếu tố phiên mã. Cellulase đƣợc điều hòa dƣơng thông qua các yếu tố
hoạt hóa phiên mã XYR1 (xylanase regulator 1), ACE2 (activator of cellulases 2),
phức hợp HAP (heme activator protein) và đƣợc điều hòa âm thông qua các yếu tố
CRE1 (catabolite repressor) và ACE1 (activator of cellulases 1). Ngoài ra cellulase
còn đƣợc kiểm soát ở mức nhiễm sắc chất bởi protein methyltransferase LAE1 [51].
Enzyme cellulase đƣợc sự cảm ứng bởi cellulose hay LAE1 các nguồn carbon khác
nhƣ: sophorose, lactose, sorbitol, glycerol… trong đó sophorose có tính cảm ứng
biểu hiện cao nhất, còn glucose ức chế sự biểu hiện của hệ enzyme cellulase [23,
50].

9


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

Bảng 1.1. Đặc điểm các enzyme cellulase của T. reesei [5, 23, 49]
Nhóm enzyme

Tên enzyme a

Gen mã
hóa

Họ GH

Kích
thƣớc
(amino

acid)

Khối lƣợng
phân tử *
(kDa)

Điểm
Vị
Tỷ lệ trong
đẳng điện trí
cellulase
(PI)
CBD (%)

Tác giả

CBHI/Cel 7A

cbh1/cel7a

GH7

497

59-68

3.5—4.2

C

40–50

Reinikainen, 1994

CBHII/Cel 6A

cbh1/cel6

GH6

447

50-58

5.1—6.3

N

15–20

Reinikainen, 1994

EGI/Cel 7B

egl1/cel7b

GH7

437

50-55

4.0—6.0

C

5–10

Reinikainen, 1994

EGII/Cel 5A

egl2/cel5a

GH5

397

48

5.5

N

1–10

Reinikainen, 1994

EGIII/Cel 12A

egl3/cel12a GH12

218

25

7.5

-

<1

Reinikainen, 1994

EGIV/Cel 61A

egl4/cel61a GH61

344

55

e

C

e

Karlsson , 2001

EGV/Cel 45A

egl5/cel45a GH45

225

23

e

C

e

Reinikainen, 1994

Cel5B

cel5b

GH61

438b

e

e

-

e

Foreman, 2003

Cel61B

cel61b

GH5

249b

e

e

-

e

Foreman, 2003

CEL74A

cel74a

GH74

838

e

e

C

e

Foreman, 2003

BGLI/Cel3A

bgl1/cel3a

GH3

713

75

8.7

-

e

Reinikainen, 1994

bgl2/cel1a

GH1

700

114

4.8

-

e

Foreman, 2003
Viikari, 2001

Cellobiose hydrolase

Endo-β-1,4-glucanase

β-glucosidase

BGLII/Cel1A

*: kết quả theo điện di SDS-PAGE; CBD: cellulose binding domain; C: C-terminal; N: N-terminal; a: Tên các enzyme theo khóa phân loại GH của
Henrissat (1998); b: kích thƣớc protein bao gồm cả trình tự tín hiệu; e: chƣa đƣợc xác định, -: enzyme không có CBD.

10


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

1.4.3 Đặc điểm cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của enzyme
endoglucanase I (EGI) và endoglucanase II (EGII)
1.4.3.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng
EGI và EGII là hai enzyme quan trọng trong hệ thống phân hủy cellulose.
Mỗi loại enzyme chiếm khoảng 10% lƣợng cellulase tiết ra ở T. reesei. Đã có một
số nghiên cứu về đặc điểm cũng nhƣ hoạt tính các endoglucanase của T. reesei.
Suominen (1993) chứng minh rằng khi thiếu EGI thì hoạt tính endoglucanase trong
dịch nuôi cấy giảm khoảng 25% và sự vắng mặt EGII làm hoạt tính endoglucanase
giảm 55% [36, 52]. Từ đó, cho thấy hai enzyme EGI và EGII quyết định hầu hết
hoạt tính endoglucanase của T. reesei.
Cấu trúc của enzyme EGI và EGII đều bao gồm 3 domain chức năng: trung
tâm xúc tác, domain gắn kết với cellulose (CBD) và domain liên kết.
Trung tâm xúc tác (Catalytic Core)
Endoglucanase có tác động phân cắt ngẫu nhiên ở vùng vô định hình của
cellulose. Cấu trúc phân tử của các endoglucanase tƣơng tự với exoglucanase I và
exoglucanase II. Tuy nhiên, sự khác biệt chính là ở domain xúc tác. Endoglucanase
I có vùng xúc tác mở không giống với dạng đóng ở exoglucanase I. Nhờ có cấu trúc
mở mà sản phẩm thủy phân của endoglucanase đa dạng hơn bao gồm glucose,
cellobiose và cellotriose [38].

