PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TRONG TRẤU ĐANG HOẠI MỤC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
CELLULOSE TRONG TRẤU ĐANG HOẠI MỤC

Cán bộ hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

PGs.Ts: NGUYỄN HỮU HIỆP

NGUYỄN THỊ DIỆU HIỀN

ThS. VÕ VĂN SONG TOÀN

Lớp: KH0566A1

Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học

Năm 2009


LỜI BẢN QUYỀN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi và hai thầy hướng
dẫn là thầy PGs. Ts. Nguyễn Hữu Hiệp và ThS. Võ Văn Song Toàn. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ luận văn

nào trước đây.

Cán bộ hướng dẫn

Tác giả luận văn

PGs. Ts. Nguyễn Hữu Hiệp

Nguyễn Thị Diệu Hiền

Cán bộ đồng hướng dẫn

ThS. Võ Văn Song Toàn


TRANG HỘI ĐỒNG KÝ TÊN

Luận văn đính kèm theo đây, với tên đề tài: “Phân lập một số dòng vi
khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong trấu đang hoại mục” do Nguyễn
Thị Diệu Hiền thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua.

Ủy viên

Phản biện

(ký tên)

(ký tên)

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2009

Chủ tịch hội đồng
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành luận văn Tốt Nghiệp Đại Học này, ngoài sự cố gắng của bản
thân tôi, còn có sự giúp đỡ, quan tâm rất nhiều của quý thầy cô, bạn bè và mọi
người. Xin kính gửi:
Lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Cha, Mẹ, người đã nuôi dưỡng, dạy bảo và cho
con đi học như ngày nay.
Lời cảm tạ chân thành đến thầy Nguyễn Hữu Hiệp và thầy Võ Văn Song Toàn
đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện và cung cấp những tài liệu thiết
thực và hữu ích cho tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài một cách thuận
lợi, để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này theo đúng thời gian đã qui định.
Lời biết ơn đến Ban Giám Đốc và quý thầy cô Viện NC & PT Công Nghệ Sinh
Học Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên
cứu trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Lời chân thành cảm ơn đến cán bộ phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, phòng Sinh
Hóa, phòng Công nghệ Enzyme và phòng Vi Sinh Thực Phẩm, đặc biệt là chị
Nguyễn Thị Phương Tâm và chị Nguyễn Thị Xuân Dung đã truyền đạt kinh nghiệm,
tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Lời chân thành biết ơn đến quý thầy cô tham gia giảng dạy lớp Công Nghệ
Sinh Học khóa 31 đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian
học tại trường.
Lời cảm ơn đến các bạn cùng lớp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, giúp tôi trong

suốt thời gian học Đại học vừa qua.

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2009
Sinh viên

Nguyễn Thị Diệu Hiền


TÓM LƯỢC
Chúng tôi đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn có trong đất và trấu đang
họai mục, trong đó có 14 dòng phát triển trong điều kiện hiếu khí và 14 dòng phát
triển trong điều kiện kỵ khí. Đa số các dòng phát triển nhanh trên môi trường có
agar, các dòng hiếu khí phát triển nhanh hơn các dòng kỵ khí sau 24 giờ. Trong số
28 dòng phân lập được thì có 18 dòng vi khuẩn có nguồn gốc từ đất (đất trấu) và
10 dòng vi khuẩn phân lập từ trong trấu đang hoại mục. Trong 14 dòng vi khuẩn
hiếu khí thì có 10 dòng có khả năng phân hủy cellulose khi kiểm tra bằng các phản
ứng sinh hóa. Có 2 dòng vi khuẩn kỵ khí không tạo vùng sáng trắng xung quanh
khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy khi thử nghiệm trên môi trường có bổ sung Congo
red.
Kết quả điện di 7 mẫu protein từ dịch trích enzim thô của 7 dòng vi khuẩn
hiếu khí có họat tính cellulase cho thấy có 4 band protein ở các 2H5, 8H2 và
10H1 trong khoảng trọng lượng từ 53,15KDa đến 64,89 KDa. Ngoài ra, còn có
nhiều band protein còn mờ ở các vị trí khác, do đó cần tiến hành nghiên cứu tiếp
qui trình trích ly và điện di trong thời gian tới.
Chúng tôi đã chọn ra được 5 dòng vi khuẩn (2H5, 4H6, 8H2, 10H1 và
10H2) có họat tính cellulase mạnh hơn trong 14 dòng vi khuẩn hiếu khí. Trong đó,
dòng 10H1(có nguồn gốc từ trong đất) là dòng có hoạt tính cellulase mạnh nhất
(0,35U) có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm enzyme, góp phần vào sử
lý rác thải nông nghiệp đặc biệt là trấu, giải quyết tình trạng ô nhiễm môi trường.
Từ khóa: Trấu, vi khuẩn phân hủy cellulose, vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ

khí, hoạt tính cellulase.


