sử dụng chỉ thị phân tử xác định và chọn lọc gen kháng bệnh đạo ôn trên các giống lúa địa phương và một số dòng chỉ thị

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48
Phần 1
Mở đầu

1.1. Đặt vấn đề
Lúa là một trong ba cây lơng thực chủ yếu trên thế giới (lúa, lúa mỳ và
ngô),là cây lơng thực chính của hơn một nửa dân số thế giới và của phần lớn dân
châu á(IRRI 1994). Khoảng 40% dân số sử dụng lúa gạo là nguồn lơng thực
chính, 25% sử dụng lúa gạo trên 1/2 khẩu phần lơng thực hàng ngày. Nh vậy, lúa
gạo có ảnh hởng tới 65% dân số thế giới [9].
Hiện nay trên thế giới có khoảng 100 nớc trồng lúa và tập trung chủ yếu ở
Châu á, 85% sản lợng lúa thế giới đợc sản xuất bởi 8 nớc châu á: Trung Quốc, ấn
Độ, Inđônêxia, Banglades, Việt Nam, Thái Lan, Myanma và Nhật Bản [1].
Việt Nam là nớc có truyền thống sản xuất lúa nớc từ lâu đời, có diện tích
trồng lúa đứng thứ 6 thế giới (7453000 ha), sau ấn Độ, Trung Quốc, Inđônêsia,
Bănglades và Thái Lan [3]. Trong những năm qua nớc ta không những sản xuất
đảm bảo an ninh lơng thực mà còn vơn lên là một nớc xuất khẩu gạo đứng thứ 2
thế giới. Năm 2005, lợng gạo xuất khẩu của Việt Nam đã vợt con số 5,2 triệu tấn,
chiếm 23% lợng gạo xuất khẩu toàn cầu [6].
Cho tới nay, cùng với tiến bộ của khoa học kỹ thuật, năng suất và chất lợng lúa gạo ngày cáng đợc nâng cao. Với mục tiêu tăng nhanh sản lợng, các biện
pháp thâmcanh đã đợc áp dụng triệt để, kỹ thuật canh tác cũng có nhiều thay đổi
so với trớc, các giống lúa mới đợc đa ra trồnh mà cha qua kiểm định kỹ lỡng đã
làm cơ cấu giống mất cân đối.đó là cha kể đến một lợng khổng lồ phân bón và

1


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

thuốc trừ sâu bệnh. đây có thể là những nguyên nhân làm cho sâu bệnh thay đổi
về thành phần, số lợng, mức độ gây hại và xuất hiện những nòi mới có tính độc
cao, gây hại trên quy mô lớn. các giống lúa mất dần tính kháng và dịch bệnh hình
thành, phá hại nặng cho các vùng trồng lúa.
Trong các bệnh hại lúa, bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia Oryzae Cav. gây
ra đợc coi là bệnh hại quan trọng nhất và có ý nghĩa kinh tế ở các nớc trồng lúa.
Theo số liệu của Cục BVTV, từ năm 1999-2003, diện tích lúa nhiễm đạo ôn
trung bình mỗi năm ở nớc ta khoảng 298.977 ha [4].năm 2003 trên cả nớc có
265.216 ha bị bệnh đạo ôn lá trong đó diện tích nhiễm nặng là 1.532 ha ; 25.715
ha bị bệnh đạo ôn cổ bông trong đó diện tích bị nhiễm nặng là 166 ha[1]. chỉ
riêng trong vụ hè thu và vụ mùa năm 2004 cả nớc có 779 ha bị bệnh đạo ôn lá ,
433 ha bị bệnh đạo ôn cổ bông[2].Năm 2005, diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn lá
khoảng 212.626 ha, trong đó diện tích nhiễm nặng khoảng 4.275 ha. Diện tích
nhiễm đạo ôn cổ bông khoảng 23.751 ha, trong đó diện tích nhiễm nặng là 494
ha [2].
ể phòng trừ bệnh này, rất nhiều biện pháp khác nhau đã đợc áp dụng nh:canh tác, dùng thuốc hoá học, chọn tạo giống kháng bệnh;trong đó biện pháp
sử dụng giống kháng đợc coi là có hiệu quả kinh tế nhất không gây ô nhiễm môi
trờng và tạo ra nông sản sạch. Trong những năm gần đây, rất nhiều giống kháng
đợc đa vào sản xuất. Tuy nhiên khi sử dụng giống này trên diện rộng thì chỉ sau
vài ba năm chúng lại trở thành nhiễm do sự biến đổi của các nòi, chủng nấm gây
bệnh đạo ôn. theo Veraraghavan(1975), trên thế giới đã có 256 chủng nấm gây
bệnh đạo ôn. tơng ớng với mỗi chủng có những gen kháng khác nhau.Hiện nay

2


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

đã có hơn 30 locus gen kháng bệnh.mỗi gen kháng đợc một số chủng nhất định.
Có gen kháng mạnh với chủng này nhng lại bị nhiễm nặng bởi chủng khác.
Để có thể tạo ra các giống kháng bền vững với bệnh đạo ôn, thì việc tìm ra
nguồn gen kháng là việc cần thiết tập đoàn các giống lúa địa phơng Việt Nam là
rất đa dạng và phong phú, đây là nguồn gen quý giá cho các nhà chọn giống sử
dụng để lai tạo. muốn khai thác và sử dụng nguiồn gen này thì cần phảI có những
nghiên cứu kỹ lỡng về các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng bệnh, bản đồ
genom và vị trí của các gen kháng trong bản đồ.bằng các kỹ thuật tiên tiến của
công nghệ sinh học nh PCR, RFLPthì việc phát hiện các gen kháng đạo ôn
trong các giống này trở lên đơn giản hơn.
Chính vì vậy chúng tôI tiến hành đề tài:Sử dụng chỉ thị phân tử xác định
và chọn lọc gen kháng bệnh đạo ôn trên các giống lúa đị phơng và một số
dòng chỉ thị .
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích
-Nghiên cứu khả năng kháng bệnh đạo ôn của các giống lúa địa phơng .
-sử dụng chỉ thị phân tử tìm gen kháng bệnh đạo ôn hữu hiệu Pi-ta trong
các giống này.
1.2.2. Yêu cầu
-Nghiên cứu các đặc điểm nông sinh học liên quan tới tính kháng đạo ôn
của các giống lúa địa phơng.

3


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

-Nuôi cấy và lây nhiễm nhân tạo các Isolate mới phân lập ở miền bắc Việt
Nam cho các giống này và đánh giá khả năng kháng bệnh của chúng.
-Sử dụng chỉ thị phân tử tìm gen kháng bệnh Pi-ta trong các giống lúa địa
phơng này.