Hình 1.5 Cấu trúc vùng trung tâm xúc tác của EGI [22]
11


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

Domain gắn kết cellulose (Cellulose Binding Domain)
CBD đƣợc chia thành 3 họ. Họ CBDI đƣợc tìm thấy ở nấm nhƣ T. reesei và
họ CBDII và CBDIII tìm thấy ở vi khuẩn. CBD có độ bảo tồn khá cao giữa tất cả
các enzyme thuộc hệ cellulase đặc biệt là trong cùng một loài. Domain CBD có
chức năng gắn kết với cơ chất cellulose và duy trì nồng độ cơ chất cao để vùng
trung tâm xúc tác hoạt động hiệu quả hơn. Khi mất CBD thì hoạt tính enzyme giảm
mạnh và khả năng tiếp cận cơ chất giảm đi đáng kể [38].
Họ CBDI ở nấm T. reesei có kích thƣớc khoảng 35 amino acid có độ bảo tồn
khá cao giữa hai loại cellobiohydrolase và endoglucanase của T. reesei. Các amino
acid có nhiệm vụ gắn kết với cellulose là 3 acid amin nhóm thơm bao gồm 2
tyrosine và 1 tryptophan liên kết với 2 acid amin phân cực là proline, glutamine
hoặc asparagine. Các nhóm acid amin này nằm trên 2 phiến beta để các acid amin
nhóm thơm có thể gắn với các phân tử đƣờng phía đối diện, trong khi các acid amin
phân cực ở phía trên liên kết glycosyl và nhóm hydroxyl của chuỗi cellulose [38].
Sự hiện diện của các acid amin thơm trong liên kết bề mặt đặc trƣng cho tƣơng tác
carbohydrate – cơ chất [28].

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc CBD ở EGI của T. reesei [34]
Vùng liên kết (Linker Region)
Vùng liên kết này có nhiệm vụ nối trung tâm hoạt động và CBD và định
hƣớng không gian cho hai domain này. Với kích thƣớc 6–59 amino acid và đƣợc
glycosyl hóa để bảo vệ cấu trúc và tăng tính linh động, vùng liên kết cử động nhƣ
những ―lò xo‖ cho phép enzyme di chuyển trên bề mặt cellulose trong suốt quá trình
12


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

thủy phân. Mặc dù giữa các enzyme, độ tƣơng đồng của các vùng này khá thấp
nhƣng vùng liên kết đều giàu proline và các amino acid chứa nhóm hydroxyl [38].
Bằng những đột biến làm ngắn đi hoặc loại bỏ vùng liên kết đã làm giảm mạnh hoạt
tính của Cel7A. [44, 56].
 Endoglucanase I
Endoglucanase I (EGI/Cel7B) của T. reesei thuộc họ enzyme glycoside
hydrolase 7 (GH7). Trình tự gen mã hóa enzyme EGI của T. reesei VTT-D-80133
công bố trên ngân hàng gen (NCBI) với mã số M15665.1 [40] có kích thƣớc gen
1527bp với 3 exon và 2 intron và mRNA là 1380 nucleotide .
EGI của T. reesei có chiều dài 437 amino acid (aa) với trình tự tín hiệu dài 22
aa. EGI tƣơng đồng 45% so với trình tự gen của CBH-I và vùng bảo tồn cao nhất
70% đƣợc tìm thấy ở đầu C. Sự tƣơng đồng này có thể do hai enzyme này cùng tiến
hóa từ một tổ tiên chung. cDNA của gen mã hóa EGI (egl1) có chứa 62,5% G+C.
Cùng với enzyme CBH I (Cel7A), CBH II (Cel6A) và EGIII (Cel12A) thì
enzyme EGI (Cel7B) cũng đã đƣợc xác định cấu trúc bậc 3 [22]. EGI

có

trọng

lƣợng phân tử thực là 50-55kDa và điểm đẳng điện pI 4,5; pH hoạt động tối ƣu
trong khoảng 4,0 – 5,0.
Đặc điểm của enzyme Endoglucanase I của T. reesei (mã số P07981) trên cơ
sở dữ liệu protein UniProt nhƣ sau:
-