MỤC LỤC
LỜI BẢN QUYỀN
TRANG HỘI ĐỒNG KÝ TÊN
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC
BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỤC LỤC
Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................1
Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................................2
I. Tổng quan về trấu và enzim cellulase ............................................................2
1. Tổng quan về trấu ....................................................................................2
2. Giới thiệu về cellulose và enzim cellulase ................................................2
3. Cơ chế quá trình phân hủy cellulose.........................................................3
a. Cơ chế của quá trình oxy hóa cellulose (phân hủy hiếu khí) ..................3
b. Cơ chế của quá trình phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí.............4
4. Vi sinh vật phân hủy cellulose..................................................................4
a. Các vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện hiếu khí ...................4
b. Những vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí .................4
5. Sơ lược một số phương pháp sinh hóa......................................................5
a. Định lượng hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) ......5
b. Định lượng đường khử bằng phương pháp Nelson (1994) .....................5
c. Phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE..............................................6
II. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới ..........................................6
1. Tình hình nghiên cứu trong nước .............................................................6
2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...........................................................6

Phần III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................8


I. Phương tiện thí nghiệm .................................................................................8
1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm..............................................8
2. Phương tiện thí nghiệm ............................................................................8
a. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ..................................................................8
b. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................9
c. Hóa chất ................................................................................................9
II. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................9
1. Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn. ........................................................... 10
a. Phân lập vi khuẩn ................................................................................10
b. Nhuộm Gram vi khuẩn .......................................................................13
c. Quan sát mô tả hình dạng và khả năng chuyển động
của vi khuẩn........................................................................................ 14
2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự thủy phân của vi khuẩn hiếu khí
bằng đường kính thuỷ phân ...................................................................15
a. Khảo sát sự thủy phân cellulose của vi khuẩn
trên môi trường có Congo red .............................................................. 15
b. Đếm mật số tế bào vi khuẩn ................................................................ 16
3. Thí nghiệm 3: Khảo sát hàm lượng protein trong dịch nuôi vi khuẩn
bằng phương pháp Bradford (1976) ......................................................16
4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính enzim cellulase bằng phương pháp
Nelson (1994). ....................................................................................... 19
5. Thí nghiệm 5: Khảo sát trọng lượng phân tử protein trong dịch nuôi vi
khuẩn bằng phương pháp điện di SDS – PAGE......................................21
Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 23
I. Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn .................................................................23
1. Phân lập vi khuẩn...................................................................................23
2. Nhuộm Gram vi khuẩn...........................................................................24

3. Mô tả vi khuẩn, khuẩn lạc ......................................................................25
II. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự thủy của vi khuẩn hiếu khí


bằng đường kính thuỷ phân .........................................................................28
III. Thí nghiệm 3: Khảo sát hàm lượng protein trong dịch nuôi vi khuẩn bằng
phương pháp Bradford (1976) .....................................................................32
IV. Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính cellulase
bằng phương pháp Nelson (1994) ............................................................... 34
V. Thí nghiệm 5: Khảo sát trọng lượng phân tử protein
trong dịch nuôi vi khuẩn bằng phương pháp điện di SDS-PAGE ................37
Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................39
I.

Kết luận.......................................................................................................39

II.

Đề nghị .......................................................................................................39

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................40
PHỤ LỤC 1: HÓA CHẨT THÍ NGHIỆM..............................................................i
PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU THỐNG KÊ ....................................................................ii


BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT

APS: Amonium persulphat .
BSA: Bovine serum albumin.
CBB: Coomassie Brilliant Blue G250 .

Cellulase C1 : có hoạt tính exocellulase , cắt thể cellulose thành dạng bông.
Cellulase Cx : có hoạt tính endocellulase và exocellulase , thủy phân bên trong
các cellulose thành cellobiose
CFU: Colony forming unit.
CMC: Carboxymethyl-cellulose.
CMCase : Enzyme carboxymethyl cellulase.
CNT: carbon nanotubes.
DS: Degree of substitution
HL protein: Hàm lượng protein.
KDa: Kilodalton.
Na-CMC : Sodium carboxymethyl cellulose.
OD: Optical density.
PI: Isoelectric points.
Rpm: Revolutions per minute .
SDS: Sodium dodecyl sulfat.
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.
TEMED: Tetramehtylethyenediamine.


