TỔNG HỢP DẪN XUẤT CHITOSAN VỚI ALDEHYDE THƠM, AMONIUM BẬC BỐN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÒNG BÍNH LONG

TỔNG HỢP DẪN XUẤT CHITOSAN VỚI
ALDEHYDE THƠM, AMONIUM BẬC BỐN VÀ
KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chuyên ngành : Hóa sinh
Mã số

: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGÔ ĐẠI NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh - 2010


LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên, em xin chân thành biết ơn sâu sắc đến thầy TS. Ngô Đại Nghiệp.
Thầy không chỉ tận tình hướng dẫn, chỉ dạy cho em những kiến thức và kinh
nghiệm quý báu, thầy còn luôn động viên, khích lệ để em cố gắng hoàn thành tốt
luận văn này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Sinh hóa: cô
Phạm Thị Ánh Hồng, cô Đồng Thị Thanh Thu, thầy Trần Mỹ Quan, thầy Văn
Đức Chín, cô Nguyễn Thị Huyên, cô Lâm Thị Kim Châu. Các thầy cô đã tận tình
dạy dỗ cho em trong suốt thời sinh viên cũng như giai đoạn em làm việc tại bộ môn.

Em cũng xin gửi lời cám ơn đến các anh chị, các đồng nghiệp trong bộ môn
Sinh hóa: cô Lê Phi Nga, chị Lương Bảo Uyên, anh Trần Quốc Tuấn, bạn
Nguyễn Phan Cẩm Tú, Võ Mai Trâm và các em Thạch Thành Trung, Nguyễn
Thanh Phong, Phạm Thị Mỹ Bình, Lê Quang Huy và Trần Văn Khuê. Mọi
người đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian em làm việc và làm thí
nghiệm ở bộ môn.
Em cũng xin chân thành cám ơn các anh chị và các bạn học viên cao học
K17 đã luôn giúp đỡ, động viên em. Anh cám ơn các em Pha, Uyên, Sáng, Hạnh,
Dịu.
Con cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Ba má. Ba má đã luôn
quan tâm, luôn ủng hộ cho con đường học vấn của con và là chỗ dựa tinh thần cho
con. Anh cảm ơn Na, em đã luôn bên cạnh anh, lo lắng, quan tâm và động viên cho
anh trong những lúc anh gặp khó khăn.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2010
VÒNG BÍNH LONG


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Mục lục
Danh mục các thuật ngữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình ảnh
Danh mục các đồ thị
Danh mục các sơ đồ
Danh mục các biểu đồ
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan chitin, chitosan ................................................................................... 1

1.1.1. Tổng quan chitin ........................................................................................ 1
1.1.2. Tổng quan chitosan .................................................................................... 3
1.1.2.1. Vài nét lịch sử nghiên cứu chitosan và dẫn xuất chitosan............... 3
1.1.2.2. Cấu tạo chitosan............................................................................... 4
1.1.2.3. Tính tan của chitosan ....................................................................... 7
1.2. Ứng dụng chitosan và dẫn xuất chitosan ............................................................. 8
1.2.1. Chitin và chitosan trong công nghiệp màng bao thực phẩm...................... 8
1.2.2. Ứng dụng chitosan trong công nghệ lọc và khử acid nước trái cây .......... 10
1.2.3. Ứng dụng chitosan để thu hồi protein và chất béo từ whey phomat ......... 10
1.2.4. Ứng dụng chitosan và chitin trong làm sạch nước .................................... 11
1.2.5. Ứng dụng hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất
trong công nghiệp chế biến thịt ................................................................. 13
1.2.6. Ứng dụng chitin và chitosan để cố định enzyme ....................................... 13
1.2.7. Tổng hợp chitin oligomer và chitosan oligomer ứng dụng
trong thực phẩm chức năng ...................................................................... 14


1.2.8. Ứng dụng trong mỹ phẩm và da nhân tạo.................................................. 16
1.2.9. Ứng dụng trong dẫn truyền và phóng thích thuốc ..................................... 17
1.3. Một số dẫn xuất của chitosan ............................................................................... 18
1.3.1. Dẫn xuất chitosan gắn đường..................................................................... 18
1.3.2. Dẫn xuất N-aryl chitosan ........................................................................... 20
1.3.3. Dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan .................................................. 21
1.3.4. Dẫn xuất carboxyalkyl của chitosan .......................................................... 23
1.4. Hoạt tính sinh học của chitosan và dẫn xuất chitosan.......................................... 25
1.4.1. Hoạt tính kháng vi khuẩn của chitosan và các dẫn xuất ............................ 25
1.4.2. Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất ................................... 28
1.4.3. Hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và dẫn xuất.................................... 29
1.4.3.1. Hoạt tính kháng oxy hóa.................................................................. 29
1.4.3.2. Chất oxy hóa và chất kháng oxy hóa ............................................... 30

