PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ENZYME PHYTASE VÀ ỨNG DỤNG CHÚNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHOA KHOA HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG
TỔNG HỢP ENZYME PHYTASE VÀ ỨNG DỤNG
CHÚNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS.TS CAO NGỌC ĐIỆP

PHẠM KHÁNH NGUYÊN HUÂN

VIỆN NC & PT CNSH

LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K31
MSSV: 3052826

Cần Thơ, Năm 2009


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

CHƯƠNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Phosphor (P) là thành phần

cấu trúc của acid Nucleic (DNA, RNA), màng

phosphorlipid, các hợp chất cao năng (như ATP, NADPH), xương..., vì thế
phosphor là một trong những nguyên tố có vai trò quan trọng đối với sinh vật. Nếu
thiếu phosphor, động vật sẽ chán ăn dẫn đến gầy còm, còi xương, giảm sinh sản.
Trong tự nhiên, phosphor tồn tại chủ yếu ở hai dạng là phosphor vô cơ khó tan nằm
trong các quặng thiên nhiên như apatit, phosphate sắt, phosphate nhôm,... và dạng
phosphor hữu cơ phức tạp có trong xác động vật, thực vật chủ yếu là acid nucleic,
acid phytic, phytate,... Cả hai dạng phosphor này sinh vật không thể hấp thu được
mà phải chuyển hóa về dạng phosphate tan (PO43-) thì cơ thể mới hấp thu được.
Muốn chuyển hóa được các hợp chất phosphor hữu cơ này phải nhờ hệ enzyme
phytase có trong động thực vật và vi sinh vật.
Enzyme phytase có tác dụng phá vỡ phức hợp phytic – là dạng dự trữ phosphor
trong nhiều loại ngũ cốc và đậu như đậu tương là 60%, ngô là 72% và lúa mì là 77%
(Phạm Thị Trân Châu, 2007) – và tăng khả năng tiêu hóa các phosphor thực vật
trong thức ăn cũng như giải phóng một số acid amin, tinh bột, calcium và các
nguyên tố vi lượng khác. Phytase là enzyme tự nhiên được sử dụng để làm tăng chất
lượng của thành phần thức ăn giàu acid phytic, giảm thấp sự bài tiết lân vào trong
phân thải từ đó hạn chế được ô nhiễm môi trường. Đồng thời, việc bổ sung phytase
còn giúp giảm lượng phosphate vô cơ dễ tiêu bổ sung vào thức ăn gia súc từ đó sẽ
giảm được chi phí thức ăn cho nhà chăn nuôi.
Mục tiêu của đề tài: phân lập và nhận diện một số dòng nấm mốc tổng hợp được
enzyme phytase và ứng dụng trực tiếp các dòng nấm này trong việc cải thiện phân
hữu cơ và bột đậu nành.

Trang 1

Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Acid phytic – phytate
Acid phytic (Myo-inositol hexakisphosphat) là một loại muối phosphor hữu cơ có
vai trò rất quan trọng đối với động vật cũng như thực vật, con người và vi khuẩn.
Phytate là muối của acid phytic. Acid phytic có nhiều trong các loại hạt ngũ cốc và
hạt phấn, nó được giải phóng trong suốt quá trình nảy mầm của hạt. Acid phytic là
thành phần dự trữ chính của phosphor, nguồn inositol và nhiều chất khoáng trong
cây. Acid phytic chiếm 75-80% lượng phosphor tổng trong các loại hạt và 1-5%
trọng lượng của các loại hạt dùng làm thực phẩm như hạt đậu, hạt ngũ cốc, và hạt có
dầu (Oh et al., 2004; Vohra et al., 2003).
Bảng 1: Hàm lượng Phytase Phosphorus và phosphor tổng trong thức ăn thực
vật (%)
Tên thức ăn

Bắp
Đại mạch
Tiểu ngạch
Lúa thóc
Khoai mì
Cao lương
Cám tiểu mạch
Lúa mì
Cám gạo nhuyễn
Bã cám gạo
Bã đậu

Bã gòn
Bã hạt cải

Hàm
lượng Hàm lượng Phytase Phytase
Phosphor tổng (%)
Phosphorus (%)
Phosphorus tổng
(%)
0,26
0,17
65,4
0,31
0,15
48,4
0,31
0,19
58,1
0,09
0,09
10,0
0,28
0,14
56,0
0,26
0,19
73,0
0,92
0,68
73,9

0,48
0,34
70,1
1,77
1,33
75,1
1,82
1,58
86,8
1,40
0,57
40,4
0,97
0,63
64,9
1,01
0,63
62,4

(Viện chăn nuôi Việt Nam 2009)

Trong tự nhiên, acid phytic tồn tại chủ yếu trong các dạng muối phytate dưới dạng
phức hợp với các cation quan trọng cho dinh dưỡng như Ca2+, Zn2+ và Fe2+. Vì vậy,
khi nói về acid phytic thì thường dùng thuật ngữ phytate. Phytate chứa 14-25%