DANH MỤC BẢNG
Bảng số

Tựa bảng

Trang

Bảng 1

Thành phần môi trường CMC phân lập vi khuẩn ............................. 9

Bảng 2

Thành phần môi trường CMC trích ly enzyme cellulase .................. 9

Bảng 3

Bảng tóm tắt quá trình nhuộm Gram............................................. 14

Bảng 4

Nguồn gốc mẫu ............................................................................. 23

Bảng 5

Kết quả nhuộm Gram 14 dòng vi khuẩn hiếu khí ........................... 25

Bảng 6

Kết quả nhuộm Gram 14 dòng vi khuẩn kỵ khí.............................. 25

Bảng 7

Mô tả hình dạng khuẩn lạc............................................................. 26

Bảng 8

Kết quả đo đường kính vòng thuỷ phân vi khuẩn hiếu khí ............. 29

Bảng 9

Đường kính thuỷ phân sau 4 ngày ủ của vi khuẩn hiếu khí ............ 29

Bảng 10

Kết quả đo đường kính vòng thuỷ phân vi khuẩn kỵ khí ................ 30

Bảng 11

Đường kính thuỷ phân sau 4 ngày ủ của vi khuẩn kỵ khí ............... 30

Bảng 12

Kết quả đo OD ở 595nm các mẫu protein chuẩn ............................ 32

Bảng 13

Kết quả đo OD ở 595nm các mẫu protein ..................................... 33

Bảng 14

Kết quả thống kê số hàm lượng protein
của các dòng vi khuẩn hiếu khí ...................................................... 33

Bảng 15

Kết quả đo mật số vi khuẩn............................................................ 33

Bảng 16

Kết quả đo OD ở bước sóng 520nm đường chuẩn glucose............. 35

Bảng 17

Hàm lượng đường khử trong dịch nuôi vi khuẩn
hiếu khí sau 4 ngày ...................................................................... 36

Bảng 18

Hoạt tính cellulase của dịch nuôi vi khuẩn sau 4 ngày ................... 36

Bảng 19

Số liệu vẽ đường biểu diễn log của protein chuẩn .......................... 37

Bảng 20

Trọng lượng phân tử protein trong dịch trích enzim của vi
khuẩn hiếu khí .............................................................................. 38


Bảng 1

Thống kê đường kính thuỷ phân sau 4 ngày ủ của 14 dòng vi
khuẩn hiếu khí ................................................................................. ii

Bảng 2

Thống kê đường kính thuỷ phân sau 4 ngày ủ của 14 dòng vi
khuẩn kỵ khí ...................................................................................iii

Bảng 3

Kết quả phân tích thống kê hàm lượng protein trong dịch trích
enzim ............................................................................................. iv

Bảng 4

Kết quả phân tích thống kê hàm lượng đường khử ......................... iv


DANH MỤC HÌNH

Hình số

Tựa hình

Trang

Hình 1

Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu ............................................. 8

Hình 2

Hình thu mẫu trấu và đất................................................................ 10

Hình 3

Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn.................................................. 10

Hình 4

Cách pha loãng mẫu ...................................................................... 11

Hình 5

Cấy cấy vi khuẩn trên đĩa petri ...................................................... 12

Hình 6

Quy trình nhuộm Gram vi khuẩn ................................................... 13

Hình 7

Sơ đồ trích dịch nuôi vi khuẩn cho các phản ứng sinh hóa ............ 17

Hình 8:

Sơ đồ phân tích protein bằng phương pháp điện di SDS-PAGE ..... 21

Hình 9

Nhuộm Gram vi khuẩn .................................................................. 24

Hình 10

Một số hình ảnh khuẩn lạc của vi khuẩn hiếu khí........................... 27

Hình 11

Một số hình ảnh khuẩn lạc của vi khuẩn kỵ khí.............................. 27

Hình 12

Đường kính thuỷ phân của các dòng vi khuẩn hiếu khí ................ 31

Hình 13

Đường kính thuỷ phân của các dòng vi khuẩn kỵ khí ................... 31

Hình 14

Biểu đồ đường chuẩn BSA ............................................................ 32

Hình 15

Kết quả đo nồng độ protein............................................................ 34

Hình 16

Biểu đồ đường chuẩn glucose ........................................................ 35

Hình 17

Kết quả đo nồng độ glucose .......................................................... 36

Hình 18

Đồ thị đường logM của protein chuẩn............................................ 37

Hình 19

Kết quả điện di SDS-PAGE ........................................................... 38


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

PHẦN I
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ lâu cùng với quá trình phát triển của công nghiệp trên thế giới thì công
nghệ sinh học đã được ra đời, phát triển và đóng một vai trò quan trọng trong nền
kinh tế thế giới. Theo số liệu thống kê của BIO's Guide to Biotechnology năm
1999 cho thấy giá trị sản lượng của một số sản phẩm Công nghệ Sinh học trên thị
trường thế giới năm 1998 đạt 40 - 65 tỷ USD, năm 1999 đạt 65 tỷ USD; dự báo
2001 đạt 215 tỷ và năm 2010 đạt 1000 tỷ USD. Trong đó công nghệ vi sinh và
công nghệ enzim là những thế mạnh của ngành công nghệ sinh học, bởi nó đem
lại lợi nhuận hàng năm không nhỏ cho ngành công nghệ sinh học nói riêng và
cho nền kinh tế thế giới nói chung.
Ngày nay, khi khoa học phát triển như vũ bão thì nguồn sản xuất enzim
không dừng lại ở đối tượng nghiên cứu là động vật và thực vật, mà vi sinh vật
ngày càng đóng vai trò rất quan trọng, nó quyết định qui mô sản xuất enzim công
nghiệp trên toàn thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Nhiều nghiên cứu
cho thấy rằng tốc độ tạo sinh khối của vi sinh vật cao gấp hàng ngàn lần so với
tốc độ tăng sinh khối của động vật và thực vật. Số liệu thống kê cho thấy rằng
trong 24 giờ vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một lượng thức ăn gấp 30 - 40
lần so với trọng lượng cơ thể của chúng. Để làm được điều này vi sinh vật phải
tổng hợp được lượng enzim rất lớn và với tốc độ nhanh.
Mặt dù so với các enzim protease và amylase, enzim cellulase được