4


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

Phần 2
Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nớc
2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nớc
Bệnh đạo ôn lần đầu tiên đợc phát hiện ở Italia năm 1560, sau đó ở Trung
Quốc năm 1637 bởi Soong Ying Shin, ở Nhật năm 1740 bởi Tsuchiya
(Goto,1953). Nguyên nhân gây bệnh là do nấm Pyricularia oryzae Cav. đợc xác
định bởi Cavara ở Italia [21].
ở Mỹ Mct Calf (1906,1907) cho biết ở miền Nam Carolina bệnh đạo ôn
xuất hiện sớm vào năm 1876.
ở ấn Độ, bệnh đầu tiên đợc biết đến ở vùng đồng bằng Thajaru miền Nam
ấn Độ năm 1918 (Mc Rae, 1922) và gây thành dịch tàn phá nghiêm trọng vào
năm 1919 (Padmanabhan, 1965).
Việc nghiên cứu ngày càng đợc đẩy mạnh ở Nhật, ấn Độ, Philippin và Mỹ.
Những công bố, nghiên cứu về bệnh đạo ôn trong thời gian qua ngày càng nhiều
Padwick (1950), Ou (1985), Further và Pabmanabhan (1965), Gangopadhyay
(1983), Gangopadhyay và Pabmanabhan (1987), và K.Manibhushan.Rao (1990).
2.1.1. Phân bố địa lý

Bệnh đạo ôn là bệnh hại phổ biến trên cây lúa, bệnh xuất hiện và gây hại ở
hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới, ngoại trừ bang California của Mỹ.
Bệnh còn xuất hiện ở những vùng đất trũng ngập nớc hoặc ở vùng đất cao
ma nhiều, những vùng trồng lúa ngập nớc hay những vùng nớc sâu. Trong điều
kiện khô hạn, đặc biệt là vùng xích đạo, nơi nhiệt độ rất cao, ẩm độ thấp, ở nơi
những cánh đồng có mực nớc lớn, bệnh thờng lây qua đốt cây [21].
5


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

2.1.2. Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh đạo ôn hại lúa là bệnh truyền nhiễm do nấm Pyricularia oryzae Cav.
gây ra. Bệnh đã đợc phát hiện từ lâu song phải đến năm 1871 Garovario ở Italia
cho đó là bệnh do nấm Pleospora oryzae Cav.. Năm 1891, Cavara là ngời đầu
tiên mô tả nấm bệnh trên lúa, xác định chính thức nấm Pyricularia oryzae Cav.
là nguyên nhân gây bệnh đạo ôn trên lúa, theo phân loại nấm của Saccardo. Nấm
Pyricularia oryzae Cav. còn có tên khác là Pyricularia grisea, Magnaporthe
gresea. Nấm Pyricularia oryzae Cav. thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp
nấm Bất toàn.
Cành bào tử phân sinh của nấm hình trụ, đa bào không phân nhánh, đầu
cành thon và hơi gấp khúc. Nấm thờng sinh ra từ các cụm cành từ 3-5 chiếc. Bào
tử phân sinh hình quả lê hoặc hình nụ sen, thờng có từ 2-3 ngăn ngang, bào tử
không màu, kích thớc trung bình của bào tử nấm 19-23 x 10-12 àm. Nhìn chung
kích thớc của bào tử nấm biến động phụ thuộc vào các isolate, điều kiện ngoại
cảnh và các giống lúa.
Nấm đạo ôn thờng sinh trởng và phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 25-280C và
ẩm độ không khí trên 93%. Phạm vi nhiệt độ nấm sản sinh bào tử từ 10-300C.

Điều kiện ánh sáng âm u có tác dụng thúc đẩy quá trình sản sinh của bào tử nấm.
Bào tử nấm nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24-28 0C và có giọt nớc. Quá trình
xâm nhập của nấm vào cây phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, ẩm độ không khí và
ánh sáng. ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ 24 0C và ẩm độ bão hoà là điều kiện
thuận lợi nhất cho nấm xâm nhập vào cây.
Trong quá trình gây bệnh, nấm tiết ra một số độc tố nh nh axit piconinic
(C6H5N02) và piricularin (C18H14N2O3) kìm hãm hô hấp và phân huỷ các enzim
chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trởng của cây lúa.

6


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

2.1.3. Triệu chứng của bệnh đạo ôn
Nấm gây bệnh đạo ôn có thể tấn công gây hại ở hầu hết các giai đoạn sinh
trởng của cây lúa. Triệu chứng điển hình của bệnh là các vết đốm trên lá, lúc đầu
là các đốm nhỏ hình tròn hoặc hình bầu dục có màu xanh xám hoặc xám sẫm, vết
bệnh lan rộng, nhanh trong điều kiện ẩm ớt và có hình dạng mắt én, hình thoi ở
giữa có mầu xám trắng, có đờng viền xung quanh mầu nâu hoặc nâu đỏ. Trên các
giống lúa nhiễm bệnh, trong điều kiện độ ẩm cao, vết bệnh có thể phát triển kéo
dài tới 1- 4,5 cm và rộng từ 0.3 0.5 cm.
Nấm bệnh còn có khả năng xâm nhiễm gây hại trên bẹ lá, đốt thân, đặc
biệt là ở giai đoạn trởng thành, bệnh trên cổ bông và trên các gốc của bông gây
thiệt hại cho năng suất [12].
2.1.4. Những thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra đối với sản xuất lúa
Bệnh đạo ôn là một bệnh hại nghiêm trọng trên lúa bởi vì sự phát tán và
sức tàn phá của nó rất rộng. Nó làm cho nhiều vùng trồng lúa không thể đạt đợc

kết quả mong muốn mặc dù đã áp dụng nhiều biện pháp phòng chống. Hạt giống
nhiễm bệnh thờng làm cây con chết, trong khi đó bệnh đạo ôn trên cổ bông làm
mất một nửa thậm chí cả bông lúa, làm giảm năng suất.
Những nghiên cứu về thiệt hại rất có ý nghĩa nh: ở Italia (Baldacci, 1947),
ấn Độ (Padmanabhan, 1967), Nhật (Goto, 1963), Hàn Quốc (Crill và cộng sự,
1982), Philippin (Ou, 1985), Ai cập (Readdy và Bon man, 1987).
ở ấn Độ, Padmanabhan (1967) đã nghiên cứu mối quan hệ của năng suất
với tỉ lệ mắc bệnh đạo ôn, và đã tìm ra rằng khi tỉ lệ mắc bệnh là 2% thì năng
suất giảm 4%.
Kato (1974) đã đa ra phơng pháp tính thiệt hại năng suất theo đạo ôn trên
cổ bông, đốt thân và trên bông.