Tổng số amino acid là 459 với trật tự cấu trúc nhƣ sau, trình tự tín hiệu: 1-22,
trung tâm xúc tác: 23- 397, domain liên kết: 398-423 và CBD: 423-459

-

Trung tâm xúc tác: E149, E218, E223

-

Vị trí glycosyl hóa N78, N164, N204, N208, N394

-

Cầu nối disulfide: C431-C448 và C442-C458
a. Endoglucanase II
Endoglucanase II (EGII/CEL5A) của T. reesei thuộc họ enzyme glycoside

hydrolase 5 (GH5). Trình tự gen mã hóa EGII đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen

13


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

(NCBI) với mã số là DQ178347.1 với kích thƣớc gen 1849bp với 2 exon và 1
intron, kích thƣớc mRNA 1257 nucleotide [47].
Không giống EGI và CBHI có cấu trúc tƣơng đồng ở đầu C còn EGII và
CBHII lại tƣơng đồng 50-70% ở đầu N [47].
Cho đến nay, trình tự cấu trúc các domain chức năng và cấu trúc bậc 3 của
EGII cũng đã đƣợc xác định [26]. Trọng lƣợng phân tử thực: 48 kDa, điểm đẳng
điện – pI: 5,5; pH hoạt động tối ƣu 4,0 – 5,0 [30].

Đặc điểm của enzyme Endoglucanase II của T. reesei (mã số P07982) trên cơ
sở dữ liệu protein UniProt nhƣ sau:
-

Tổng số amino acid là 418 với trật tự cấu trúc nhƣ sau, trình tự tín hiệu: 1-21,
CBD: 22-57, domain liên kết: 58-91 và trung tâm xúc tác: 92-418

-

Trung tâm xúc tác: E239, E350

-

Vị trí glycosyl hóa: N124

-

Cầu nối disulfide: C29-C46 và C40-C56

EGII

EGI

Hình 1.7 Mô hình cấu trúc 3D của enzyme EGI và EGII
(Cơ sở dữ liệu Protein PDB)
1.4.3.2 Cơ chế hoạt động
Có hai cơ chế lập thể khác nhau trong sự thủy phân của cellulase: thủy phân
đảo cấu hình (inverting mechanism) và thủy phân duy trì cấu hình β (retaining
mechanism) của liên kết bị phân cắt (hình 1.8). Các enzyme sử dụng cơ chế duy trì
14

Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

cấu hình thƣờng có khả năng chuyển nhóm glycosyl (transglycosylation) trong khi
enzyme theo cơ chế đảo ngƣợc thì không [54]. Acid/base xúc tác thủy phân liên kết
glycosyl thƣờng là nhóm aspartate hoặc glutamate [35]. Hai carboxyl chuỗi cạnh
bên đều đóng vai trò quan trọng trong cả hai cơ chế. Trong cơ chế đảo ngƣợc, một
carboxyl chuỗi cạnh bên nhận proton hoạt động nhƣ acid xúc tác, một carbonyl cho
proton tới oxy của nhóm glycoside. Các carboxyl chuỗi cạnh bên khác hoạt động
nhƣ base, xúc tác loại một proton từ phân tử nƣớc để tiếp cận carbon C1, từ đó đảo
ngƣợc liên kết β thành liên kết α. Trong cơ chế duy trì cấu hình β, base ―carbonyl’’
xúc tác tiếp cận carbon C1 tạo thành liên kết cộng hóa trị với một glycoside đảo cấu
hình, trong khi các acid xúc tác cho proton tới oxy của nhóm glycoside. Ở bƣớc thứ
hai, một phân tử nƣớc tiến đến carbon C1 một lần nữa và đảo chiều liên kết nhằm
duy trì cấu hình ban đầu [54].
Bằng những phƣơng pháp biến đổi hóa học, đột biến điểm định hƣớng, so
sánh trình tự các họ protein và các nghiên cứu cấu trúc về carbonyl chuỗi bên của
các glycosyl hydrolase đã phát hiện trƣớc đó, McCarter và Withers (1994) nhận
thấy rằng đối với các enzym hoạt động theo cơ chế đảo chiều, khoảng cách giữa
các acid và base xúc tác tiềm năng khoảng 9,5 Å trong khi ở các enzyme hoạt động
theo cơ chế duy trì cấu hình, khoảng cách này là 5 Å [54].
Họ GH5 là họ cellulase lớn nhất bao gồm khoảng 57 enzyme đa số là các
enzyme của vi khuẩn và một số thuộc nấm. Trong đó, 52 enzyme là các
endoglucanase hoạt động theo cơ chế duy trì cấu hình và 5 enzyme khác là β 1–3
exoglucanase. Cấu trúc ba chiều của trung tâm xúc tác có dạng gấp cuộn ống α/β kiểu gấp cuộn phổ biến của các protein [54]. Endoglucanase II của T. reesei thuộc
họ GH5 nên có cơ chế hoạt động duy trì cấu hình của họ enzyme này.
Họ GH7 chỉ chứa endoglucanase và exoglucanase của nấm. Những enzyme