Trang 2


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

phosphor, 12-2% Canxi, 1-2% kẽm và sắt. Hổn hợp muối Ca-Mg của acid phytic
được gọi là phytin.
2.2 Phytase là gì?
Phytase là một enzyme có thể giải phóng phytate được đính phosphor để sử dụng
trong đường tiêu hoá của vật nuôi dạ dày đơn. Bổ sung phytase vào thức ăn vật nuôi
có thể làm giảm nhu cầu cung cấp lân vô cơ như dicalcium phosphate và giảm thấp
sự bài tiết lân vào trong phân thải, từ đó hạn chế được ô nhiễm lân vào trong đất và
trong nước ngầm.
Phytase (Myo- Inositol hexakisphosphat phosphorhydrolase) là một enzyme đặc biệt
của lớp enzyme phosphatase xúc tác thủy phân nối phosphormonoester của acid
phytic (Myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis dihydrogen phosphate hay Myo-inositol
hexakisphosphate) giải phóng orthophosphate vô cơ và các dẫn xuất Myo-inositol
chứa ít nhóm phosphate hơn, có thể thành Myo-inositol tự do (Oh et al., 2004;
Vohra et al., 2003) (Hình 1).

Hình 1. Cơ chế thủy phân phosphate hữu cơ bởi phytase

Trang 3


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Nhóm photphate được giải phóng có thể gắn với thuốc thử molypdate hình thành
phosphormolybdenum màu xanh lam có thể phát hiện được bằng phép so màu theo
phương pháp Oniani (Vohra et al., 2003).
Phytase phân hủy acid phytic và phytate để giải phóng ra acid phosphoride, inositol,

nguyên tố khoáng, protein, acid amin, tinh bột và liposome. Phytase không chỉ là
một loại enzyme có tác dụng phá vỡ phức hợp phytic, tăng khả năng tiêu hóa các
phosphor thực vật trong thức ăn, giải phóng một số acid amin, tinh bột, calcium và
các nguyên tố vi lượng khác mà phytase còn giúp giảm lượng phosphor vô cơ sử
dụng và do đó sẽ giảm được chi phí thức ăn.
2.3 Nấm mốc sản xuất phytase
2.3.1 Sơ lược về đặc điểm hình thái của một số loại nấm mốc có khả năng tổng
hợp phytase (Cao Ngọc Điệp, 2006)
2.3.1.1 Aspergillus
Chi Aspergillus thuộc ngành phụ Nấm Nang (Ascomycotina). Chi này có khoảng
200 loài và phát tán khắp nơi trong tự nhiên.
Khuẩn ty Aspergillus có vách ngăn hoàn chỉnh và phân nhánh. Nhiều khuẩn
ty phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng. Khuẩn ty khi
đứt thành khúc thì mỗi khúc hay đoạn có thể phát triển cho ra một khuẩn ty
mới.
Khuẩn ty hình thành một cọng mang túi bào tử (conidiophore) và bào tử đính
(conidia) với cọng mang túi bào tử không vách ngăn và không xuất phát từ tế bào
chân (foot cell). Túi hay bọng (vesicle) là tế bào đa nhân và phát triển bề mặt gắn
liền với thể bình (phialide hay sterigmata) (hình 2). Thể bình với bậc 1 hay bậc 2,
mỗi thể bình là cấu trúc đa nhân và trên đầu thể bình tạo thành một chuổi bào tử
đính, những bào tử non ở trong và càng xa càng già; bào tử trưởng thành sẽ phóng
thích vào không khí và nẩy mầm (hình 3).

Trang 4


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

(Cao Ngọc Điệp, 2006)

Hình 2: Khuẩn ty, cọng bào tử, túi và thể bình ở Aspergillus

(Cao Ngọc Điệp, 2006)

Hình 3: Cọng bào tử, túi và bào tử đính ở Aspergillus
Trang 5


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.3.1.2 Penicillium
Penicillium cũng thuộc ngành phụ Nấm Nang (ascomycotina) với khoảng 100 loài.
Khuẩn ty của Penicillium phân nhánh, nhiều khuẩn ty có vách ngăn ngang và
chính khuẩn ty này có khả năng hấp thu chất dinh dưỡng để tạo ra cọng bào tử và
đính bào tử; mỗi đoạn khuẩn ty có thể phát triển thành sợi khuẩn ty mới.
Penicillium sinh sản vô tính với cọng bào tử và đính bào tử, cọng bào tử có thể
không phân nhánh, phân nhánh bậc 1, 2 hay 3.... và tận cùng của cọng bào tử là các
thể bình, nếu cọng bào tử không phân nhánh thì tận cùng là các thể bình và các
chuỗi đính bào tử giống như cây cọ vẽ của các hoạ sĩ nên còn gọi là thể bình vẽ
(metulae), cán (ramus) và cọ vẽ (penicillus) (hình 4). Đính bào tử có dạng tròn
có vách láng hay xần xùi, chỉ có đơn nhân nhưng cũng có khi chúng có đa nhân.
Penicillium có đính bào tử mang màu xanh đặc trưng và phát tán dể dàng bởi gió.