1.5. Tổng quan các chủng vi sinh thử nghiệm ............................................................ 35
1.5.1. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm ................................................................ 35
1.5.1.1. Staphylococcus aureus MSSA......................................................... 35
1.5.1.2. Staphylococcus aureus MRSA ........................................................ 36
1.5.1.3. Escherichia coli ............................................................................... 37
1.5.1.4. Pseudomonas aeruginosa ................................................................ 38
1.5.1.5. Salmonella typhi .............................................................................. 40
1.5.2. Các chủng nấm bệnh thử nghiệm............................................................... 40
1.5.2.1. Sclerotium rolfsii ............................................................................. 40
1.5.2.2. Fusarium sp ..................................................................................... 41
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu và thiết bị ................................................................................................ 44
2.1.1. Vật liệu....................................................................................................... 44
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị..................................................................................... 45
2.2. Phương pháp......................................................................................................... 46
2.2.1. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR): xác định độ


deacetyl hóa của chitosan.......................................................................... 46
2.2.2. Phương pháp đo độ nhớt cấu trúc để xác định khối lượng
phân tử của chitosan .................................................................................. 48
2.2.3. Phương pháp phân tích phổ NMR xác định độ thay thế của
phản ứng tạo dẫn xuất chitosan ................................................................. 50
2.2.4. Phương pháp tạo dẫn xuất chitosan ........................................................... 53
2.2.4.1. Tạo dẫn xuất chitosan với các aldehyde thơm................................. 53
2.2.4.2. Tạo dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan.................................. 54
2.2.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ........................................................... 56
2.2.5.1. Phương pháp đục lỗ thạch ............................................................... 56
2.2.5.2. Phương pháp xác định MIC của các chất thử nghiệm..................... 57
2.2.6. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm .............................................................. 58

2.2.7. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa ........................................................ 59
2.2.7.1. Năng lực khử ................................................................................... 59
2.2.7.2. Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do ................................................ 61
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Xác định độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình của chitosan......... 63
3.1.1. Xác định độ deacetyl hóa của chitosan ...................................................... 63
3.1.2. Xác định trọng lượng phân tử trung bình của chitosan bằng
phương pháp đo độ nhớt............................................................................ 64
3.2. Tổng hợp các dẫn xuất chitosan........................................................................... 65
3.2.1. Hiệu suất thu nhận các dẫn xuất của chitosan ........................................... 65
3.2.2. Xác định độ thay thế và độ amonium bậc bốn hóa của
các dẫn xuất chitosan ................................................................................. 66
3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất trên các
chủng vi khuẩn thử nghiệm .................................................................................. 69
3.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất .................. 69
3.3.2. MIC của chitosan và các dẫn xuất trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm... 73
3.3.2.1. MIC của chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm .................. 73


3.3.2.2. MIC của N-Benzyl chitosan trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm....................................................................... 75
3.3.2.3. MIC của N-Metylbenzyl chitosan trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm....................................................................... 77
3.3.2.4. MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm....................................................................... 79
3.3.2.5. MIC của N-Benzyl chitosan-Quat trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm....................................................................... 81
3.3.2.6. MIC của N-Metylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm ....................................................................... 82
3.3.2.7. MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng

vi khuẩn thử nghiệm ....................................................................... 84
3.4. Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuât trên các chủng
nấm thử nghiệm................................................................................................... 87
3.4.1. Hoạt tính kháng nấm của chitosan ............................................................. 87
3.4.2. Hoạt tính kháng nấm của N-Benzyl chitosan ............................................ 89
3.4.3. Hoạt tính kháng nấm của N-Metylbenzyl chitosan ................................... 91
3.4.4. Hoạt tính kháng nấm của N-Hydroxylbenzyl chitosan.............................. 93
3.4.5. Hoạt tính kháng nấm của N- Benzyl chitosan-Quat .................................. 94
3.4.6. Hoạt tính kháng nấm của N- Metylbenzyl chitosan-Quat ......................... 96
3.4.7. Hoạt tính kháng nấm của N-Hydroxyl benzyl chitosan-Quat ................... 97
3.5. Hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất của chitosan .................. 102
3.5.1. Năng lực khử của chitosan và các dẫn xuất của chitosan .......................... 102
3.5.2. Khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của chitosan và
các dẫn xuất của chitosan ........................................................................... 105
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận ............................................................................................................... 108
4.1.1. Độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình của chitosan ................... 108
4.1.2. Kết quả tạo các dẫn xuất của chitosan .............................................................. 108


4.1.3. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất ....................................... 108
4.1.4. Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất .......................................... 109
4.1.5. Hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất .................................... 110
4.2. Đề nghị ............................................................................................................... 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
BC

: dẫn xuất N-Benzyl chitosan tổng hợp từ chitosan và
benzalhyde

MBC

: dẫn xuất N-Metylbenzyl chitosan tổng hợp từ chitosan và
metylbenzaldehyde

HBC

: dẫn xuất N-Hydroxylbenzyl chitosan tổng hợp từ chitosan và
hydroxylbenzaldehyde

BC-Quat

: dẫn xuất N-Benzyl chitosan-Quat tổng hợp từ N-Benzyl
chitosan và Quat-188

MBC-Quat

: dẫn xuất N-Metylbenzyl chitosan-Quat tổng hợp từ NMetylbenzyl chitosan và Quat-188

HBC-Quat

: dẫn xuất N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat tổng hợp từ NHydroxylbenzyl chitosan và Quat-188