này hoạt động theo cơ chế duy trì cấu hình. Cấu trúc trung tâm hoạt động CBHI của
T. reesei có dạng sandwich β tạo vị trí hoạt động và các vòng nối với mạch β [33].
Cấu trúc vùng hoạt động lớn hơn cấu trúc thuộc họ 5 và 6 và có một vị trí xúc tác

15


Luận văn thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

dạng ống chứa đủ cả 7 gốc glucose. Endoglucanase I của T. reesei cũng có cấu trúc
và cách hoạt động tƣơng tự [22].

Cơ chế đảo cấu hình

Cơ chế duy trì cấu hình
Hình 1.8 Cơ chế thủy phân của cellulase [54]

16


Luận văn thạc sĩ

1.5

Tổng quan tài liệu

Hệ thống biểu hiện protein ở P. pastoris

1.5.1 Đặc điểm chung của P. pastoris
P. pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae, sinh vật eukaryote nên P. pastoris
có nhiều thuận lợi để biểu hiện protein của eukaryote. Đặc biệt, P. pastoris có khả
năng biến đổi protein sau dịch mã, có cơ chế gấp cuộn và tiết protein ra môi trƣờng
giúp quá trình tinh sạch dễ dàng trong khi các thao tác kỹ thuật cũng đơn giản nhƣ
E. coli hay Saccharomyces cerevisiae. Bên cạnh đó, P. pastoris có mức độ biểu
hiện protein mục tiêu cao và chi phí rẻ hơn so với các hệ thống biểu hiện trên tế bào
động vật hoặc baculovirus. Protein ngoại lai có thể đƣợc sản xuất với hàm lƣợng
cao hơn so với các chủng S. cerevisiae truyền thống. P. pastoris có thể tăng trƣởng
đạt đến mật độ cao nhờ một số yếu tố nhƣ alcohol oxidase I (AOX1) - một promoter
điều hòa mạnh của P. pastoris [7].
P. pastoris GS115 và KM71 đều là các chủng đột biến gen histidinol
dehydrogenase (his4) mất khả năng tổng hợp histidine nên các thể biến nạp có thể
đƣợc chọn lọc bằng môi trƣờng khuyết dƣỡng histidine [7].
1.5.2 Protein Alcohol Oxidase
P. pastoris có hai gen mã hóa cho alcohol oxidase là AOX1 và AOX2 trong
đó AOX1 chịu trách nhiệm trong hoạt tính alcohol oxidase của tế bào. Sự biểu hiện
gen AOX1 đƣợc điều hòa chặt chẽ bởi chất cảm ứng là methanol kể cả ở nồng độ
cao. AOX không biểu hiện trong môi trƣờng chứa glucose, glycerol và ethanol
nhƣng có thể biểu hiện tới 30% protein ngoại lai dƣới sự cảm ứng của methanol [7].
P. pastoris có khả năng sử dụng methanol nhƣ nguồn carbon. Bƣớc đầu của
quá trình biến dƣỡng methanol là quá trình oxy hóa methanol thành formaldehyde
bởi oxy. Ngoài formaldehyde, phản ứng còn tạo thành hydrogen peroxide. Quá trình
biến dƣỡng methanol xảy ra trong bào quan chuyên biệt là peroxisome để tránh tác
dụng gây độc của hydrogen peroxide. Đồng thời hydrogen peroxide còn đƣợc phân
hủy thành oxy và nƣớc nhờ enzyme catalase [15].

17