7


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

Earlier Kuribayashi và Ichikawa (1982) đã tính toán sự thiệt hại do đạo ôn
gây ra bằng phơng trình đờng thẳng:
y = 0.69x + 2,8
Trong đó

y : là tỉ lệ thiệt hại
x : là tỉ lệ bông lúa mắc bệnh đạo ôn.

Tuy nhiên phơng trình trên chỉ tính đợc ảnh hởng của bệnh đạo ôn trên
bông, mà không tính đợc ảnh hởng của bệnh trên lá.
Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả đã đánh giá thiệt hại của bệnh

nh: Ou và Nuque (1963), Goto (1965), Padmanbhan (1965), Tien va Harang
(1975).... Những báo cáo về thiệt hại do đạo ôn cổ bông gây ra của các tác giả
nh: Ktasube và Koshimizu (1970), Kapoo và Sigh (1983), Sharama và cộng sự
(1988)... là quan trọng.
Theo Supad (1982) đã quan sát và thấy khi hạt giống nhiễm bệnh đạo ôn
thì năng suất giảm 30% (Malaysia). Trong khi đó ở Brazil, Prabhu và Moris
(1986) cho biết khi hạt giống nhiễm bệnh đạo ôn trồng ở vùng đất cao làm giảm
năng suất tới 61%. ở Thái Lan, Loehken (1980) thấy rằng năng suất sẽ giảm từ
44 54% khi trồng hạt giống đó ở vùng nớc chảy.
Tác giả Reddy và cộng sự (1988) đã đa ra phơng trình thể hiện mối quan
hệ giữa năng suất và tỷ lệ bệnh:
y = 4306.4- 67.7 x ( r = 0.9427 )
Trong đó

y : là năng suất tính đợc
x : là tỉ lệ bệnh ( % )

Tác giả Surin và cộng sự (1989, 1991) đã đánh giá thiệt hại năng suất của
nhiều vụ lúa và kết luận rằng khi một vùng bị nhiễm bệnh đạo ôn 1% thì năng
suất giảm 3%.

8


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

Theo Torres và Teng (1989,1991 ) sử dụng phơng pháp cải tiến đánh giá
thiệt hại năng suất cho cả đạo ôn lá (LBl ) và đạo ôn trên bông (PBl):

Y = 5.0725 + 0.3664LBl + 0.3301PBl (r2 = 0.72, p = 0.01) [21].
Về thiệt hại trên đồng ruộng, hàng năm ngời ta đều có những ghi nhận
đáng kể thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra ở nhiều địa phơng, mặc dù đã sử dụng
rộng rãi nhiều loại thuốc hoá học. Năm 1850, ở ấn Độ sản lợng bị thiệt hại lên
tới 75%, ở Philippin đã có vài nghìn hecta bị hại vì bệnh đạo ôn và sản lợng thất
thu ớc tính khoảng 50%. ở Nhật Bản (1950-1960) thiệt hại bình quân 2,89%
tổng sản lợng lúa, mặc dù đã có những nỗ lực sử dụng thuốc phòng trừ bệnh.
Năm 1988, dịch bệnh đạo ôn gây thiệt hại nặng ở vùng duyên hải phía bắc Nhật
Bản, tổng sản lợng bị thiệt hại ở quận Fukusima là 24%, có những nơi bị thiệt hại
lên tới 90%.
ở Philippin (1962 1963) năng suất lúa bị giảm do bệnh đạo ôn gây ra ớc tính là 90% ở một số nơi và từ 50-60% ở tỉnh Bicol và tỉnh Leyte.
ở Hàn Quốc (1989) cũng báo cáo thiệt hại về sản lợng do đạo ôn gây ra là
4.2% năm 1978 và 3.9% năm 1980 [12].
2.1.5. ảnh hởng của dinh dỡng đến sự phát triển của nấm Pyricularia oryzae
Cav. gây bệnh đạo ôn
Những nghiên cứu về ảnh hởng của dinh dỡng đến nấm gây bệnh đạo ôn
cho thấy một số axit amin rất cần thiết cho sự sinh trởng và phát triển của nấm
nh: Biotin, Thiamime. Theo nghiên cứu của Otani (1952) cho thấy KNO 3,
NaNO3, axit aspartic có tác dụng kích thích sự phát triển của sợi nấm. Nguồn
dinh dỡng cacbon dùng trong nuôi cấy nấm có thể sử dụng nhiều loại đờng khác
nhau nh Maltose, Saccarose, Glucose, Insulin, Mannitol. Ngoài ra có thể dùng
các axit hữu cơ nh axit Succinic.

9


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

Những môi trờng giàu dinh dỡng đạm từ Peptone và dịch chiết của nấm
men cũng làm tăng khả năng sản sinh bào tử của nấm Pyricularia oryzae Cav..
Môi trờng bột mạch agar (OMA), cũng đợc sử dụng phổ biến trong nuôi cấy nấm
bệnh để sản xuất bào tử cho lây nhiễm.
Trong nuôi cấy nguồn nấm và sản xuất bào tử dùng để lây nhiễm bệnh
nhân tạo luôn phải quan tâm đến dinh dỡng của môi trờng đợc sử dụng. Nhiều
loại môi trờng đã đợc dùng trong nghiên cứu để kích thích quá trình sản sinh bào
tử của nấm đạo ôn nh Rice Polish Agar, môi trờng này đợc sử dụng nhiều ở Mỹ.
ở Đài Loan và Nhật Bản, sử dụng hạt lúa mạch để tạo môi trờng nuôi cấy.
Nấm Pyricularia oryzae Cav. có thể phát triển tốt trên nhiều loại môi trờng
dinh dỡng có chứa mô thực vật hoặc dịch chiết của cây trồng. Khi nuôi cấy, cho
thêm vào môi trờng nuôi cấy dịch chiết của rơm rạ sẽ kích thích sự sinh trởng và
sản sinh bào tử nấm [12].
2.1.6. Các chủng sinh lý nấm gây bệnh đạo ôn
Trong tự nhiên, khả năng gây bệnh của nấm Pyricularia oryzae Cav. luôn
biến đổi do sự đột biến của nấm, sự tác động của các yếu tố sinh thái và các
giống lúa. Từ đó hình thành nên các chủng sinh lý của nấm Pyricularia oryzae
Cav. khác nhau. Những chủng này không khác nhau về hình thái mà khác nhau
về đặc tính gây bệnh trên từng nhóm giống lúa riêng biệt [8].
Năm 1922, ở Nhật Bản tác giả Sasaki lần đầu tiên nghiên cứu và phát hiện
các nòi sinh học nấm Pyricularia oryzae Cav. gây bệnh đạo ôn. Nhng chỉ sau khi
sử dụng giống Futaba có gen Pi-a vốn là giống kháng nòi nấm A dần dần trở
thành giống nhiễm nặng thì việc nghiên cứu về nòi nấm Pyricularia oryzae Cav.
mới thực sự đợc bắt đầu ở Nhật, Mỹ và một số nớc khác. Tuy nhiên, cha có sự
đồng nhất về việc sử dụng các giống lúa dùng để xác định loài giống gây bệnh
đạo ôn ở các nớc. Vì vậy, các loài nấm ở nớc này không thể so sánh với các loài