Quat-188

: (3-cloro-2-hydroxyl) propyltrimetyl amonium chloride

NMP

: N-metyl-2-pyrrolidone

PGA

: Potato Glucose Agar

TSB

: Trypton Soya Bean

NA

: Nutrient Agar

IR

: Infrared spectroscopy

NMR

: Nuclear magnetic resonance

DD

: Degree of deacetylation

DP

: Degree of polymeration

ES

: Extent of substitution

DQ

: Degree of quaternization

N-aryl chitosan

: dẫn xuất chitosan gắn với aldehyde thơm

MIC

: Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế tối thiểu)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Mối tương quan giữa nồng độ chitosan và thời gian lưu trong phương
pháp đo độ nhớt bằng nhớt kế Ubelloge .................................................... 64
Bảng 3.2. Hiệu suất phản ứng thu nhận các dẫn xuất chitosan................................... 65
Bảng 3.3a: Độ thay thế (ES) của các dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm theo
công thức của Mrunal................................................................................ 67
Bảng 3.3b: Độ thay thế (ES) của các dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm theo
công thức của Warayuth........................................................................... 67
Bảng 3.3c: Độ amonium bậc bốn hóa (DQ) của các dẫn xuất amonium bậc bốn
chitosan ..................................................................................................... 68

Bảng 3.4. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm của chitosan và các
dẫn xuất chitosan......................................................................................... 70
Bảng 3.5: Nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan trên các chủng vi khuẩn thử
nghiệm........................................................................................................ 73
Bảng 3.6: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Benzyl chitosan trên các chủng vi
khuẩn thử nghiệm....................................................................................... 75
Bảng 3.7: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Metylbenzyl chitosan trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm.................................................................................... 77
Bảng 3.8: Nồng độ kìm hãm tối thiểu của N-Hydroxylbenzyl chitosan trên các
chủng vi khuẩn thử nghiệm........................................................................ 79
Bảng 3.9: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Benzyl chitosan-Quat trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm................................................................................... 81
Bảng 3.10: Nồng độ ứu chế tối thiểu của N-Metylbenzyl chitosan-Quat trên các
chủng vi khuẩn thử nghiệm....................................................................... 83
Bảng 3.11: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat trên
các chủng vi khuẩn thử nghiệm ............................................................... 84
Bảng 3.12: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của chitosan và các dẫn xuất chitosan
trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm ........................................................ 86


Bảng 3.13: Hiệu suất kháng nấm của chitosan ở các nồng độ khác nhau .................. 87
Bảng 3.14: Hiệu suất kháng nấm của N-Benzyl chitosan ở các nồng độ
khác nhau ................................................................................................. 89
Bảng 3.15: Hiệu suất kháng nấm của N-Metylbenzyl chitosan ở các nồng độ
khác nhau ................................................................................................. 91
Bảng 3.16: Hiệu suất kháng nấm của N-Hyroxylbenzyl chitosan ở các nồng độ
khác nhau ................................................................................................. 92
Bảng 3.17: Hiệu suất kháng nấm của N-Benzyl chitosan-Quat ở các nồng độ
khác nhau ................................................................................................. 94
Bảng 3.18: Hiệu suất kháng nấm của N-Metylbenzyl chitosan-Quat ở các

nồng độ khác nhau ................................................................................... 95
Bảng 3.19: Hiệu suất kháng nấm của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat ở các
nồng độ khác nhau ................................................................................... 97
Bảng 3.20: Năng lực khử của chitosan và các dẫn xuất ở các nồng độ khác nhau..... 102
Bảng 3.21: Kết quả kháng gốc hydroxyl tự do của chitosan và các dẫn xuất ở các
nồng độ khác nhau ................................................................................... 104
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin....................................................................... 1
Hình 1.2. Cấu tạo của α-chitin và β-chitin .................................................................. 2
Hình 1.3. Công thức cấu tạo chitosan ......................................................................... 4
Hình 1.4. Các nhóm chức hoạt động trên phân tử chitosan ........................................ 5
Hình 1.5: Công thức cấu tạo chitin và chitosan .......................................................... 5
Hình 1.6. Phân tử chitosan “kẹp” ion Niken............................................................... 12
Hình 1.7: Phản ứng tổng hợp dẫn xuất maltose-chitosan ........................................... 18
Hình 1.8. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất lactose-chitosan............................................. 20
Hình 1.9. Tổng hợp dẫn xuất N-aryl chitosan............................................................. 21
Hình 1.10. Phản ứng giữa chitosan và metyl iod tạo dẫn xuất trimetyl chitosan ....... 22


Hình 1.11. Phản ứng giữa chitosan và Quat 188 tạo dẫn xuất Chitsan-Quat 188....... 22
Hình 1.12. Phản ứng giữa chitin và DEAE-cloride tạo dẫn xuất TEAE-chitin .......... 23
Hình 1.13. Dẫn xuất N và O carboxylalkyl chitosan .................................................. 24
Hình 1.14. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-carboxymetyl chitosan ............................ 24
Hình 1.15. Công thức một số chất chống oxy hóa ...................................................... 33
Hình 1.16: Vi khuẩn Staphylococcus aureus MSSA .................................................. 35
Hình 1.17: Vi khuẩn Staphylococcus aureus MRSA.................................................. 36
Hình 1.18: Vi khuẩn Escherichia coli......................................................................... 37
Hình 1.19: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.......................................................... 39
Hình 1.20: Vi khuẩn Salmonella typhi........................................................................ 40
Hình 1.21: Nấm Sclerotium rolfsii .............................................................................. 40