nghiên cứu muộn hơn. Tuy nhiên enzim cellulase lại đóng một vai trò hết sức
quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong tự nhiên góp
phần vào sự phát triển trong công nghệ thực phẩm và bảo vệ môi trường.
Việt Nam vốn là một nước nông nghiệp đang phát triển với hơn 70%
người dân sống bằng nghề trồng trọt. Ước tính mỗi năm, các nhà máy xay xát ở
khu vực đồng bằng sông Cửu Long thải ra sông rạch khoảng 3,7 triệu tấn trấu
làm ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. (www.ecsme.com.vn)
Chính vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập vi khuẩn
có khả năng phân hủy cellulose trong trấu đang hoai mục”.
SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

1

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

PHẦN II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
I.

TỔNG QUAN VỀ TRẤU VÀ ENZIM CELLULASE
1. Tổng quan về trấu
Là một trong những nước xuất khẩu gạo đứng hàng đầu trên thế giới, vì

vậy hàng năm Việt Nam phải đối mặt với việc xử lý một lượng phế thải trấu
khổng lồ do không đủ mặt bằng kho chứa và thiếu đầu ra...)

(www.vnexpress.net). Riêng ở Đồng bằng sông Cửu Long, các nhà máy xay xát
đã thải ra sông rạch khoảng 3,7 triệu tấn trấu, gây ô nhiễm môi trường nghiêm
trọng.
Trong trấu có chứa 32% cellulose. ( Chu Thị Thơm, 2006)
“Thị trấn Biomass” là một mô hình xử lý các phế phẩm trong sản xuất
nông nghiệp như rơm, rạ, trấu… nhằm sản xuất Bio-ethanol (cồn nguyên liệu),
tiết kiệm năng lượng, bảo vệ môi trường và xây dựng một nền nông nghiệp phát
triển bền vững. (Hương Cát, www.sinhhocvietnam.com)
2.

Giới thiệu về cellulose và enzim cellulase
Cellulose (tiếng Việt phiên âm và viết xenlulo, xenlulozơ, xenluloza hoặc

xenlulô) là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích β-DGlucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có
thể nằm trong khoảng 5.000 – 14.000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế
bào thực vật. Là chất màu trắng, không mùi, không vị. Cellulose không tan trong
nước và các dung môi hữu cơ thông thường nhưng tan trong một số dung dịch
axit vô cơ mạnh như: HCl, HNO3,... một số dung dịch muối: ZnCl2, PbCl2,...
( vi.wikipedia.org). Hàm lượng cellulose trong các chất khác nhau rất khác nhau,
trong giấy là 61%, trong trấu là 31%. (Chu Thị Thơm, 2006)
Enzim cellulase của vi sinh vật bao gồm 3 loại enzim khác nhau:
- Enzim thứ nhất là 1,4  -D-glucan cellobiohydrolase (tên khoa học khác
như: cellobiohydrolase, enzim C1, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và
avicellase). Enzym này cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành
cellobiose. Trọng lượng phân tử của enzim này là từ 53 - 75 KDa. Enzim này

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

2

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất
hóa lý của chúng.
- Enzim thứ hai là 1,4  -D-glucan - 4 - glucanohydrolase (tên gọi khác:
endoglucanse, endo 1,4  -glucanse, C-cellulase, enzim Cx) chứa 418 acid
amine, có trọng lượng phân tử từ 42 – 49 KDa. Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá
cao và tham gia phân giải liên kết  -1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin
và  -D-glucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và
glucose.
- Enzim thứ ba là  -D glucoside glucohydrolase (tên khác là cellobiase
và  -glucosidase) có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4 – 4,8), trọng
lượng phân tử khoảng 50 – 98 KDa, PI = 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.
Chúng tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose, không có khả năng phân
hủy cellulose nguyên thủy. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Sơ đồ phân hủy cellulose trong tự nhiên:
Cellulose
tự nhiên

C1

β- glucosidase

Cx
Cellulose

vô định hình

Cellobiose

Glucose

Hoạt tính mạnh nhất của cellulase là rơm rạ cây ngũ cốc và trấu với tỉ lệ
1:1 (tỉ lệ trong nước là 1:2). Nhiệt độ tthích hợp cho enzim cellulase hoạt động là
28oC, pH là 5,5, và thời gian tồn tại cho hoạt tính mạnh nhất đó là 72 giờ.
(Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2007).
3.