10

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

đó ở các nớc khác đợc. Để khắc phục tình trạng này từ năm 1963 trở đi, với sự
hợp tác nghiên cứu quốc tế đã thống nhất sử dụng một số bộ giống chỉ thị tiêu
chuẩn quốc tế (8 giống) để xác định chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav.
Các nớc trên thế giới đã xác định đợc 32-64 nhóm nòi nấm gây bệnh đạo ôn hại
lúa, với 256 nòi sinh học ở nhiều nớc.
Theo Goto (1956) nghiên cứu trên 12 giống lúa gồm 2 giống nhiệt đới, 4
giống Trung Quốc, 6 giống Nhật Bản khởi thuỷ, giám định đợc 123 chủng sinh lý
gây bệnh và phân loại chúng thành 3 nhóm đặt tên là N, T, C. ở ấn Độ,
Padmanabhan (1965) đã xác định đợc 31 chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae
Cav. Từ năm 1976, Nhật bản đã sử dụng bộ giống chỉ thị gồm 12 giống có đơn
gen kháng để tiến hành xác định các chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav.
gây bệnh đạo ôn cho lúa. Cho tới nay các nớc trồng lúa đã và đang tiếp tục dùng
bộ giống tiêu chuẩn để xác định các chủng gây bệnh của nấm Pyricularia oryzae
Cav.
Theo báo cáo của Chung (1974), khi đa một giống lúa mới vào sản xuất là
nguyên nhân xuất hiện một chủng nấm mới. Số chủng nấm gây bệnh tuỳ thuộc
vào vùng địa lý, trong một vùng sản xuất lúa có thể có nhiều chủng nấm gây
bệnh khác nhau.
2.1.7. Tính chống chịu bệnh đạo ôn của các giống lúa
Nguồn gen trong cây lúa quyết định tính kháng hoặc nhiễm bệnh của
giống lúa. Phản ứng của cây lúa đối với bệnh phụ thuộc vào giống lúa, thời kỳ
sinh trởng của cây và các chủng sinh lý nấm gây bệnh. Cây lúa thờng nhiễm bệnh
nặng ở giai đoạn mạ và thời gian từ đẻ nhánh tối đa đến giai đoạn trớc khi trỗ
bông.

11

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

tính kháng đạo ôn của các giống lúa do hệ thống các gen kháng quy định.
Tuỳ theo loại gen kháng lớn hay nhỏ, loại đơn gen hay đa gen của từng giống láu
mà ta thấy có giống kháng dọc đơn gen hay kháng ngang đa gen. giống kháng
dọc có một gen kháng tơng ứng với một gen độc của nòi nấm đạo ôn nhất định
nào đó. đó là các giống có tính chống chịu rất cao đối với một số ít nòi đặc hiệu
thể hiện bằng các phản ứng siêu nhạy tạo vết bệnh không hoàn chỉnh sau 24h
xâm nhiễm các sợi nấm trong mô bệnh chết dần. Các giống kháng tạo ra các
phytoalexin, các hợp chất phenon để chóng lại sự phát triển của nấm.
ở các giống kháng ngang đa gen thờng có phổ kháng rộng nhng mức độ
kháng trung bình. Các giống kháng đạo ôn sau khi bị nhiễm tạo ra lợng
phytoalexin ít hơn các giống nhiễm.
lịch sử chọn tạo và sử dụng giống kháng bệnh đạo ôn bắt đầu từ những
năm 1904 tại Nhật Bản , bằng phơng pháp chọn lọc dòng thuần đã tạo ra giống
Kameli và Aikoku. Từ 1910 đã sử dụng phơng pháp lai hữu tính để chọn tạo
giống kháng. từ đó nhiều giống kháng đạo ôn đã đợc sử dụng nh giống Norin6
kháng đạo ôn cổ bông, Norin8 kháng đạo ôn lá, Norin22 kháng cả đạo ôn lá và
đạo ôn cổ bôngVới mục tiêu tạo giống mới năng suất cao, kháng bệnh đạo ôn
cần phảI phát hiện, khai thác và sử dụng triệt để nguồn gen kháng đạo ôn của tập
đoàn giống lúa thế giới. Cho đến nay các gen kháng ổn định của các giống lúa
địa phơng ở các vùng trên thế giới là rất đa dạng và phong phú cần đợc khai thác
và sử dụng(Bệnh đạo ôn hại lúa_Lê lơng Tề_NXBNN 1988)
2.1.8 ứng dụng marker phân rử trong nghiên cứu bệnh đạo ôn hại lúa
DNA marker có thể đợc dùng để lập bản đồ genom, chọn lọc gián tiếp
trong lai tạo giống lúa.