Hình 1.22. Đặc điểm cấu tạo nấm Fusarium sp.......................................................... 43
Hình 2.1: Phổ IR của chitosan và các thông số để tính độ deacetyl hóa .................... 47
Hình 2.2. Phổ 1H NMR của N-benzyl chitosan trong dung dịch acid acetic 1%
dùng để xác định mức độ thay thế ............................................................. 51
Hình 2.3. Sơ đồ tổng hợp các N-aryl chitosan ............................................................ 53
Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan........................... 55
Hình 3.1: Khả năng kháng S. aureus MRSA của chitosan và các dẫn xuất
chitosan ....................................................................................................... 71
Hình 3.2. : Khả năng kháng E. coli của chitosan và các dẫn xuất chitosan................ 71
Hình 3.3: Kết quả MIC của chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm ................ 74
Hình 3.4: Kết quả MIC của N-Benzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn
thử nghiệm................................................................................................... 75
Hình 3.5: Kết quả MIC của N-Metyl benzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn
thử nghiệm................................................................................................... 78
Hình 3.6: Kết quả MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn
thử nghiệm................................................................................................... 79
Hình 3.7: Kết quả MIC của N-Benzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn
thử nghiệm................................................................................................... 81


Hình 3.8: Kết quả MIC của N-Metyl benzyl chitosan-Quat trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm................................................................................... 83
Hình 3.9: Kết quả MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng
vi khuẩn thử nghiệm.................................................................................... 85
Hình 3.10: Đường kính kháng nấm Fusarium sp của N Hydroxylbenzyl
chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau ................................................... 99
Hình 3.11: Đường kính kháng nấm Sclerotium rolfsii của N Hydroxylbenzyl
chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau ................................................... 99
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ và độ nhớt của chitosan............................ 46

Đồ thị 3.2: Năng lực khử của chitosan và các dẫn xuất của chitosan ......................... 103
Đồ thị 3.3: Hiệu suất kháng gốc hydroxyl tự do của chitosan và các dẫn xuất ở
các nồng độ khác nhau ............................................................................. 106
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Tóm tắt quy trình thí nghiệm ..................................................................... 62
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biều đồ 3.1: Kết quả MIC của chitosan và các dẫn xuất trên các chủng vi khuẩn
thử nghiệm ............................................................................................. 86
Biểu đồ 3.2: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ chitosan........... 88
Biểu đồ 3.3: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Benzyl
chitosan .................................................................................................. 90
Biểu đồ 3.4: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ
N-Metylbenzyl chitosan ......................................................................... 92


Biểu đồ 3.5: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ
N-Hydroxylbenzyl chitosan ................................................................... 94
Biểu đồ 3.6: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Benzyl
chitosan-Quat ......................................................................................... 95
Biểu đồ 3.7: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ
N-Metylbenzyl chitosan-Quat................................................................ 97
Biểu đồ 3.8: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Hydroxyl
benzyl chitosan-Quat.............................................................................. 98
Biểu đồ 3.9: Hiệu suất kháng nấm Fusarium sp của chitosan và các dẫn xuất ở
nồng độ 500 và 1000 µg/ml ................................................................... 100
Biểu đồ 3.10: Hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii của chitosan và các dẫn
xuất ở nồng độ 500 và 1000 µg/ml ....................................................... 101


MỞ ĐẦU

Chitin là một polymer sinh học có trong tự nhiên với trữ lượng rất lớn, chỉ
đứng sau cellulose. Chitin không chỉ có nhiều trong vỏ các loại tôm, cua, mai
mực…mà còn là thành phần chính của vách tế bào nhiều loại nấm. Các nguồn chitin
nếu không được xử lý đúng cách sẽ tạo ra nguồn chất thải lớn ra môi trường và gây
ô nhiễm. Do đó, nếu các nguồn chitin này được tận dụng một cách khoa học thì
không những tạo ra được những hợp chất mới có những hoạt tính ưu việt mà còn
tránh lãng phí và giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường.
Chitosan là một polymer sinh học được tạo ra từ phản ứng deacetyl hóa
chitin. Trên thế giới hiện nay ngày càng có nhiều những công trình nghiên cứu về
loại polymer sinh học này, do chitosan có những tính chất ưu việt mà không một
loại polymer nào khác có được. Chitosan không gây độc hại đến cơ thể con người,
có khả năng tương hợp với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học, có những hoạt
tính quý báu như hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bệnh, kháng oxy hóa. Ngoài ra,
các nhà khoa học đã tổng hợp nên những dẫn xuất mới có hoạt tính tốt hơn so với
chitosan, thậm chí các dẫn xuất này còn có những hoạt tính mới mà chitosan ban
đầu không có. Gần đây, chitosan và các dẫn xuất còn được phát hiện thêm nhiều đặc
tính ưu việt khác như khả năng dẫn truyền và giải phóng thuốc ứng dụng trong dược
phẩm, khả năng liên kết với DNA ứng dụng trong vector chuyển gen, ứng dụng
trong kỹ thuật mô.
Vì thế, hướng nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của chitosan đang thu
hút rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Trong khi đó, ở Việt Nam cũng đã bắt đầu
xuất hiện hướng nghiên cứu này nhằm tìm ra những dẫn xuất mới có những đặc tính
mới và ưu việt hơn, từ đó ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau. Các hoạt tính
thường được nghiên cứu là hoạt tính kháng vi khuẩn, kháng nấm và kháng oxy hóa,
để từ đó có thể ứng dụng vào trong lĩnh vực nông nghiệp, thực phẩm, thậm chí y
dược.