Cơ chế của quá trình phân hủy cellulose
a. Cơ chế của quá trình oxy hóa cellulose (phân hủy hiếu khí)
Quá trình oxy hóa xảy ra bắt đầu bằng sự thủy phân sau đó chuyển hóa

thành CO2 và H2O.
Cơ chế của quá trình oxy hóa cellulose có thể qua hai giai đoạn:
-

Giai đoạn thứ nhất: là sự thủy phân cellulose thành cellulobiose dưới

tác dụng của enzim cellulase. Ngoài ra còn tạo thành một lượng đường glucose.

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

3

MSSV: 3052824

Luận văn tốt nghiệp- 2009
-

Công nghệ sinh hoc K31

Giai đoạn thứ hai: là giai đọan oxy hóa những đường đơn giản. Quá

trình này có qua nhiều sản phẩm trung gian loại oxi axit và cuối cùng tạo thành
CO2 và H2O (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
b. Cơ chế của quá trình phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí
Quá trình phân hủy kỵ khí khi các chất cellulose được tiến hành qua hai
giai đoạn. Giai đoạn biến cellulose thành glucose và sau đó biến glucose theo
kiểu lên men butyric. Có hai dạng lên men là lên men dạng hydro và lên men
dạng methan.
Theo như Omelanskin thì lên men kiểu methan sản phẩm khi tạo ra bằng
nửa trọng lượng cellulose còn theo kiểu hydro thì khi tạo ra bằng 1/3.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
4.

Vi sinh vật phân hủy cellulose

a. Các vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện hiếu khí
Trong điều kiện hiếu khí các vi sinh vật tham gia vào việc thủy phân
cellullose gồm các niêm vi khuẩn, một số đại diện của các vi khuẩn không sinh
bào tử và sinh bào tử, xạ khuẩn và nấm. Trong số này thì các loài niêm vi khuẩn
là quan trọng hơn cả.
Theo Nguyễn Lân Dũng (1976) thì tế bào của niêm vi khuẩn có hình que
nhỏ bé (0,3 – 0,4 x 0,7 - 10 µm) hơi uốn cong, thường có đầu nhọn, có thành tế
bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuẩn khác

Sporocytophaga là khuẩn hình que, đầu tròn, nguyên sinh chất đồng đều,
không có nhân phân hóa, không có tiêm mao. Trong giống này thường gặp hai
loại: Sporocytophaga myxoccoides (có màu vàng) và Sporocytophaga
ellipsopora (có màu nâu). Chúng đều là những vi khuẩn phân hủy cellulose
mạnh.
Nguyễn Lân Dũng (1976) cho rằng, ngoài niêm vi khuẩn, trong đất còn
thường thấy các loại vi khuẩn phân hủy cellulose thuộc giống Cellvibrio gần gũi
với nhóm Pseudomonas. Khuẩn lạc của Cellvibrio có một số loài vô màu, có một
số khác màu vàng – lục.
b. Những vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

4

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

Trong điều kiện việc xâm nhập không khí bị hạn chế, các loài vi khuẩn ưa
ẩm hoặc ưa nóng thuộc giống Clostridium và Bacillus tiến hành phân hủy
cellulose. Đại diện điển hình cho các vi khuẩn ưa ẩm phân hủy cellulose ở 30 400C loài Clostridium omelianskii. Vi khuẩn này có hình que (4 - 8 x 0,5 – 0,3
µm), có thể di động, khi sinh bào tử có dạng Plectridium (bào tử nằm ở một đầu)
(Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2007 ).
Phân hủy kỵ khí các chất cellulose là một trong những kiểu lên men
butyric. Quá trình này tham gia chủ yếu là các loài vi khuẩn sau:
Bacillus cellulosae hydrogenicus: là trực khuẩn hình rất dài (10-

-

12µm). Tạo bào tử trên một đầu trực khuẩn. Chúng lên men cellulose tạo thành
khí hydro.
-

Bacillus cellulosae methanicus: hình dáng rất giống loài trên nhưng

kích thước nhỏ hơn. Cũng tạo bào tử trên một đầu vì vậy chúng có hình như một
chiếc dùi trống. Và khả năng tạo bào tử nhanh hơn.
-

Bacillus cellulosae dissolvens: là trực khuẩn tương đối dài (12µm).

Tạo bào tử hình oval, không bị tiêu diệt ở nhiệt độ 100 oC trong 50 phút. Lên men
cellulose tạo thành acid butyric, acid acetic, ethanol, CO2 và H2O.
-

Clostidium thermocellum: là trực khuẩn kích thước không lớn lắm (5 x

4µ), kỵ khí tùy tiện, trực khuẩn tạo bào tử. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
5.