(Cao Ngọc Điệp, 2006)

Hình 4: Cọng bào tử, đính bào tử cán, thể bình vẽ, thể bình của Penicillium

Trang 6


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Bảng 2: Sự khác biệt giữa hai chi Aspergillus và Penicillium
Chi Aspergillus

Chi Penicillium

- Cọng bào tử không phân chia và

- Cọng bào tử phân chia và có vách ngăn

không có vách ngăn ngang

ngang

- Cọng bào tử phát triển từ một tế bào

- Cọng bào tử phát triển từ một vài tế

gọi là tế bào chân

bào của khuẩn ty, không có tế bào chân

- Mỗi cọng bào tử mở rộng trong một túi

- Túi không hình thành ở đầu cọng bào

tận đầu

tử và phát triển thành cọ vẽ

- Cán không hiện diện bên dưới thể - Cán hiện diện bên dưới thể bình
bình
- Đính bào tử trưởng thành có màu

- Đính bào tử có màu xanh lục

vàng, nâu, đen
- Vách của tử nang cầu dày

- Vách của tử nang cầu mỏng hơn

2.3.1.3 Rhizopus

(Cao Ngọc Điệp, 2006)

Hình 5: Các loại khuẩn ty ở Rhizopus - Khuẩn căn (rhizoids), khuẩn ngang
(stolon) và cọng bào tử (sporangiophores).

Trang 7


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Rhizopus thuộc ngành phụ Nấm tiếp hợp (Zygomycotina) với khoảng 120 loài.
Khuẩn ty thường có màu trắng, phân nhánh, đa nhân và không có vách ngăn ngang.
Khi còn non khuẩn ty có dạng sợi như bông vải, khi phát triển sâu vào cơ chất thì
phân chia thành ba dạng khuẩn ty là khuẩn căn, khuẩn ngang và cọng bào tử (hình
5).
Khuẩn căn là khuẩn ty ăn vào cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng.
Khuẩn ngang là khuẩn ty phát triển theo chiều ngang, trên mặt cơ chất nối
từng nhóm nấm với nhau.
Cọng mang túi bào tử là khuẩn ty mọc thẳng lên không, chúng phát triển từ
trung tâm điểm xuất phát của khuẩn căn và khuẩn ngang. Từ một điểm mọc lên
nhiều cọng bào tử.
Đặc tính của Aspergillus là hình thành những cọng mang bọc bào tử
(sporangiophores) và túi (bọc) bào tử (sporangium). Bào tử không có roi, gần
như tròn, đồng nhất, đa nhân nằm trong túi màu đen gọi là túi bào tử. Một túi bào
tử phát triển đơn độc và tận cùng của cọng mang bọc bào tử và bọc bào tử có màu
đen nên còn gọi là mốc đen.
2.3.1.4 Mucor
Mucor cũng thuộc ngành phụ Nấm tiếp hợp (Zygomycotina).
Nấm Mucor sinh sản vô tính như nấm Rhizopus bằng cách thành lập cọng mang
bọc bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore).
Cọng mang bọc bào tử với những bào tử bất động hình thành trong cái bao hay
bọc bào tử (sporangia); mỗi bọc bào tử phát triển tận ngọn, không phân nhánh và
cọng mang bọc bào tử phát triển riêng biệt, không cùng nhóm (hình 6). Một số loài
cá biệt có thể mang bọc bào tử phân nhánh như Mucor racemosus và Mucor
plumbeus.
Trong tế bào chất chứa nhiều nhân nhưng ở bào tử chỉ có 1 nhân, túi bào tử đổi
sang màu nâu khi bào tử trưởng thành và dễ dàng vỡ ra để phóng thích bào tử
theo gió hoặc bám vào chân côn trùng để phát tán.