Phân tích quần thể ký sinh

12


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

Bệnh đạo ôn do nấm P.oryzae gây ra, ở giai đoạn vô tính bao gồm các
dòng vô tính. đối với quần thể nh vậy, các dòng DNA thăm dò, có tính chất lặp
lại(repetitive) là những marker rất tốt vì chúng cho phép ta đánh giá cùng một lúc
nhiều locus. Ngơi ta đã phân lập đợc1repetitive element từ nấm bệnh đạo ôn ký
hiệu là MGR586(Harmer và ctv 1989). Nó đợc áp dụng phổ biến cho phân tích
quần thể nấm đạo ôn. repetitive elementnày còn đợc dùng trong cả 2 trơng hợp:
kỹ thuật DNA fingerprinting và phân tíchquan hệ di tuyền huyết thống(Levy&
ctv 1991), nó còn đợc dùng trong việc lập bản đồ genom của ky sinh(Harmer &
Given 1990, Rámao &Harmer 1992).
Phân tích tính kháng của ký chủtính kháng bệnh đạo ôn từ lâu vẫn đợc
xem là thách thức lớn trong công tác chọn giống lúa. Nhìn chung tính kháng đơn
gen có hiệu quả cao hơn, nhng trong nhiều trờng hợp thì tính kháng này rất phức
tạp. tính kháng đa gen thờng có quan hệ vơíơ tính kháng ổn định. Trong điều
kiện nh vậy , có rất ít hoặc không có một dòng nấm ký sinh nào vợt qua nổi sự
kiểm soát của một nhóm gen đó. Nhiều chơng trình tạo giống lúa muốn đa tính
kháng đa gen vào một giống nào đó. Tuy nhiên rất khó có thể nghiên cứu tính
kháng đạo ôn có tính chất số lợng nh vậy. Các gen kháng này có thể đợc tích luỹ
một cách dễ dàng hơn trên cơ sở chọn lọc gián tiếp đối với những marker có liên
kết chặt chẽ với gen kháng bệnh đạo ôn. DNA marker có thể đơc sử dụng để:
-phân tích di truyền tính kháng của các giống lúa có tính kháng ổn định.
-phát triển các dòng đẳng gen (NIL) trong đó các gen đơn kháng bệnh đạo

ôn đã đợc xác định bản chất tổng quát về di truyền.
Vì một gen kháng nào đó phải đối đầu với 1 quần thể ký sinh trên ruộng
lúa cho nên điều quan trọng là phải hiểu đợc đặc tính của mỗi gen kháng trong
phổ kháng bệnh đạo ôn với những quần thể phụ của nấm ký sinh. đã có nhiều
nghiên cứu xác định gen kháng bệnh đạo ôn và vị trí của nó trên nhiễm sắc thể

13


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

đã đợc công bố. Theo Zheng & ctv thì hiện nay trên thế giới đã tìm thấy 30 locus
gen kháng bệnh đạo ôn, trong đó có 38 gen kháng chủ lực và một số gen đợc xác
định vị trí trên bản đồ genom của cây lúa ở các NST khác nhau.
Nhờ kỹ thuật đánh dấu phân tử(MAS marker assisted selection) ngời ta
đã xác định đợc vị trí của hơn 15 gen kháng chủ lực và 13 gen di truyền số lợng(QLTs) kháng đạo ôn lúa. Nh gen Pi-z5

trên NST số 6 liên kết chặt với

marker RG64, khoảng cách di truyền là 2.1 cM; gen Pi-ta trên NST 12, liên kết
chặt với marker RZ397 với khoảng cách di truyền là 3.3cM và marker RG 241
với khỏng cách di truyền là 5.2 cM, các gen này có phổ kháng rộng đợc sử
dụngtrong quá trình chọn giống.
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nớc
2.2.1. Sơ lợc về lịch sử xuất hiện và thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra ở nớc ta
ở nớc ta, bệnh đạo ôn đợc phát hiện vào đầu thế kỷ 19 dới các tên gọi khác
nhau nh bệnh tiêm lụi, bệnh cháy lá lúa. Năm 1921, nhà bệnh cây ngời Pháp là
Fivin-Cens đã phát hiện bệnh ở Nam Bộ và Roger phát hiện ở Bắc Bộ vào năm

1951, nhng ông cho biết bệnh này ít phổ biến, gây hại nhẹ nên không đợc chú ý
nghiên cứu. Năm 1956, ở nông trờng Đồng Giao bệnh đạo ôn bùng phát trên diện
tích rộng làm chết lụi 200 ha. Trong những năm 1956-1960, dịch bệnh phát sinh
ở Miền Bắc gây hại nghiêm trọng ở các tỉnh nh Hải Phòng, Ninh Bình, Hà
Đông.... Những nghiên cứu gần đây của Trần Lệ Chi cho biết bệnh xuất hiện
nhiều ở Thừa Thiên Huế, Tiền Giang và các tỉnh ven sông Cửu Long nhất là vùng
có ma nhiều. Theo Lê Lơng Tề và cộng sự, ở các vùng lúa thuộc đồng bằng sông
Hồng nh Hải Phòng, Hải Dơng, Hng Yên... bệnh thờng hại nặng vào vụ chiêm,
các tỉnh miền núi và trung du phía bắc bệnh hại nặng hơn vào vụ mùa. Tuy nhiên
cũng có vùng lúa bị hại nặng cả vụ chiêm và vụ mùa, đặc biệt là các vùng trồng

14


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

lúa cao sản, do đặc tính mẫn cảm của giống với bệnh. Theo thống kê của cục
BVTV và các tỉnh năm 1975, bệnh hại có xu thế tăng lên ở tỉnh Hà Nam Ninh, có
3 điểm phát sinh bệnh với diện tích trên 5 ha/giống N18 [8].
Năm 1976, bệnh đạo ôn đã tàn phá trên 5.000 ha đợc thông báo ở 68 điểm
điều tra trong cả nớc, trong đó có 300 ha lúa ở Tiền Giang và nhiều tỉnh khác
thuộc đồng bằng sông Mê Công nh Hậu Giang, An Giang mặc dù đã đợc ngăn
chặn bằng thuốc hoá học.
Năm 1985, diện tích lúa bị bệnh là 7.951 ha trong đó có 920 ha bị nhiễm
nặng và 1,2 ha bị cháy lụi. Năm 1986, có 3.900 ha bị nhiễm nặng đạo ôn, riêng
vụ đông xuân 1979 trên 15 nghìn ha bị nhiễm đạo ôn lá và 59.377 ha nhiễm đạo
ôn cổ bông trong đó có nhiều vùng bị nhiễm nặng là: Nghệ Tĩnh, Thái Bình, Hà
Nam Ninh, Hải Phòng.... Đến năm 1987, có trên 150.000 ha bị nhiễm đạo ôn

trong đó có trên 10% diện tích bị nhiễm nặng. Năm 1991, đạo ôn cổ bông hại
138.000 ha và 217.000 ha vào năm 1992 ở đồng bằng sông Hồng. ở miền Nam
năm 1992, diện tích lúa bị đạo ôn là 165.000 ha. Theo báo cáo của Bộ NN&
PTNT (1999) cho biết, diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn lá trong cả nớc là 2.000.666
ha, diện tích bị nhiễm nặng là 6.994 ha, diện tích bị lụi là 77 ha, diện tích bị đạo
ôn cổ bông là 40.627 ha, diện tích bị nặng là 2.768 ha và 44 ha bị giảm năng suất
trên 77%. Năm 2000, trong cả nớc diện tích bị đạo ôn là 2.162.912 ha, trong đó
diện tích bị nhiễm nặng là 64.726 ha. Năm 2001, diện tích nhiễm đạo ôn trong cả
nớc là 2.456.841 ha, bị nhiễm nặng 4.290 ha và lụi 624 ha, diện tích bị đạo ôn cổ
bông là 8.240 ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 4.935 ha. Năm 2005, diện tích
lúa bị nhiễm đạo ôn lá khoảng 212.626 ha, trong đó diện tích nhiễm nặng khoảng
4.275 ha. Diện tích nhiễm đạo ôn cổ bông khoảng 23.751 ha, trong đó diện tích
nhiễm nặng là 494 ha [4].
2.2.2 .Quần thể nấm đạo ôn ở Việt Nam