Sơ lược một số phương pháp sinh hóa

a.

Định lượng protein bằng phương phápBradford (1976)

Các protein cho phản ứng với Coomassie Brilliant Blue G250 (CCB) sẽ
hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm,
cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp này có độ
nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời
gian.
b.

Định lượng đường khử bằng phương pháp Nelson (1994)

Đây là phương pháp xác định hoạt tính enzim dựa vào lượng đường khử
sinh ra thông qua phản ứng trung gian với thuốc thử Nelson Somogyi.
Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzim học, người
ta không định lượng enzim một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

5

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi là hoạt độ) của enzim. Trong
phản ứng có enzim xúc tác, sự hoạt động của enzim được biểu hiện bằng
cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của
hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức
độ hoạt động của enzim thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản

phẩm được tạo thành trong phản ứng.
c.

Phương pháp điện di trên gel SDS- PAGE

Kỹ thuật điện di dựa trên nguyên tắc trong một điện trường các phân tử
tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương của điện trường và ngược lại. Tốc độ di
chuyển của các phân tử này tùy thuộc vào kích thước, hình dạng, điện tích, thành
phần hóa học của phân tử và lực điện trường. Phương pháp điện di này cho phép
theo dõi quá trình thủy phân theo thời gian và đồng thời xác định được trọng
lượng các peptid sinh ra trong dịch thủy phân.
Trong thực tế để xác định được trọng lượng phân tử của một protein người
ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, đây là hỗn hợp các protein
có trọng lượng phân tử khác nhau đã được xác định
II.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
1.

Tình hình nghiên cứu trong nước
Nguyễn Thu Phướng (2008) đã phân lập được 24 dòng vi khuẩn phân

giải cellulose trong nước thải từ bãi rác, trong đó có 14 dòng phát triển ở nhiệt độ
30oC và 10 dòng phát triển ở nhiệt độ 55 oC. Đa số các dòng phát triển nhanh trên
môi trường agar, các dòng vi khuẩn bình nhiệt (30 oC) phát triển mạnh hơn (sau
24 giờ) các dòng vi khuẩn ưa nhiệt (55 oC) sau 36 giờ. Trong 14 dòng ở nhiệt độ
30oC có 12 dòng cho kết quả thủy phân cellulose tốt khi kiểm tra bằng phản ứng
sinh hóa. 10 dòng ở 55oC đều cho phản ứng mờ hơn khi thử nghiệm với Congo
đỏ, không thấy được vùng sáng xung quanh.
2.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Sáu tiểu đơn vị của Thermophilic Clostridium sp. có trọng lượng phân tử

từ 210.000 đến 58.000 đựơc phát hiện bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
sau khi đã được tinh sạch qua cột CM-Bio-Gel A và tương tác ái lực lectin
(Jacalin). Hoạt tính đặc hiệu carboxymethylcellulase (CMCase) của những

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

6

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

cellulase tinh sạch cao gấp 8 – 15 lần hoạt tính CMCase của dịch trích cellulase.
pH từ 5,5 đến 7,0 ở nhiệt độ 70OC là các điều kiện tối thích cho hoạt động của
CMCase (T. Kobayashi và ctv, 1990).
Srinivan và Han (1969) đã phân lập được 2 giống có khả năng cộng sinh
là Cellulomonas và Alcaligenes. Trong môi trường cellulose sự kết hợp hai loài
này sẽ phát triển nhanh hơn so với môi trường cấy riêng lẻ (Nguyễn Khắc Tuấn,
1996).
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch có thể thủy phân CMC
(Carbomethyl cellulose), trấu, bã mía, và giấy vụn, trong đó CMC cho kết quả
thủy phân tốt hơn. Hiệu suất thủy phân CMC tăng lên khi nồng độ CMC ngày
càng tăng từ 5 – 50 g/l. Khi nồng độ CMC là 10g/l thì sản lượng đường khử và