Trang 8


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

(Cao Ngọc Điệp, 2006)

Hình 6: Cọng mang bọc bào tử với 1 bọc bào tử ở Mucor

Bảng 3: Sự khác biệt giữa hai chi Rhizopus và Mucor
Chi Rhizopus

Chi Mucor

- Có khuẩn căn

- Không có khuẩn căn

- Có khuẩn ngang

- Không có khuẩn ngang

- Thức ăn được hấp thu từ khuẩn căn

- Thức ăn được hấp thu từ bề mặt
khuẩn ty

- Cọng bào tử phát triển riêng

- Cọng bào tử phát triển riêng biệt và

biệt với khuẩn căn

không cùng tập hợp thành nhóm

- Bào tử dính trên cuống bào tử và - Bào tử dễ phát tán theo gió
khó phân tán

Trang 9


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.3.2 Một số nấm mốc tổng hợp phytase
Một số nhóm Aspergillus niger sản xuất phytase ngoại bào có thể cắt phosphor từ
Calcium phytate trong môi trường axit. Được phân lập từ đất A. ficuum NRRL 3135
sản xuất hầu hết phytase có hoạt tính trong môi trường tinh bột ngô. Việc sản xuất
phytase bị ức chế một cách mạnh mẽ bởi phosphate vô cơ và tỉ lệ C/P trong môi
trường (Shieh và Ware, 1968). Hơn 2000 loài được phân lập từ 68 mẫu đất trong
môi trường giàu dinh dưỡng. Hoạt tính của phytase ngoại bào được tìm thấy trong
một vài nấm mốc khác nhau đã được kiểm tra trên môi trường (Shieh và Ware,
1968).
Bảng 4: Những loài Aspergillus phân lập từ đất sản xuất phytase ngoại bào có
hoạt tính

Loài

Số lượng test trên
môi trường

Số lượng sản
phẩm Phytase
sinh ra

6
10
3
4
7
10
2
3
2
2
3
1
22
2
3

0
2
0
0
0
0

0
1
1
0
0
0
21
0
3

A. Fumigatus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. Flavus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. Flavipes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. Clavatus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. glaucus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. nidulans. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
A. ochraceus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. versicolor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. terreus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. ustus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. wentii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. restrictus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. niger. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. candidus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Aspergillus speceisα. . . . . . . . . . . . . . . .
(Shieh và Ware, 1968)

Hoạt tính của phytase ngoại bào được quan sát với 28 trong 82 loài Aspergillus spp.,
1 trong 58 loài Penicillium spp., 1 trong 37 loài Mucor spp., không có trong 13 loài
Rhizopus, 4 loài Cunninghamella, 4 loài Neurospora, 140 loài nấm men thì thể hiện

17 giống và 56 loài vi khuẩn thì chỉ thể hiện hoạt tính của enzyme phytase ngoại bào
Trang 10


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

là 18 loài. Tuy nhiên, có nhiều loài sản xuất enzyme nội bào có hoạt tính. Trong số
30 loài nấm mốc có khả năng cắt calcium phytate có 28 loài là Aspergillus. Nhóm
hoạt động mạnh nhất là A. niger (Shieh và Ware, 1968) (bảng 4).
Bảng 5: Một vài chủng Aspergillus khác có khả năng sản xuất phytase ngoại
bào
Loài khác của Aspergillus
A. niger ATCC 9142
A. niger ATCC 10864
A. niger van Tieghem
A. niger var. Cinnamoneum NRRL 348
A. niger japonicus saito ATCC 1034
A. niger NRRL 372
A. niger NRRL 326
A. niger NRRL 330
A. niger NRRL 4361
A. niger NRRL 337
A. awamori ATCC 11382
A. awamori ATCC 11358
A. saitoi ATCC 11362
A. carbonarius NRRL 368
A. carbonarius PCC 104
A. tubingensis NRRL 4875

A. ficuum WB 4016
A. ficuum WB 320
A. ficuum WB 364
A. ficuum WB 4541
A. ficuum WB 4781
A. ficuum NRRL 3135 (phân lập từ đất)
A. niger X (phân lập từ đất)
A. niger K (phân lập từ đất)

Hoạt tính
(units/ml)
2,1
0,8
3,5
1,4
0,6
1,0
0,7
0,8
0,7
0,5
2,3
3,3
1,8
1,9
1,5
2,4
1,1
1,0
1,5

1,0
1,2
10,5
5,0
4,0

(Shieh và Ware, 1968)

Nhiều loài khác của Aspergillus sản xuất một số lượng phytase nội bào có hoạt tính
nhưng không đáng kể. Số lượng phytase ngoại bào được sản xuất bởi những chủng
khác của Aspergillus được thể hiện trong bảng 5. Nhiều loài được phân lập từ đất có
thể tạo được halo trên môi trường có calcium phytate là A. niger, A. ficuum NRRL