Vì vậy mục đích nghiên cứu của đề tài này là chúng tôi tạo các dẫn xuất của
chitosan với các aldehyde thơm, chitosan với Quat và khảo sát một số hoạt tính sinh

học của các dẫn xuất này. Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi thực hiện các nội
dung sau:
- Tổng hợp các dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm, tổng hợp dẫn xuất
chitosan với Quat.
- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất.
- Khảo sát hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất.
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất.


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
TÀI LI ỆU


-1-

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan chitin, chitosan
1.1.1. Tổng quan chitin
Chitin là một polymer sinh học có trữ lượng nhiều thứ hai trong tự nhiên, chỉ
sau cellulose [21], [54]. Cấu trúc hóa học của chitin gần tương tự như cấu trúc hóa học
của cellulose, do nhóm acetomido ở vị trí C-2 của đơn phân chitin thay thế cho nhóm
hydroxyl ở vị trí C-2 của đơn phân cellulose. Thuật ngữ “chitin” được bắt nguồn từ Hy
Lạp “chiton” có nghĩa là áo giáp ngoài và được sử dụng lần đầu tiên bởi Bradconnot
năm 1811. Chitin là polymer sinh học có các đơn phân là 2-acetamido-2-deoxy-β-Dglucose hay N-acetyl glucosamine (hình 1.1). Chitin là thành phần cấu trúc chính tạo
nên lớp vỏ ngoài của các loài động vật không xương sống cũng như vách tế bào nấm.
Ở các loài này, chitin đóng vai trò tương tự như vai trò của collagen ở các loài động vật
có xương, và cellulose ở các loài thực vật trên cạn. Chitin là một polymer sinh học có
tính chất ổn định về mặt hóa học, do bên trong và ở giữa phân tử chitin chỉ chứa các

liên kết hydro.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin
Mức độ deacetyl của chitin thông thường nhỏ hơn 10% và trọng lượng phân tử
của chitin khoảng 1,0 - 2,5 x 106 Da tương ứng với mức độ polymer khoảng 5000 –
10.000. Chitin còn có cấu trúc đa hình, tức là trong tự nhiên chitin tồn tại dưới nhiều
dạng khác nhau, trong đó chitin có 3 dạng chính. Dạng α-chitin là dạng phổ biến nhất
Luận văn Thạc sĩ

Tổng quan tài liệu


-2-

gồm những mạch đơn xếp chồng lên nhau, trong đó những mạch kề nhau được định
hướng ngược chiều nhau (hình 1.2). Không phổ biến bằng dạng α-chitin, dạng β-chitin
cũng có cấu trúc tương tự với những mạch đơn xếp song song nhau, nhưng theo cùng
một hướng, do đó làm cho liên kết giữa các mạch trong β-chitin yếu hơn so với αchitin. Dạng thứ ba là dạng γ-chitin, gồm hai chuỗi song song cùng hướng và một
chuỗi ngược hướng. Dạng γ-chitin cũng có thể coi là một dạng biến đổi của dạng αchitin và β-chitin [73].

α-chitin

β -chitin
Hình 1.2. Cấu tạo của α-chitin và β-chitin
Do quá trình phân hủy sinh học của chitin xảy ra rất chậm như ở các vỏ sò, vỏ
các loài giáp xác, nên đã tích lũy một lượng rất lớn các phế liệu này trong công nghiệp
chế biến thủy hải sản. Ở Mỹ, tổng lượng chất thải hằng năm thải ra ngoài môi trường
thì trong đó có 50% - 90% là từ phế liệu vỏ các loài giáp xác, thủy hải sản. Còn trên thế
giới, ước tính hàng năm lượng chất thải này lên đến 5,118 x 106 tấn các nguồn phế liệu
thủy hải sản. Trong nhiều loài giáp xác khác nhau, người ta chủ yếu sử dụng vỏ tôm và

cua để tách chiết thu lấy chitin, vì hàm lượng chitin trong nguồn này chiếm khá cao,
Luận văn Thạc sĩ