15


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

Trớc những diễn biến về tình hình dịch bệnh đạo ôn tại Việt Nam, các nhà
khoa học trong và ngoài nớc đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về quần
thể nấm đạo ôn ở Việt Nam, để từ đó làm cơ sở cho công tác chọn tạo giống
kháng bệnh đạo ôn ở trong nớc. Từ năm 1996 đến nay, dựa trên bộ giống chỉ thị
quốc tế, các nhà khoa học đã xác định đợc nhiều nhóm nòi đạo ôn ký hiệu là IA,
IB, IC, ID, IE, và IG phân bố từ các tỉnh Nam Trung Bộ đến các tỉnh Đồng bằng
Bắc Bộ. Các nòi có khả năng gây bệnh cao ở các tỉnh miền Bắc là IB, IE, IC-1,
vàIC-23. các nhóm IA,ID và IG lại có khả năng gây bệnh cao ở Đồng bằng Sông

Cửu Long(Lê Lơng Tề, Vũ Triệu Mân 1998). Năm 1996,Lã Tuấn Nghĩa và Cs đã
dùng kỹ thuật RFLP để tiến hành nghiên cứu đan dạng quần thể nấm đạo ôn ở 10
tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam, đã xác định đựơc 23 nòi .
Từ các kết quả nghiên cứu quần thể nấm đạo ôn, các nhà khoa học tiến
hành nghiên cứu tính kháng đạo ôn ở các giống lúa địa phơng của Việt Nam.
Nguyễn Trịnh Toàn và ctv(1996) đã tiến hành phân tích đa hình DNA của 12
giống lúa kháng đạo ôn nh Chiêm Bắc, Tám Thơm, DT12, DT10...bằng phơng
pháp RFLP và thấy tính đa hình giữa các giống lúa là rất cao. Nguyễn Thị Ninh
Thuận và ctv(1996) đã nghiên cứu sự tơng tác giữa các nòi nấm bệnh đạo ôn đại
diện ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam với các dòng lúa chỉ thị và giống lúa
địa phơng. Kết quả là có nhiều giống địa phơng biểu hiện tính kháng rất cao nh
Tám Thơm, Tẻ Tép...ngợc lại, một số giống lúa đợc chọn tạo tại Việt Nam nh
DT12, DT10, DT13 và CR203 lại bị nhiễm cao. Theo các nhà chọn giống, để
chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn ở Việt Nam thành công thì cần phải tổ hợp
các gen kháng bệnh gồm Pi-1, Pi-z5, Pi-ta, Pi-ta2, Pi-k8 và Pi-b...
Theo PGS.Ts Phan Hữu Tôn(2004), muốn tạo giống kháng bệnh đạo ôn ở
miền Bắc Việt Nam thành công thì cần phải sử dụng các gen kháng lại hầu hết
các chủng gây bệnh nh gen Pi-k5, Pi-k, Pi-ta, Pi-ta2, Pi-z5, Pi-3 và Pi-5(t).

16


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

2.2.3. Quy luật phát sinh phát triển
Sự phát sinh, phát triển của bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố ngoại
cảnh và mức độ nhiễm bệnh của giống, điều kiện nhiệt độ 20-280C, ẩm độ không
khí bão hoà và thời tiết âm u trong vụ lúa đông xuân rất thích hợp cho bệnh phát

sinh gây hại nặng. ở miền Bắc, trà lúa mùa muộn vào giai đoạn trỗ chín, hoặc vụ
lúa chiêm xuân vào giai đoạn đứng cái, làm đòng là những cao điểm của bệnh
trong năm.
ẩm độ không khí và ẩm độ đất có tác dụng lớn đến sự lây lan và phát triển
của nấm bệnh. ở những vùng nhiệt đới, có ma thờng xuyên kéo dài là điều kiện
thuận lợi cho bệnh phát triển nhanh.
2.2.4 ảnh hởng của đất đai, phân bón đến bệnh.
Những chân ruộng nhiều mùn, trũng ẩm, khó thoát nớc, những vùng đất
mới vỡ hoang, đất nhẹ giữ nớc kém, khô hạn, những chân ruộng có lớp sét nông
rất phù hợp cho nấm bệnh đạo ôn phát triển và gây hại.
Phân bón giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự phát sinh, phát triển của
bệnh đạo ôn, ngay cả những năm thời tiết không thuận lợi cho nấm phát triển,
nhng do bón phân không hợp lý tạo điều kiện thúc đẩy bệnh phát sinh và gây hại
mạnh. Bón phân đạm quá nhiều, quá muộn, bón khi cây còn non, nhiệt độ không
khí thấp đều làm tăng tỉ lệ bệnh và mức độ gây hại của bệnh. Phân lân ảnh hởng
ít đén mức độ nhiễm bệnh của cây. Nhng nếu bón không hợp lý bệnh vẫn có thể
tăng. Bón kali trên nền đạm cao cũng có thể làm tăng tốc độ bệnh của cây. Phân
silic có tác dụng làm giảm độ nhiễm bệnh của cây. Mức độ nhiễm bệnh của cây
tỷ lệ nghịch với hàm lợng silic trong cây, do đó bón nhiều silic sẽ làm giảm mức
độ bệnh của cây.
2.2.5Phơng pháp chọn tạo giống kháng bệnh