Trang 11


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3135 là loài được quan tâm nhất bởi vì nó không hình thành bào tử trên hầu hết môi
trường và sản xuất lượng lớn phytase có hoạt tính cao nhất (Shieh và Ware, 1968).
* Ảnh hưởng của phosphate đến việc sản xuất phytase ngoại bào trên A. ficuum
NRRL 3135
Khi những loại đường như glucose, sucrose được sử dụng như là nguồn carbon thì
người ta quan sát thấy hệ khuẩn ty dạng sợi hình thành và làm giảm sản lượng
phytase sinh ra. Khi sử dụng bột bắp thì hệ sợi phát triển giảm và lượng phytase cao.
Lượng phytase chứa trong bột bắp khác nhau phụ thuộc vào lượng phosphor và cũng
khác nhau ở những vùng khác nhau (bảng 6). Sự phát triển của nấm mốc tăng khi
tăng hàm lượng phosphate, nhưng sự tổng hợp phytase thì giảm một cách mạnh mẽ

khi tăng hàm lượng phosphate bổ sung vào môi trường. Sự ức chế quá trình tổng
hợp phytase bằng phosphate là một hiện tượng chung, điều này được quan sát ở tất
cả các loài nấm mốc và nấm men (Shieh và Ware, 1968).
Bảng 6: Ảnh hưởng của hàm lượng phosphate lên sự tổng hợp phytase của
Aspergillus ficuum NRRL 3135
Số lượng mẫu

Hàm lượng P tổng (%)

Hoạt tính (units/ml)

15

0,10

6,4

14

0,17

6,0

5

0,24

1,5

8

0,28

0,52

1

0,29

0,52

9

0,30

0,40

6

0,31

0,48

7

0,32

0,40

4

0,44

0,16

3

0,69

0,15

2

0,70

0,15

(Shieh và Ware, 1968)

Trang 12


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Bảng 7: Ảnh hưởng của tỉ lệ C/Pb lên việc sản xuất phytase của Aspergillus
ficuum NRRL 3135α+

Bột ngô

Phosphor
(mg/100ml)

2%

4%

8%

C/pb

Units/ml

C/pb

Units/ml

C/pb

Units/ml

6

148

0

296

1,1

532

10,8

4

222

0

444

1,9

882

11,4

3

296

0,10

592

1,9

1,184

12,7

2

444

0,65

888

2,3

1,776

9,7

1

888

1,30

1,976

1,9

3,552

10,8

0.4

2,220

1,10

4,440

1,2

8,880

12,7

(Shieh và Ware, 1968)

Sự hiện diện của phytase được giới hạn bởi phosphate vô cơ và hàm lượng carbon
trong môi trường. Việc sản xuất phytase trong môi trường có bột ngô tăng khi tăng tỉ
lệ C/Pb (bảng 5) (Shieh và Ware, 1968).
A. ficuum NRRL 3135 sản xuất hầu hết phytase có hoạt tính khi lượng phosphate vô
cơ kém hơn 0,004%(w/v) trong môi trường chứa 8%(w/v) bột ngô. Khi lượng
phytase được tạo ra thì lượng phosphate vô cơ trong môi trường bị giới hạn (Shieh
và Ware, 1968).
Một thông báo chỉ ra rằng enzyme phytase được tinh sạch từ nhiều dòng khác nhau.
Nhũng dòng có đặc điểm tốt nhất là Aspergillus ficuum và A. niger. Gen tổng hợp
enzyme phytase của những dòng Aspergillus niger, A. fumigatus, A. terrus, A.
nidulans, Myceliophthora thermophila, và Talaromyces thermophila đã được nhân
dòng và giãi trình tự (Jane et al., 2007).

Trang 13


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.4 Các ứng dụng thực tế của enzyme phytase
2.4.1 Trong công nghiệp thức ăn gia súc
Chiếm một tỉ lệ lớn trong thức ăn gia súc là thành phần thức ăn có nguồn gốc thực
vật như bắp, đậu,... Khoảng 2/3 hàm lượng phosphor trong thức ăn có nguồn gốc
thực vật là acid phytic hiện diện dưới dạng phytate. Do đó, phosphor trong phytate
hầu như không có giá trị dinh dưỡng trong thức ăn của gia súc (Nelson, 1967). Hơn
nữa, phytate liên kết với các ion có giá trị dinh dưỡng cao vì thế hạn chế giá trị dinh
dưỡng của các ion này.
Động vật nhai lại tiêu hóa phytate thông qua hoạt động của enzyme phytase tiết ra từ
hệ vi sinh vật trong dạ cỏ. Phosphate vô cơ được giải phóng từ phytate bởi phytase
được cả hệ vi sinh vật dạ cỏ và động vật chủ sử dụng. Tuy nhiên, các động vật có dạ
dày một ngăn lớn, gia cầm và cá lại không thể biến dưỡng acid phytic vì chúng thiếu
phytase ở hệ ruột và dạ dày. Do đó, người ta thêm phosphate vô cơ, bột đậu nành và
các loại bột có hàm lượng phosphor tổng cao vào thức ăn gia súc để đáp ứng nhu
cầu phosphate của cơ thể động vật. Việc này làm tăng chi phí cho các nhà chăn nuôi
gia súc và tăng ô nhiễm môi trường. Các vấn đề này có thể được giải quyết bằng
cách bổ sung phytase vi sinh vật vào thức ăn gia súc hoặc dùng các loại ngũ cốc có
hàm lượng phytase cao làm thức ăn gia súc.
Wodzinski và Ullah (1996) đã đưa ra con số thống kê rằng nếu dùng phytase để bổ
sung vào thức ăn gia súc của tất cả vật nuôi ở Mỹ thì phosphor được giải phóng sẽ
tương ứng với 168 triệu USD và sẽ giảm được 8,23x104 tấn phosphor thải ra môi
trường mỗi năm. Cục Quản Lý Thuốc và Thực Phẩm (FDA – The Food và Drug
Administration) đã công nhận chế phẩm phytase đạt tiêu chuẩn GRAS (Generally