Tổng quan tài liệu


-3-

chiếm đến 69-70% trọng lượng khô của vỏ [46]. Dù ở các nước có nền công nghệ chế
biến thủy hải sản phát triển thì vấn đề xử lý các vỏ phế liệu thủy hải sản cũng là một
thách thức rất lớn. Do đó, một vấn đề được đặt ra là từ các vỏ phế liệu này, người ta có
thể sản xuất ra chitin, chitosan và các dẫn xuất có những đặc tính sinh học hữu ích, từ
đó ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong các lĩnh vực thực
phẩm và y dược.
1.1.2. Tổng quan chitosan
1.1.2.1. Vài nét lịch sử nghiên cứu chitosan và dẫn xuất chitosan
Năm 1811, giáo sư Henri Braconnot thuộc khoa Lịch sử Tự nhiên kiêm giám
đốc vườn thực vật Viện Hàn Lâm Khoa Học Nacy- Pháp đã tìm thấy chitin lần đầu tiên
ở nấm. Năm 1823, Galier đã phân lập được chitin từ côn trùng và gọi đó là “chitin”.
Năm 1959, giáo sư D. Rouget đã phát hiện ra chitosan, một dạng dẫn xuất
deacetyl của chitin. Từ đó đã có nhiều nghiên cứu cơ bản về chitin và chitosan nhưng
những hạn chế về mặt công nghệ và sự cạnh tranh của vật liệu polymer tổng hợp nên
đã cản trở sự phát triển của các hợp chất sinh học mới này [46].
Đến những năm 1970, nguồn phế thải hải sản như vỏ tôm, cua, mai mực ngày
càng nhiều. Để tránh tình trạng ô nhiễm môi trường cũng như để tận dụng nguồn phế
liệu dồi dào này, các nhà khoa học đã nghĩ đến việc tận dụng có hiệu quả nguồn
nguyên liệu hữu ích này. Chính vì vậy các nghiên cứu về chitin và chitosan ngày càng
nhiều hơn và sâu hơn [46].
Từ những năm thập niên 70 của thế kỉ XX, chitosan được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực quan trọng của đời sống con người như thực phẩm, dược phẩm,

bảo vệ môi trường, công nghệ sinh học… Một ví dụ điển hình là loại thuốc chữa thoái
hóa khớp làm từ vỏ tôm - glucosamine - đang được sử dụng thịnh hành và thương mại
hóa trên toàn thế giới. Nước Mỹ tiêu thụ hơn 1 tỷ viên nang glucosamine mỗi năm.
Người ta vẫn đang tích cực nghiên cứu để khám phá thêm nhiều ứng dụng hữu ích của

Luận văn Thạc sĩ

Tổng quan tài liệu


-4-

chitosan, đồng thời cải biến chitosan để nâng cao khả năng sử dụng, trong đó có nhiều
dẫn xuất mới có tiềm năng ứng dụng rất cao [46].
Ở Việt Nam, tác giả Trần Thị Luyến đã nghiên cứu thành công quy trình sản
xuất chitosan từ chitin, đồng thời cũng có một số nghiên cứu ứng dụng chitosan như
nghiên cứu ảnh hưởng của màng bao chitosan đến một số tính chất hóa lý của trứng gà
trong quá trình bảo quản. Ngoài ra, còn có một số các nghiên cứu tạo dẫn xuất chitosan
của tác giả Nguyễn Thị Huệ ứng dụng kháng khuẩn và xử lý nước thải.
Hướng nghiên cứu tạo dẫn xuất mới từ chitosan đang được thu hút rất nhiều nhà
nghiên cứu trên thế giới nhằm tạo ra những hợp chất mới có những hoạt tính sinh học
mới, tốt hơn và ưu việt hơn. Nhờ đó, chitosan và các dẫn xuất mới của chitosan phát
hiện ra các ứng dụng mới như dẫn truyền và giải phóng thuốc trong điều trị các tế bào
ung thư mục tiêu, chuyển gen, ứng dụng trong kỹ thuật mô…[14], [27], [93].
1.1.2.2. Cấu tạo chitosan
Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin hay chitosan là dạng có mức acetyl
hóa thấp của chitin. Đơn phân chủ yếu của chitosan là D-glucosamine hay 2-amino-2deoxy- β-D-glucose (hình 1.3). Chitosan có các mức độ deacetyl khác nhau, từ 40%
đến 98% và trọng lượng phân tử của chitosan trong khoảng 5 x 104 đến 2 x 106 Da.
Mức độ deacetyl và mức độ polymer là hai thông số quan trọng ảnh hưởng đến trọng
lượng phân tử của chitosan cũng như ảnh hưởng đến các tính chất hóa học, vật lý, sinh

học của chitosan. Ngoài ra trình tự nhóm amino và nhóm acetomido, và độ tinh sạch
của chitosan cũng ảnh hưởng đến các tính chất này của chitosan, từ đó cũng ảnh hưởng
đến khả năng ứng dụng của chitosan [45], [62], [73].

Hình 1.3. Công thức cấu tạo chitosan
Luận văn Thạc sĩ

Tổng quan tài liệu


-5-

Công thức cấu tạo của chitosan có 3 nhóm chức hóa học có chức năng hoạt
động biểu hiện hoạt tính sinh học: một nhóm amino ở vị trí carbon thứ 2, một nhóm
hydroxyl sơ cấp ở vị trí carbon thứ 3 và một nhóm hydroxyl thứ cấp ở vị trí carbon thứ
6 (hình 1.4). Các biến đổi hóa học ở các nhóm chức này đều có thể tạo ra các dẫn xuất
có những tính chất ưu việt được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau [73].