tốc độ sản sinh đường khử chỉ đạt được lần lượt là 5,531mg/l và 92,9 mg/l/h. Vả
lại, việc phân lập vi khuẩn sinh H2 (mà chủ yếu là dòng Clostridium) đã được sử
dụng để biến đổi sự thủy phân cellulose thành năng lượng H2. Với nồng độ
đường khử ban đầu là 0,8 g/l, sản lượng và số lượng H2 lần lượt khoảng 23,8ml/l
và 1,21 mmolH2/g đường khử (0,097 mmol H2/g cellulose). (Yung-Chung Lo et
al, 2008)
Clostridium josui sp. nov. là vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí bắt
buộc, ưa ấm phát triển tốt nhất ở 450C và pH = 7,0, là vi khuẩn tạo bào tử hình
tròn được tìm thấy trong phân. Dòng này thủy phân cellulose nguyên thủy, trấu,
và những nguyên liệu có chứa cellulose khác. Đây là dòng vi khuẩn sản xuất
ethanol, acetate, butyrate, hydrogen, CO2 trong suốt quá trình phát triển trên môi
trường cellulose và cellobiose. (Jiraporn Sukhumavasi et al, 1988)
Chín dòng vi khuẩn phân hủy cellulose được phân lập từ trong nguồn đất,
trong đó có một dòng là Cellolorimicrobium cellulans. Hoạt tính của enzim thủy
phân cellulose (gồm cellulase và xylanase) được sản xuất từ những chủng này
hiện diện chính là những enzim ngoại bào và những sản phẩm enzim hoạt động
độc lập với môi trường phát triển có celulose (xylan, trấu và cám). (YungChung Lo et al, 2009).

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

7

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

PHẦN III

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thời gian tiến hành: từ tháng 12/2008 đến tháng 06/2009.
Địa điểm tiến hành thí nghiệm: phòng Vi Sinh Vật, phòng Sinh Hóa,
phòng Enzim thuộc Viện NC& PT Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Cần Thơ.
2. Phương tiện thí nghiệm
a. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật, kính hiển vi điện tử, máy lắc mẫu, nồi
khử trùng nhiệt ướt, tủ sấy,Máy khuấy từ, pH kế, cân điện tử, lò vi sóng
Panasonic, đĩa petri, ống nghiệm, bình Erlenmeyer 500 ml, bộ điện di đứng
Protein II, hệ thống chụp gel_VersaDoc, máy ly tâm Eppendorf centrifuge 5417,
,bộ micropipette và những thiết bị, dụng cụ cần thiết khác trong phòng thí
nghiệm.

Tủ cấy vô trùng

Máy lắc ngang

Tủ ủ vi sinh vật

Máy ly tâm lạnh

Kính hiển vi

Water bath

Hình 1: Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

8

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

b. Vật liệu thí nghiệm: đất và trấu đang hoai mục ở các nhà máy xay xát.
c. Hóa chất: NaCl, CMC, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4.6H2O, agarose,
ethanol, aceton, acid acetic, đệm acetate pH 5,0, thuốc thử Đồng, thuốc thử
Arsenomolabdate, dung dịch glucose, cellulose, protein chuẩn, Na-CM celulose,
Congo red, thuốc nhuộm Gram,.... và các hóa chất khác.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục đích thí nghiệm: Đề tài gồm 06 thí nghiệm với mục tiêu phân lập
những dòng vi khuẩn hiện diện trong đất và trấu đang hoại mục để thuỷ phân
CMC. Bằng những phương pháp kiểm tra vi sinh và sinh hoá các dòng vi khuẩn
có hoạt tính cellulase mạnh sẽ được tuyển chọn và lưu giữ cho các nghiên cứu
tiếp theo.
Chuẩn bị mẫu vật và môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Bảng 1: Thành phần môi trường Delafield (Ryckeboer et al, 2002)
Tên hoá chất

Khối lượng/thể tích

Đơn vị

CMC

10
gram
(NH4)2SO4
1
gram
K2HPO4
1
gram
MgSO4.7H2O
0,5
gram
NaCl
0,001
gram
Agar
20
gram
Nước
1000
ml
Môi trường sau khi được khử trùng nhiệt ướt được phân phối vào đĩa
petri trong điều kiện vô trùng.
Bảng 2: Thành phần môi trường Delafield (Ryckeboer et al, 2002)
Tên hoá chất
CMC
(NH4)2SO4
K2HPO4
MgSO4.7H2O
NaCl
Nước

Khối lượng/thể tích
10
1
1
0,5
0,001
1000

Đơn vị
gram
gram
gram
gram
gram
ml

Môi trường sau khi được khử trùng nhiệt ướt được phân phối vào các
bình tam giác 100ml

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

9

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

Bố trí thí nghiệm
1. Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn
a. Phân lập vi khuẩn
Mục đích: tách riêng từng tế bào vi sinh vật trong đất và trấu đang hoại
mục để thu nhận được giống ở dạng thuần khiết (ròng).