17


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

Đạo ôn là một bệnh gây hại nghiêm trọng cho lúa, vì vậy đã có rất nhiều

nghiên cứu để tìm hiểu, xác định số lợng gen kháng đạo ôn và vị trí cửu nó trên
NST cửu lúa, nghiên cứu môI trờng phân lập, cách phân lập, lây nhiễm,và đánh
giá sự đa dạng di truỳên về tính kháng đạo ôn cửu các giống lúa phục vụ cho
công tác chon tạo giống kháng bệnh hiệu quả. Tuy nhiên việc nghiên cú và chọn
giống kháng bệnh đạo ôn vẫn còn nhiều khó khăn do:
-Số lợng gen kháng đạo ôn rất nhiều và tồn tại dới các alen khác nhauvì thế
vấn đề tổ hợp chúng lại để tạo giống kháng bệnh còn khó khăn.
-Việc phân lập nấm bệnh đạo ôn là rất phức tạp và khó khăn cần có tay
nghề chuyên môn cao.
- Cha có dòng chỉ thị để so sánh đánh giá khi chọn tạo mà mới có giống
chỉ thị nên phổ so sánh, đánh giá còn hạn chế.
Đã có nhiều phơng pháp chọn giống kháng bệnh nh: phơng pháp lai hữu
tính, phơng pháp gây đột biếncác phơng pháp này cũng đã chọn đợc các giống
kháng có hiệu quả nhất định. Tuy nhiên vẫn còn tồn tại một số nhợc điểm sau:
-Mất nhiều thời gian để chọn tạo ra một giống mới thờng từ 7-10 năm.
-Tạo ra những giống có phổ di truyền hẹp.
Hiện nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã góp phần vào conng
tác chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn. một trong những hớng đi mới hiện nay là
ứng dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử để phát hiện và chọn lọc gen kháng. u điểm của
phơng pháp này là:
- Rút ngắn thời gian chọn tạo và giảm giá thành trong việc chọn lọc các tính
trạng.
- Có thể tìm đợc những cá thể chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể
đang phân ly, trên cơ sở tìm ra sự có mặt của một đoạn DNA liên kết chặt với gen
đó mà không cần dựa vào kiểu hình. Do đó có thể đánh giá cá thể trong bất kỳ

18


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

giai đoạn sinh trởng nào, trong bất kỳ môi trờng nào và cùng một lúc đánh giá
nhiều tính trạng khác nhau trên cùng một cơ thể sinh vật.
- Do tính đa hình của đoạn DNA là rất cao nên tạo khả năng phân biệt đợc sự
khác nhau giữa 2 cá thể sinh vật có quan hệ họ hàng gần nhau, phân biệt đợc sự
sai khác giữa các alen, các chủng sinh lý gây bệnh.
Trong các phơng pháp chỉ thị phân tửl khác nhau đang đợc sử dụng thì phơng
pháp PCR đợc áp dụng nhiều nhất do:
- Mất ít thời gian phân tích một mẫu
- Chỉ cần một lợng nhỏ DNA, không cần tính tinh sạch cao; do đó tốn ít
công, chi phí cho sự chiết suất DNA tinh khiết.
-Nhận biết đa hình rất đơn giản, chỉ cần sử dụng phơng pháp điện di.

Phần 3
nội dung và phơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối tợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tợng
Bệnh đạo ôn và nấm Pyricularia oryzae Cav.
3.1.2. Vật liệu

19


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

* Nguồn nấm

Từ các mẫu nấm Pyricularia oryzae Cav. đã đợc phân lập trong phòng thí nghiệm.
STT Mẫu phân lập

Phân lập từ giống
lúa

Địa điểm lấy mẫu

1

49

Nếp HP

Bình Xuyên - Vụ Bản - Nam Định

2

50

Nhị u 63

Bảo Xuyên -Vụ Bản - Nam Định

3

51

Bắc thơm 7

Bảo Xuyên - Vụ Bản - Nam Định

4

52

Hơng cốm

Trờng ĐH Nông Nghiệp I

5

54

Khang dân

Nam Mỹ - Nam Trực - Nam Định

6

55

Q5

Nam Mỹ - Nam Trực - Nam Định

7

57

VH1

Báo Xuyên - Vụ Bản - Nam Định

* Thuốc BVTV
- Thuốc Rabcide 30WP
* Môi trờng nuôi cấy nấm.
- Môi trờng PSA (Potato Sugar Agar):
+ Thành phần: 200 khoai tây+20g agar+20g đờng +1 lít nớc cất.
+ Dùng để giữ nấm.

20


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

- Môi trờng OMA
+ Thành phần: 50g oatmeal+20g đờng+1lít nớc cất
+ Dùng để nghiên cứu sự phát triển của nấm trên môi trờng nhân tạo và để
sản xuất bào tử.
- Môi trờng Cám agar:
+ Thành phần: 20g cám + 20g agar + 5g đờng + 1lít nớc cất
+ Dùng để nghiên cứu sự phát triển của nấm trên môi trờng nhân tạo và để
sản xuất bào tử.
- Môi trờng Bột ngô agar:
+ Thành phần: 20g bột ngô + 20g agar + 5g đờng + 1lít nớc cất
+ Dùng để nghiên cứu sự phát triển của nấm trên môi trờng nhân tạo.
- Môi trờng Bột gạo agar:

+ Thành phần: 20g bột gạo +20g agar + 5g đờng + 1lít nớc
+ Dùng để nghiên cứu sự phát triển của nấm trên môi trờng nhân tạo.
* Một số giống lúa.
- 12 giống lúa chỉ thị (Nhật Bản) sử dụng để xác định chủng sinh lý nấm
Pyricularia oryzae Cav. (giống chỉ thị).

STT

Tên giống

1

Shin 2

2

Aichi-asahi

21

Có gen kháng

Mã số

Pik-s

1

Pia

2


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

3

Ishikari-Shrroke

Pii

4

4

Kanto51

Pik

10

5

Tsuyuake

Pik-m

20

6

Fukunishiki

Piz

40

7

Yashiromochi

Pita

100

8

Pino.4

Pita-2

200

9

Toride 1

Piz-1

4000

10

K 60

Pik-p

0.1

11

BL 1

Pib

0.2

12

K 50

Pit

0.4

- 7 giống lúa của Việt Nam : DT13, Si23, X30, C70, C71, DT10, Nếp 532.
- 8 giống lúa của Trung Quốc: Q5, Nông u, Khang dân18, Nhị u 63, Hơng
thơm số1, Nam u1, Bồi tạp Sơn Thanh, Hơng thơm.