Regarded As Safe) (Wodzinski và Ullah, 1996; Kerovuo, 2000).
2.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm
Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu là các loại nguyên liệu phổ biến trong chế biến
thực phẩm. Điều này dẫn đến một lượng lớn phosphate được đưa vào trong cơ thể

Trang 14


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

con người. Phytate trong hệ ruột không được tiêu hóa sẽ tác động xấu đến sự hấp thu
kẽm, calcium, magie và sắt. Hơn nữa, nó còn ức chế hoạt động của enzyme tiêu hóa.
Do đó, việc bổ sung phytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có ý nghĩa lớn
(Kerovuo, 2000).
Phytase đã được bổ sung vào quá trình chế biến bột mì để làm giảm lượng acid
phytic trong các loại bánh dùng bột mì (trong bánh mì, acid phytic chiếm 0,29% 1,05% (w/w)). Phytase thích hợp cho quá trình này cần có pH tối ưu ở 4,5 – 5,0,
nhiệt độ tối ưu 300C và không phụ thuộc vào ion Ca2+.
Các loại nấm mốc dùng trong chế biến thực phẩm lên men phương Đông được cho
biết là tiết phytase. Tempeh là một loại thực phẩm lên men phổ biến của người dân
Indonesia được làm từ đậu nành ủ với nấm mốc Rhizopus oligosporus, nấm này có
tiết phytase và làm tăng mùi, tăng hàm lượng vitamin và tăng khả năng tiêu hóa của
đậu nành.
Phytase đã được bổ sung vào quá trình chế biến nước chiết bắp (corn steep liquor),
rút ngắn được thời gian ngâm bắp (Kerovuo, 2000).
2.4.3 Các ứng dụng khác
Ngoài các ứng dụng trên, phytase còn được dùng trong chế biến thức ăn cá để làm
giảm lượng phosphor thải ra môi trường nước và giảm chi phí bổ sung phosphate vô
cơ vào thức ăn cá (Kerovuo, 2000).

Phytase được dùng để cải thiện chất lượng đất, vì có những nơi acid phytic và các
dẫn xuất của nó chiếm đến 50% tổng lượng phosphor hữu cơ trong đất. Việc bổ
sung phytase vào đất làm tăng làm hàm lượng phosphor vô cơ trong đất giúp cây
tăng trưởng nhanh hơn và giảm chi phí dùng phân bón phosphor cho nhà nông
(Vohra et al., 2003).
Các phytase vi sinh vật là loại phytase tốt nhất cho các ứng dụng công nghiệp
(Kerovuo, 2000). Khi ứng dụng phytase trong sản xuất, việc dùng kết hợp phytase từ
nguồn khác nhau không mang lại hiệu quả cao bằng một loại phytase duy nhất. Tuy

Trang 15


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

nhiên, phytase sẽ hoạt động hiệu quả hơn khi kết hợp với các enzyme thủy phân
khác (Casey và Walh, 2002).

Trang 16


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

PHẦN III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật – Viện Nghiên cứu và

phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian thực hiện
Từ tháng 04/2009 đến tháng 07/2009.
3.2 Phương tiện
3.2.1 Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng phương tiện nghiên cứu có tại Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ
Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
* Thiết bị, dụng cụ nhân giống Vi sinh vật
- Tủ lạnh
- Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức)
- Tủ cấy vi sinh vật (Pháp)
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi- international (Đức)
- Máy đun nóng
- Máy quang phổ spectronic 20
- Bộ micropipette P10, P20, P100,P1000 (Đức)
- Tủ sấy EHRET (Đức)
- pH kế Orion 420A (Mỹ)
- Kính hiển vi quang học Olympus CH-2

Trang 17


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

- Đĩa petri, ống nghiệm, bình Erlenmeyer 100ml-500ml, bình tam giác, cốc
đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh
- Đèn cồn, que cấy, tiêm bơm, bộ lọc vi khuẩn

- Cân điện tủ Sartorius (Đức)
- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu
3.2.2 Vật liệu thí nghiệm
Các mẫu thức ăn, phân gia cầm, đất... thu thập tại điểm quận Bình Thủy và huyện
Phong Điền, Cần Thơ.
Bột đậu nành sử dụng làm thức ăn gia súc có nguồn gốc từ Cty TNHH Thức ăn Gia
súc Kiến Thành, Sa Đéc, Đồng Tháp.
Phân hữu cơ hiệu Fofer 33 sản xuất tại Cơ Sở VAC, TP.Mỹ Tho, Tiền Giang (hình
7). Được sản xuất từ cá, than bùn hoạt hóa, bánh dầu. Thành phần dinh dưỡng: N2 =
3%, P2O5 = 3%, K2O = 3%, CaO = 1%, humat = 2%, các vi lượng Cu, Zn, Mn,
Bo... từ 100 đến 1000ppm; các acid amin và vitamin thiết yếu.