Hình 1.4. Các nhóm chức hoạt động trên phân tử chitosan

Chitin

Chitosan
Hình 1.5. Công thức cấu tạo chitin và chitosan

Luận văn Thạc sĩ

Tổng quan tài liệu

-6-

Mặc dù cấu trúc hóa học của chitin và chitosan gần tương tự nhau (hình 1.5),
tức là chỉ có nhóm acetomido của chitin được thay bằng nhóm amino ở chitosan,
nhưng tính chất vật lý và các phản ứng hóa học của hai loại polymer này lại rất khác
nhau. Cả hai phân tử polymer này đều có các nhóm phản ứng hóa học là hydroxyl và
amino nhưng chitosan lại thường ít kết tinh hơn so với chitin. Điều này cho thấy
chitosan có thể phản ứng với nhiều chất hóa học hơn chitin. Một điểm khác biệt rõ ràng
nhất giữa chitin và chitosan chính là đặc tính tan của hai polymer này. Trong khi chitin
chỉ có thể tan được trong một số dung môi như : dung dịch LiCl trong N-metyl-2pyrrolidone, dung dịch CaCl2 bão hòa trong metanol…, thì chitosan lại tan được trong
hầu hết các acid hữu cơ, phổ biến nhất là acid formic và acid acetic. Chitosan có các
đơn phân là D-glucosamine do đó trong môi trường acid yếu, rất nhiều vị trí trên chuỗi
chitosan có điện tích dương làm tăng tính phân cực, tăng lực đẩy tĩnh điện trong phân
tử chitosan, nhờ đó tính tan của chitosan cũng tăng lên. Ngoài ra một số muối của
chitosan cũng có khả năng tan trong nước như formate, acetate, lactate, malate, citrate,
tartarte, glyoxylate, pyruvate, glycolate, malonate và ascorbate [54].
Trong các biến đổi hóa học của chitosan, nhóm chức năng amino có thể xảy ra
các phản ứng hóa học như phản ứng acetyl hóa, phản ứng tạo base bậc bốn, phản ứng
với các aldehyde và cetone hình thành nên các base Schiff, phản ứng ghép, phản ứng
kẹp kim loại … từ đó tạo ra các hợp chất khác nhau có những đặc tính ưu việt hơn như
kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng virus, kháng acid, kháng ung bướu,
không độc, không dị ứng, hoàn toàn có tính tương hợp sinh học và tự hủy sinh học.
Còn ở vị trí nhóm hydroxyl cũng có thể xảy ra một vài phản ứng hóa học như phản ứng
o-acetyl hóa, liên kết hydro với nguyên tử phân cực, phản ứng ghép… Do chitin có khả
năng phản ứng và tính hòa tan kém, nên chitosan đã thu hút được nhiều nhà nghiên cứu
để tạo các dẫn xuất có cấu trúc được rõ ràng với những tính chất và chức năng tốt hơn
[54].

Luận văn Thạc sĩ

Tổng quan tài liệu


-7-

1.1.2.3. Tính tan của chitosan
Trong khi chitin không tan trong hầu hết các loại dung môi hữu cơ, chitosan có
thể tan được trong nhiều acid hữu cơ ở pH ≤ 6. Chitosan được coi như là một base
tương đối mạnh do trên mạch chitosan có chứa nhiều nhóm amino sơ cấp có giá trị pKa
là 6,3. Ở pH thấp các nhóm amino này có thêm một proton và mang điện tích dương.
Do đó khi hòa tan trong môi trường acid yếu, chitosan được coi là một chất đa điện
phân. Ngược lại khi pH ≥ 6, các nhóm amino bị mất đi proton, không còn mang điện
tích dương và trở nên không hòa tan. Sự thay đổi từ trạng thái tan sang trạng thái
không tan của chitosan xảy ra ở ngay giá trị pKa của chitosan, tức là khoảng giữa pH 6
đến 6,5. Tính hòa tan của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl hóa (DD) và phương
pháp sử dụng trong quá trình deacetyl hóa chitin [54].
Hằng số hòa tan Ka của nhóm amino được tính theo cân bằng phương trình sau:
-NH2 + H2O ↔ -NH3+ + OHKa = [-NH2].[H2O]/[NH3+] và pKa = -log Ka.
Đối với chất đa điện phân, hằng số phân ly không phải là một hằng số. Sự biến thiên
của pKa được tính theo công thức Kaschlsky sau:
pKa = pH + log [(1-α)/α] = pKo - ε∆Ψ(α)/kT
Trong đó: ∆Ψ là sự chênh lệch điện thế, α là độ phân ly, kT là hằng số Boltsman
và ε là điện tích electron.
Chitosan có thể dễ dàng hình thành dạng muối nitơ bậc bốn ở pH thấp, do đó
nhiều acid hữu cơ có thể hòa tan được chitosan. Dung môi tốt nhất hòa tan chitosan
được cho là acid formic nồng độ từ 0,2 đến 100%. Còn dung môi được sử dụng phổ
biến nhất dùng để hòa tan chitosan lại là acid acetic 1% ở pH khoảng 4, nhưng nếu sử
dụng acid acetic với nồng độ đậm đặc ở nhiệt độ cao có thể xảy ra sự phân hủy
chitosan. Chitosan cũng có thể tan trong acid hydrocloric 1% và acid nitric loãng
nhưng chitosan không tan trong acid sulfuric và acid phosphoric [54].