- 12 dòng, giống lúa đang khảo nghiệm : TBL06-1, TBL06-2, TBL06-3,
TBL06-4, TBL06-5, TBL06-6, TBL06-7, TBL06-8, TBL06-9, TBL06-10, TBL0611, TBL06-12 đợc lấy từ Công ty Giống cây trồng Miền Nam.
- 18 giống lúa lấy từ Công ty Giống cây trồng Nam Định : CR203, Bắc
thơm số 7, VHC, Nếp 97, KD nguyên chủng, Q5, ải 32, NĐ1, MS4, CL9, 903,
Nhị u 838, KD18, VQ14, VB2, Phúc Tiên, BoA.
* Các dụng cụ khác
- Hộp petri, que cấy, bình tam giác, đũa thuỷ tinh, panh, ống đong, đèn
cồn, cốc thuỷ tinh.
- Tủ lạnh, tủ định ôn, buồng cấy, kính hiển vi, bình bơm
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu và thời gian nghiên cứu

22


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

3.1.3.1. Địa điểm nghiên cứu
- Những nghiên cứu trong phòng đợc tiến hành tại phòng bệnh cây phân tử
JICA Trờng ĐH NNI
- Những nghiên cứu trong nhà lới đợc tiến hành tại khu nhà lới Khoa Nông
học - Trờng ĐH NNI
3.1.3.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài đợc thực hiện từ 1/7/2006-15/1/2007
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Xác định chủng sinh lý của một số mẫu phân lập nấm Pyricularia
oryzae Cav.
3.2.2. Đánh giá khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae
Cav. của một số dòng giống lúa.

- Khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav. của
một số dòng, giống lúa khảo nghiệm.
- Khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav. của
một số giống lúa Việt Nam đang sử dụng trong sản xuất.
- Khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav. của
một số giống lúa Trung Quốc nhập nội đang sử dụng trong sản suất.
- Khả năng kháng một số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav. của
một số giống lúa từ Công ty giống cây trồng Nam Định.
3.2.3. Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm Pyricularia oryzae Cav. trên
một số môi trờng.
3.2.4. Khảo sát hiệu lực của thuốc Rabcide 30WP đối với nấm Pyricularia
oryzae Cav. và đối với bệnh đạo ôn
- Hiệu lực của thuốc Rabcide 30WP đối với nấm Pyricularia oryzae Cav.
trên môi trờng nhân tạo PSA.

23


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

- Hiệu lực của thuốc đối với bệnh.
+ Lây bệnh trớc - phun thuốc sau.
+ Phun thuốc trớc - lây bệnh sau.
3.3. Phơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Chuẩn bị dụng cụ nghiên cứu.
- Hộp petri rửa sạch, để khô sau đó gói vào giấy báo, tiếp tục khử trùng ở
nhiệt độ 150-1600 C trong 3 giờ.
- Các bình phun đợc rửa trớc và sau khi sử dụng.

- Các dụng cụ nh que cấy, đũa thuỷ tinh phải khử trùng trên ngọn lửa đèn
cồn trớc và sau khi cấy nấm.
3.3.2. Chuẩn bị môi trờng
Các môi trờng sau khi đợc pha chế và nấu xong thì cho vào 2/3 bình tam
giác 500 ml bọc giấy bạc và đợc khử trùng bằng nớc nóng. Khử trùng xong, phân
môi trờng ra các hộp petri, để nguội sau đó cho vào các túi nilon buộc chặt miệng
túi để chống nhện xâm nhiễm. Khi cần thì lấy ra sử dụng.
Đối với môi trờng nghiêng trong ống nghiệm, sau khi nấu môi trờng PSA
dùng bơm, bơm môi trờng vào từng ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 10 ml, sau đó
dậy nút rồi hấp khử trùng bằng hơi nớc nóng, sau khi hấp khử trùng để các ống
nghiệm nghiêng trên giá tạo mặt thạch nghiêng.
3.3.3. Phơng pháp lây bệnh nhân tạo
- Chuẩn bị nguồn bào tử: Chuẩn bị đĩa OMA hoặc cám Agar đã đợc khử
trùng để cấy nấm. Lấy nấm từ ống PSA cấy vào đĩa OMA, mỗi isolate cấy 2 đĩa,
mỗi đĩa cấy 3 điểm, đặt đĩa vào tủ 260 C trong 2 tuần, sợi nấm sẽ mọc kín đĩa môi
trờng.

24


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Vũ Quốc Huân CNSH-K48

- Lấy đĩa môi trờng ra khỏi tủ, dùng bình tia, tia nớc phun không ion vào,
dùng chổi lông quét lại nhiều lần trên mặt đĩa bằng bình tia cho hết sợi nấm, vảy
cho chổi hết nớc rồi quét cho khô mặt thạch. Mỗi isolate rửa bằng một chổi, rửa
xong đặt chổi trong nớc sôi.
- Đặt đĩa vào buồng sáng (12 giờ sáng, 12 giờ tối), mở nắp đĩa, đậy bằng
giấy nilon có lỗ, để đĩa ở buồng sáng tối 3 ngày).

- Pha nớc rửa bào tử: Nớc cất có Tween 20 nồng độ 1/10.000.
- Sau 3 ngày đa đĩa ra, cho 20 ml nớc rửa bào tử vào đĩa, rửa bào tử bằng
chổi lông. Đặt phễu trên bình tam giác loại 100 ml, đặt giấy lọc tha hoặc 2 lớp
vải màn lên phễu, lọc nớc rửa bào tử, rửa và lọc tử 2-3 lần sẽ đợc khoảng 60 ml
dung dịch bào tử, lọc xong, cho chổi, giấy lọc, phễu vào xoong nớc sôi, buộc thẻ
vào bình tam giác, ghi tên isolate. Mỗi isolate đợc rửa bằng một chổi và đợc lọc
bằng một phễu riêng, đựng trong một lọ riêng và có thẻ ghi tên isolate riêng,
tránh nhầm lẫn.
Lấy một giọt dung dịch bào tử ở mỗi bình nhỏ lên lam, đặt lam trên kính
hiển vi, đếm số bào tử trên một quang trờng, đếm 3 quang trờng.
- Chuẩn bị cây con: Gieo 20 hạt lúa trên một hộp, có lần nhắc lại, 21 ngày sau
khi gieo hạt cây lúa có từ 5-6 lá thì có thể sử dụng cho lây nhiễm bệnh.
- Lây nhiễm: Phun dung dịch bào tử ớt đều lá lúa, cắm thẻ thí nghiệm vào
khay lúa, đặt các khay lúa này trong buồng sơng hoặc trong buồng có ẩm độ >
90% trong thời gian 20 giờ, sau đó đa khay ra khỏi buồng sơng, đặt khay lúa vào
trong chậu nớc, hàng ngày kiểm tra nớc của các chậu có khay lúa, luôn luôn giữ
khay có đủ nớc.
3.3.4. Đánh giá
Sau lây nhiễm đợc 7 ngày kiểm tra mức độ bệnh của từng cây lúa, lá lúa.
Thang điểm đánh giá theo Kato (1993).

25