Hình 7: Phân hữu cơ sử dụng cho thí nghiệm

Trang 18


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.2.3 Hóa chất và môi trường
* Hóa chất dùng pha môi trường phân lập nấm mốc
Môi trường đặc M2 (pH = 7)
+ Na2S2O3.5H2O

10g/l

+ Glucose

8g/l

+ MgCl2.6H2O

1g/l

+ NH4Cl

0,3g/l

+ FeCl3.6H2O

0,04g/l

+ Trace element

1ml/l

+ Sodium phytate

3g/l

+ Biotin/ yeast extract

0,01g/l

+ CaCl2.2H2O

5g/l

+ Agar

20g/l

* Hóa chất dùng pha môi trường nhân nuôi nấm mốc
Môi trường bột đậu dạng lỏng để nhân mật số (pH = 5,5)
+ Bột đậu

5g/l

+ Sucrose

10g/l

+ Asparagine

1g/l

+ MgSO4.7H2O

0,5g/l

+ KCl

0,5g/l

+ FeSO4

0,01g/l

+ MnSO4

0,01g/l

Trang 19


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập nấm mốc trên môi trường có phytate
Tiến hành phân lập các dòng nấm mốc sinh phytase từ các mẫu thức ăn, phân gia
cầm, đất... thu thập được.
Phương pháp phân lập:
Ủ các mẫu thu thập trên môi trường M2. M2 là môi trường dinh dưỡng có bổ sung
phytase như là nguồn phosphor duy nhất. Vì phytate không tan nên làm cho môi
trường M2 có màu trắng đục.
Chỉ những dòng nấm mốc nào có khả năng sử dụng phytate trong môi trường tức là
có thể tổng hợp phytase mới có thể phát triển trên môi trường này. Khi tổng hợp
phytase hòa tan phytate nên làm cho một vùng môi trường trở nên trong, vùng đó
gọi là halo.
Những dòng nấm mốc có khả năng sinh phytase sẽ tạo ra halo lớn, phytase sinh ra
càng nhiều thì vùng halo càng lớn. Căn cứ vào kích thước halo này để chọn những
dòng nấm mốc sinh nhiều phytase cho các thí nghiệm về sau.
Cấy chuyển từ 3 đến 4 lần trên môi trường M2 nhằm làm cho các dòng nấm mốc đạt
độ ròng.
Cấy riêng lẻ các dòng nấm mốc vào môi trường đặc, sau 16h sẽ tiến hành đo kích
thướt halo và so sánh với nhau.

3.3.2 Định danh những dòng nấm mốc
Sau khi phân lập tiến hành định danh.
Phương pháp:
Ủ các dòng nấm mốc đã phân lập được trên môi trường đặc (M2) tới giai đoạn phát
sinh bào tử.

Trang 20


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học, căn cứ vào đặc điểm hình thái để
nhận diện các chi nấm mốc.
3.3.3 Thí nghiệm đánh giá khả năng hòa tan lân hữu cơ
Chọn 2 dòng nấm mốc tạo halo lớn để tiếp tục nhân giống trong môi trường dịch
đậu nành, lắc trong 3 ngày. Sau đó chủng vào hai đối tượng là phân hữu cơ và bột
đậu nành (Bảng 8).
Bảng 8: Bố trí thí nghiệm
Nghiệm thức
NT1 (đối
chứng 1)

Diễn giải
Bột đậu nành với nước cất vô trùng

NT2

Bột đậu nành với dung dịch chứa nấm mốc 1 theo tỉ lệ 3 đậu nành –

1 dung dịch

NT3

Bột đậu nành với dung dịch chứa nấm mốc 2 theo tỉ lệ 3 đậu nành –
1 dung dịch

NT4 (đối
chứng 2)

Phân hữu cơ với nước cất vô trùng

NT5

Phân hữu cơ với dung dịch chứa nấm mốc 1 theo tỉ lệ 3 phân – 1
dung dịch

NT6

Phân hữu cơ với dung dịch chứa nấm mốc 2 theo tỉ lệ 3 phân – 1
dung dịch

 Cách chủng
Chủng nấm mốc với phân hữu cơ và bột đậu nành theo tỉ lệ 3:1 (3 cơ chất : 1
dung dịch nấm mốc).
Chuẩn bị hộp nhựa hoặc bọc nylon vô trùng. Cân 450g cơ chất và 150ml dịch
nấm mốc đã chuẩn bị trước.
Đối với phân hữu cơ cho vào 1 lần đậy kín, ủ trong 20 ngày.