Hình 2: Hình thu mẫu trấu và đất
Các bước tiến hành

-

Cách chuẩn bị đĩa môi trường phân lập:
Sau khi pha môi trường vào bình tam giác thì tiến hành khử trùng nhiệt

ướt ở 121oC, 1 atm trong 20 phút cho cả môi trường và đĩa petri. Khi môi trường
đã nguội khoảng 45 - 50 oC thì ta tiến hành đổ vào đĩa petri. Sau đó khử trùng
bằng tia UV, để môi trường nguội ta đem ủ ở 30oC trong 24 giờ để kiểm tra có bị

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

10

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

nhiễm (nhiễm nấm men và nấm mốc) hay không. Chỉ được sử dụng nếu đĩa
không bị nhiễm.
- Đồng nhất mẫu đất và mẫu trấu: 3 loại mẫu ở cùng vị trí ở cùng một địa
điểm thu mẫu được sấy khô ở tủ sấy (35oC) rồi được trộn đều lại với nhau. Sau
đó lấy 4 - 5 gram mẫu hòa vào bình tam giác (có chứa nước cất đã được khử
trùng), đem lắc trên máy lắc 150 vòng/phút trong 15 – 20 phút. (Nguyễn Hữu
Hiệp, 2008) Sau đó để khoảng 60 phút cho lắng lại, thu dịch huyền phù của mẫu
và tiến hành pha loãng, nhỏ giọt.
Sau khi đồng nhất mẫu xong thì tiến hành pha loãng mẫu như sau:
Nồng độ pha loãng:10-1

10-2

10-3

10 -4

10-5

Thể tích mẫu (µl) 100

100

100

100

100

Thể tích nước cất (µl)900

900

900

900

900

1ml dịch đồng nhất

Lấy 100 µl

100 µl

900µl nước cất
1:10

900µl nước cất
1:100

100 µl

100 µl

100 µl

900µl nước cất

900µl nước cất

1:1000

1:10000

900µl nước cất
1:100000

Hình 4: Cách pha loãng mẫu

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

11

MSSV: 3052824


Luận văn tốt nghiệp- 2009
-

Công nghệ sinh hoc K31

Nhỏ giọt mẫu: Chọn 4 nồng độ pha loãng là 10 -5, 10-4, 10-3 và 10-2 để

tiến hành nhỏ giọt. Mỗi nồng độ được nhỏ trên 4 phần tư của đĩa môi trường.
Mỗi mẫu lặp lại 4 lần. Nhỏ giọt mẫu xong để mẫu khô tự nhiên. Sau đó đem 2
đĩa ủ ở điều kiện hiếu khí và 2 đĩa ủ ở điều kiện kị khí, tất cả ở 30 oC trong 24 giờ.
Đối với vi khuẩn hiếu khí: Mẫu được ủ trong tủ ủ ở 30oC trong tủ ủ.
Đối với vi khuẩn kỵ khí: Các đĩa petri mới chuyển được chuyển vào
bình thủy tinh có nắp đậy. Dùng đèn cầy để tạo môi trường không có oxy trong

bình. Sau đó mẫu được ủ trong tủ ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh.
-

Cấy truyền: sau khi ủ theo dõi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì tiếp tục

chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau, mỗi khuẩn lạc cấy vào một đĩa riêng theo
đường zigzac (đường cấy sau chỉ chạm vào đường cấy trước một vài điểm) ( hình
5), sau khi cấy xong một đường cấy phải hơ nóng đầu kim cấy trên ngọn đèn cồn.
Sau đó đem ủ ở nhiệt độ thích hợp. Cứ như thế cho đến khi các khuẩn lạc rời đều
thì kiểm tra dưới kính hiển vi thấy khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng, kích thước,
khuẩn lạc rời là xem như đã ròng. Nếu mẫu ròng thì trữ mẫu. Nếu mẫu chưa ròng
thì tiếp tục cấy đến khi ròng.
Lưu ý: Tất cả các thao tác trên (nhỏ giọt, cấy truyền) phải được thực
hiện trong tủ cấy vô trùng. Mẫu trữ trong ống nghiệm khi ròng không được lấy
mẫu quá 3 lần đem thử với các phản ứng sinh hóa.

Đường số 2

Đường số 3

Đường số 1

Đường số 4
Hình 5: Cách cấy vi khuẩn trên đĩa petri

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

12

MSSV: 3052824

Luận văn tốt nghiệp- 2009

Công nghệ sinh hoc K31

b. Nhuộm Gram vi khuẩn
Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học
người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853-1938). Ông phát triển kỹ thuật này
vào năm 1884 để phân biệt các Pneumococcus với Klebsiella pneumoniae.
Mục đích: phân biệt các dạng vi khuẩn thuộc hai nhóm Gram âm và
Gram dương
Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào
với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác
nhau.
Trình tự các bước nhuộm gram được tiến hành theo qui trinh sau:
Nước vô trùng lên kính mang vật
Chuyển vi sinh vật lên kính mang vật
Cố định vi sinh vật trên kính mang vật
1-2 giọt Crystal violet
1 phút
Rửa bằng nước cất vô trùng
1-2 giọt iod
1 phút
Rửa bằng nước vô trùng
Rửa bằng cồn 70oC (nhanh)
Rửa bằng nước vô trùng
1-2 giọt Fuchsin
1 phút
Rửa bằng nước vô trùng

Khô
Quan sát mẫu bằng kính hiển vi
quang học (x400)
Hình 6: Qui trình nhuộm Gram vi khuẩn

SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền

13

MSSV: 3052824