Luận văn Thạc sĩ

Tổng quan tài liệu


-8-

Lượng acid dùng để hòa tan còn phụ thuộc vào tính chất của chitosan. Nồng độ
proton cần thiết phải ít nhất bằng với nồng độ của –NH2 của chitosan. Có rất nhiều yếu
tố ảnh hưởng đến tính tan của chitosan như nhiệt độ, các yếu tố của quá trình deacetyl
hóa chitin tạo chitosan, kích thước phân tử chitosan... Mức độ deacetyl hóa và trọng
lượng phân tử là hai yếu tố quan trọng không chỉ ảnh hưởng đến tính tan của chitosan
mà còn ảnh hưởng đến nhiều tính chất khác của chitosan. Ngoài ra, sự phân bố nhóm
acetyl và nhóm amino trên chuỗi chitosan cũng ảnh hưởng đến tính tan và các tính chất
khác của chitosan [7], [54].
1.2. Ứng dụng chitosan và dẫn xuất chitosan
1.2.1. Chitin và chitosan trong công nghiệp màng thực phẩm
Những lợi ích của màng bảo quản thực phẩm dùng để bao các loại thực phẩm
tươi, thực phẩm đông lạnh và thực phẩm nhân tạo đã được biết nhiều năm trước. Màng
bao thực phẩm không chỉ làm tăng chất lượng sản phẩm mà còn thân thiện với môi
trường và có khả năng tự phân hủy sinh học một cách tự nhiên. Những lớp màng thực
phẩm này được sử dụng theo phương cách bổ sung, phụ trợ là chủ yếu, nhưng đôi khi
cũng là thành phần cần thiết để điều khiển các thay đổi lý sinh, hình thái và lý hóa của
thực phẩm. Hiện nay vật liệu dùng làm màng bao thực phẩm được sử dụng phổ biến
nhất là màng polyetylen. Tuy nhiên màng polyetylen có nhiều khuyết điểm như oxy sẽ
bị sử dụng hết dẫn đến quá trình lên men yếm khí, nhiệt độ bảo quản dao động lên
xuống làm cho nước bị ứ đọng và các yếu tố này thúc đẩy sự phát triển của nấm mốc,
từ đó làm hư hỏng thực phẩm. Có nhiều cơ chế liên quan đến quá trình bảo quản thực
phẩm bằng các màng bao. Trong đó có cơ chế kiểm soát trao đổi độ ẩm giữa thực phẩm

và môi trường bên ngoài, cơ chế kiểm soát giải phóng các tác nhân hóa học như các
chất kháng vi sinh, kháng oxy hóa, làm giảm một phần áp suất oxygen, từ đó làm giảm
tốc độ trao đổi chất, kiểm soát tốc độ hô hấp, kiểm soát các chất không thấm nước như
dầu, mỡ, kiểm soát nhiệt độ, củng cố cấu trúc của thực phẩm, tẩm lên các chất gia vị và
các chất thấm nở dưới dạng vi ống [21], [35], [73].
Luận văn Thạc sĩ

Tổng quan tài liệu


-9-

Chitin và chitosan do có đặc tính tạo màng mỏng nên đã được sử dụng thành
công trong công nghiệp bảo quản thực phẩm. Màng N,O-carboxymetyl chitin đã được
dùng để bảo quản trái cây trong một thời gian dài ở cả Canada và Mỹ. Bởi vì chitosan
có khả năng hình thành nên lớp màng bán thấm nên màng chitosan có thể làm thay đổi
áp suất bên trong cũng như làm giảm sự thoát hơi nước từ đó làm chậm quá trình chín
của trái cây.
Màng chitosan cũng có thể được tạo ra bằng cách thêm các tác nhân liên kết như
glutaraldehyde, kim loại hóa trị II, chất đa điện phân hoặc thậm chí là polysaccharide
âm. Tính chất của màng chitosan dai, có thể kéo dài, mềm dẻo và rất khó xé rách. Tất
cả các đặc tính này của chitosan được so sánh với nhiều loại polymer vừa và tốt trên thị
trường. Kittur và cộng sự nghiên cứu thấy màng chitosan làm giảm đi trị số thấm nước
và có thể làm tăng thời gian bảo quản thực phẩm tươi và cả các loại thực phẩm có
nhiều nước. Trong khi đó, kết quả nghiên cứu của Wong và Butler thấy rằng màng
chitosan là một hàng rào ngăn chặn sự trao đổi oxy và bằng cách liên kết với các chất
béo, tính kị nước sẽ tăng lên từ đó tạo nên màng phức hợp ngăn chặn sự thấm nước. Từ
đó, khả năng bảo quản thực phẩm được nâng cao.
Ngoài ra cũng có một số nghiên cứu sự ảnh hưởng của màng chitosan đến khả
năng lưu trữ và chất lượng của trái cây tươi. Màng chitosan đã được sử dụng để bảo

quản rất tốt đào và lê Nhật. Tương tự vậy rất nhiều loại trái cây tươi như dưa chuột,
tiêu, dâu và cà chua đã được bảo quản lâu hơn sau khi đã được bao lớp chitosan. Kết
quả bảo quản tốt như vậy là chủ yếu là do chitosan có khả năng làm giảm tốc độ hô
hấp, kìm hãm sự phát triển của nấm, làm chậm quá trình chín trái bởi khả năng khử
etylen và khí carbonic tăng.
Chitosan và màng chitosan có hoạt tính kháng vi sinh. Chitosan và màng mỏng
chitosan chứa các tác nhân kháng vi sinh vừa có khả năng gắn trên màng chitosan,
không bị thấm ra bề mặt trái cây, vừa có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn.
Các chất bảo quản trên màng chitosan làm giảm lực hút tĩnh điện bên trong phân tử
Luận văn Thạc sĩ

Tổng quan tài liệu