Trang 21

Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Đối với mẫu đậu nành thì chia đậu nành và dung dich nấm thành 5 phần đều
nhau. Cách 2 ngày thêm vào 1 phần. Mỗi lần rải thành 1 lớp đậu nành rồi rưới đều
dịch nấm mốc lên bề mặt theo tỉ lệ 3:1 đã nêu. Đậy nấp không kín và ủ cho đến ngày
thứ 15 kể từ lần cho đầu tiên.
Khi đó độ ẩm biểu kiến đạt 30%.
Theo dõi các chỉ tiêu: phosphor dễ tiêu (PO43-), đạm dễ tiêu, calcium. So sánh các
nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn với nghiệm thức đối chứng không có bổ sung vi
khuẩn, nếu hàm lượng các chỉ tiêu theo dõi trong các nghiệm thức có bổ sung vi
khuẩn cao hơn nghiệm thức đối chứng (NT3 và NT4) chứng tỏ các dòng nấm mốc
có khả năng hòa tan lân hữu cơ hay có khả năng tổng hợp enzyme phytase.
 Đối với mẫu phân hữu cơ
Khảo sát chỉ tiêu lân hòa tan bằng phương pháp Oniani
Phương pháp này dựa trên nguyên lý hòa tan các dạng chất photpho trong phân
hữu cơ bằng dung dịch H2SO4 0.1N với tỉ lệ 1:25 (1 phân hữu cơ : 25 dung môi), lắc
trong 3 phút.
Hàm lượng photpho trong dung dịch được xác định bằng phương pháp trắc
quang với “màu xanh molypden”.
Tiến hành:
Cân chính xác 1g phân cho vào ống ly tâm 50ml, thêm vào 25ml H2SO4,
dùng tay lắc 1 phút và để yên trong 5 phút.
Dùng pipet hút từ 1-5 ml dung dịch trong cho vào bình định mức 50ml. Thêm
vào 20ml nước cất, nhỏ 3 giọt phenolphtalein, dùng NaOH 10% nhỏ từng giọt lắc
đều cho tới khi dung dịch có màu hồng nhạt sau đó dùng dung dịch H2SO4 5% nhỏ
từ 1 – 2 giọt lắc đều đến khi mất màu. Tiếp tục thêm 8ml dung dịch B để làm hiện

màu, lên thể tích bằng nước cất tới vạch và lắc đều, để yên 10 – 20 phút đem đo trên

Trang 22


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

máy so màu ở bước sóng 880nm. (Chuẩn bị mẫu blank giống như thật nhưng không
có mẫu phân hữu cơ).
Đường chuẩn: từ dung dịch chuẩn 0,1 mg/ml P2O5, hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5
ml cho vào bình định mức 5ml, thêm vào 20ml nước cất và cho hóa chất làm giống
dung dịch trích, đo trên máy đo OD ở bước sóng 880nm.
Cách tính kết quả
P2O5 (mg/1g mẫu khô)= a  v 100  k/(%m  vi)
Trong đó:
a (mg): Số P2O5 tìm đo trên đồ thị
v (ml): Thể tích dung dịch trích P dễ tiêu trong đất
Vi (ml): Thể tích dịch trích mang đi so màu
K: hệ số khô kiệt của mẫu.
 Đối với mẫu bột đậu nành
Khảo sát các chỉ tiêu protein dễ tiêu bằng phương pháp Kjeldahl, đo lân hòa tan
bằng phương pháp so mẫu còn calcium được đo bằng phương pháp ASS.

Trang 23


Luận văn tốt nghiệp Cử nhân CNSH K31
Đại học Cần Thơ

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập nấm mốc trên môi trường có phytate
Kết quả phân lập được tám dòng nấm mốc có khả năng phát triển trên môi
trường phytate.
Trong số tám dòng nấm mốc này có bảy dòng tạo halo (bảng 9).

Bảng 9: Kết quả tạo halo trên môi trường đặc
Dòng

Halo

1

Có

2

Có

3

Có

4

Có

5

Có

6

Có

7

Có

8

Không

Bảy dòng nấm mốc (từ 1 tới 7) có khả năng tạo halo trên môi trường với phytate là
nguồn phosphor duy nhất chứng tỏ chúng có khả năng sản sinh enzyme phytase.
Hai dòng 6 và 7 tạo halo lớn nhất chứng tỏ chúng có khả năng sản xuất phytase
nhiều nhất sẽ được chọn để nhân giống trong môi trường lỏng dùng cho các thí
nghiệm tiếp theo.

Trang 24