phân lập một số dòng vi khuẩn cố đinh Đạm Azospirillum trên Lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC
œ&•






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC




PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CỐ
ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ HOÀNG THĂNG
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA 30

Năm 2008


Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
LỜI CẢM TẠ
-------------–˜™—-------------
Sau bốn năm học tập, rèn luyện tại Trường Đại Học Cần Thơ và
được thực hiện đề tài tốt nghiệp, với sự hướng dẫn và động viên tận tình của quý
Thầy, Cô và sự giúp đỡ của bạn bè, đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp
đại học ngành Công Nghệ Sinh Học, dù phải gặp rất nhiều khó khăn trở ngại. Tôi
xin trân trọng cảm ơn:
- Thầy PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Trưởng Bộ môn Vi Sinh Vật,
Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ
đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian học tập và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
- Thầy Thạc Sĩ Trần Nhân Dũng - Viện Nghiên Cứu và PhátTtriển
Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ đã chỉ dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ
dụng cụ thí nghiệm cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- Cử nhân Phạm Thị Khánh Vân, Cử nhân Nguyễn Thị Phương Tâm,
cán bộ nghiên cứu, Bộ môn Vi sinh vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công
Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt thời
gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- Quý Thầy Cô Bộ Môn Sinh - Khoa Khoa Học, Viện Nghiên Cứu
và Phát Triển Công nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt kiến
thức, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện Nghiên Cứu và
Phát Triển Công Nghệ Sinh Học,Trường Đại Học Cần Thơ.
- Xin ghi ơn Cha mẹ và gia đình những người đã sinh thành, nuôi
dưỡng, giúp đỡ, động viên, chia sẽ những khó khăn cũng như tạo mọi điều kiện

tốt nhất giúp tôi học tập và thực hiện đề tài này.
- Bạn Nguyễn Như Phương và Bùi Việt Sang lớp Công Nghệ Sinh
Học Khóa 30, đã luôn động viên và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong quá
trình thực hiện đề tài.
LÊ HOÀNG THĂNG
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
MỤC LỤC
TÓM LƯỢC...........................................................................................Trang 1
ABSTRACT ...........................................................................................Trang 1
PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................Trang 2
PHẦN II – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
I. Giới thiệu về cây lúa
1. Oryza satival L...............................................................Trang 4
2. Oryza rufipogon Griff.....................................................Trang 4
3. Đặc điểm sinh trưởng của lúa.........................................Trang 4
4. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam...........................Trang 4
II. Tầm quan trọng của đạm đối với lúa.........................................Trang 5
III. Sự cố định đạm sinh học.........................................................Trang 6
IV. Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp
1. Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum ...................................Trang 7
2. Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum
. ...........................................................................................Trang 9
V. Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử.
1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)..................Trang 10
2. Điện di agarose gel........................................................Trang 11
PHẦN III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
I. Địa điểm và thời gian.
1. Địa điểm........................................................................Trang 12
2. Thời gian.......................................................................Trang 12
II. Vật liệu thí nghiệm..................................................................Trang 12

III. Phương tiện
1.Phương tiện để phân lập vi khuẩn...................................Trang 12
2.Phương tiện trích DNA, thực hiện phản ứng PCR, điện di
..........................................................................................Trang 13
IV. Hóa chất.
1. Hóa chất để phân lập vi khuẩn.......................................Trang 13
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2. Hóa chất nhuộm Gram...................................................Trang 14
3. Hóa chất trích DNA.......................................................Trang 14
4. Hóa chất thực hiện phản ứng PCR.................................Trang 15
5. Hóa chất điện di.............................................................Trang 15
V. Phương pháp.
1. Phân lập vi khuẩn Azospirillum......................................Trang 15
2. Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn................Trang 17
3. Nhuộm Gram.................................................................Trang 17
4. Đo kích thước tế bào vi khuẩn.......................................Trang 18
5. Trích nhanh DNA từ vi khuẩn Azospirillum...................Trang 19
6. Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập
bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)........Trang 19
PHẦN IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
I. Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum
1. Nguồn gốc cây chủ, thời gian tăng trưởng và đặc điểm môi
trường nuôi cấy các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập
được............................................................................ Trang 21
2. Màu sắc khuẩn lạc, màu môi trường, hình dạng và kích thước
của các dòng vi khuẩn đã phân lập được......................Trang 25
3. Một số đặc điểm của các dòng vi khuẩn Azospirillum
đã phân lập...................................................................Trang 28
II. Kết quả kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ
thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).................................Trang 30

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
I. Kết luận....................................................................................Trang 32
II. Đề nghị....................................................................................Trang 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................Trang 33




Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã
phân lập trên lúa trồng và lúa hoang..........................................Trang 23
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã
phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt)....................................Trang 24
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã
phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt)....................................Trang 25
Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi
khuẩn đã phân lập......................................................................Trang 26
Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng vi
khuẩn đã phân lập (tt)................................................................Trang 27
Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào............................Trang 28
Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt).......................Trang 29
Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt).......................Trang 30


Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Lúa hoang ( Oryza rufipogon Griff.)..........................................Trang 12
Hình 2: Qui trình phân lập Azospirillum trên lúa....................................Trang 17
Hình 3: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum tạo dòng pellicle cách mặt môi
trường NFb bán đặc 2-5mm và làm thay đổi màu môi trường....Trang 21
Hình 4: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum môi trường đĩa petri NFb đặc
làm thay đổi màu môi trường.....................................................Trang 22
Hình 5: Ảnh chụp dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần cho thấy
vi khuẩn Azospirillum bắt màu hồng khi nhuộm Gram..............Trang 28
Hình 6 : Kết quả điện di các dòng vi khuẩn Azospirillum với cặp mồi chuyên
biệt Azospirillum lipoferum.......................................................Trang 31
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp


Trang 1
TÓM LƯỢC
44 dòng vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ lúa hoang, lúa mùa và
lúa cao sản tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Các dòng vi khuẩn
Azospirillum phân lập được có một số đặc tính giống như mô tả của các tác giả
khác trước đây. Chúng có chung các đặc điểm: vi khuẩn Gram âm, chuyển động
được, hình que ngắn hay que dài, que ngắn dính nhau thành cặp, khuẩn lạc màu
trắng trong, xanh...Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt thiết kế dựa
trên gen nifH, chúng tôi nhận diện được 2 dòng vi khuẩn thuộc loài Azospirillum
lipoferum là AR8 và AR41.
Từ khóa: Azospirillum lipoferum, lúa hoang, PCR, nifH.


ABSTRACT
Forty four strains of Azospirillum were isolated from the root system of

wild rice, winter crop and high productivity rice in some provines of the Mekong
Delta. These strains have some characteristics which are the same to the
descriptions of previous research. All of them are negative Gram, motile, short
rods or long rods, short rods in pair, white or blue colony... Using PCR technique
with specific primers of nifH gen, 2 strains AR8 and AR41 strains were identified
Azospirillum lipoferum.
Key words: Azospirillum lipoferum, wild rice, PCR, nifH.









Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp


Trang 2
PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây lúa (Oryza sativa L.) thuộc họ Hòa Bản, là cây lương thực quan trọng
cho khoảng 3 tỷ người trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt
Nam. Năm 2007, sản lượng lúa thế giới đạt khoảng 645 triệu tấn (International
Rice Research Institute (IRRI), 2007). Trong tình hình dân số thế giới đông (hơn
6,6 tỷ người) ngày càng tăng như hiện nay, nhu cầu về lương thực là rất quan
trọng. Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu dân số thế giới tiếp
tục gia tăng trong vòng 20 năm tới, thì sản lượng lúa gạo phải tăng 80% mới đáp

ứng cho nhu cầu sống còn của cư dân mới. Trong điều kiện eo hẹp đó, người ta
phải suy nghĩ đến một chiến lược để tăng sản lượng lúa gạo. Một trong những
chiến lược quan trọng là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông
nghiệp và qua đó, hi vọng sẽ đem lại cho thế giới một nguồn thực phẩm an toàn
và có giá trị kinh tế cao.
Ở Việt Nam, Đồng Bằng Sông Cửu Long được xem là vựa lúa lớn nhất
của cả nước, cung cấp hơn 52% sản lượng lúa cả nước ( />thuyet/dong-bang-song-cuu-long_471.html). Để cung cấp đủ lương thực thì tăng
năng suất cây trồng là điều quan trọng vì diện tích đất canh tác không thể mở
rộng thêm được mà ngày càng bị thu hẹp. Muốn đạt năng suất cao chúng ta phải
kiểm soát tốt các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, nước,
phòng trừ sâu bệnh,…Trong đó việc bón phân được xem là nhân tố quan trọng vì
nó quyết định năng suất cây trồng và mùa vụ.
Đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây trồng.
Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vô cùng quan trọng nhằm đáp
ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm mà
cây trồng đã lấy đi từ đất qua các vụ mùa.
Để đạt được năng suất cao, nông dân phải dùng rất nhiều phân bón hóa
học đặc biệt là đạm vì nó là nguồn dinh dưỡng chính giúp cây phát triển. Điều
này đã nảy sinh nhiều mối lo ngại. Hầu hết phân bón hóa học được sản xuất theo
qui trình Haber - Borsch, cần rất nhiều khí tự nhiên, than hay xăng, tất cả các
nguồn năng lượng này đều thuộc dạng tài nguyên không phục hồi được. Điều này
sẽ dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên thiên nhiên. Hơn nữa việc sản xuất phân
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp


Trang 3
bón sẽ sinh ra khí CO
2

là một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính
(Shenoy và ctv, 2001).
Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% lượng
phân bón, lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa và
bốc hơi ở dạng NH
3
, NO
x
, N
2
(Nguyễn Huy Phiêu, 2000). Bên cạnh đó, sự lạm
dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai ngày
càng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây nên
hiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường sống
của con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy và ctv, 2001;
Huỳnh Thu Hòa, 2006). Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học chỉ là giải
pháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi chúng phát sinh nhiều mối lo ngại.
Việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật, đã
được nhiều nước trên thế giới quan tâm trong đó có Việt Nam, nhằm tạo ra một
sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ môi
trường hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền vững.
Qua nhiều nghiên cứu, dòng vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định
đạm giúp tăng suất cây trồng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Dòng
Azospirillum với nhiều đặc điểm thuận lợi như: có khả năng cố định đạm tự do
trong không khí, tổng hợp được các chất kích thích sinh trưởng làm hệ thống rễ
phát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon, 1985).
Việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng Azospirillum làm phân bón trong
nông nghiệp là rất cần thiết, đặc biệt trên lúa nhằm thay thế một lượng đạm hóa
học đáng kể cho cây, bảo vệ môi trường và góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Đồng thời, gia tăng sản lượng lúa, tăng thu nhập cho người nông dân.

Ä Mục tiêu đề tài:
Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trên cây lúa.





Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp


Trang 4
PHẦN II - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
I. Giới thiệu về cây lúa
1. Oryza sativa L.
Cỏ nhất niên, cao 0,5 - 1,7m. Lá có phiến dài, bìa hơi “cắt”, bẹ dài, có
mép cao trắng, tai cong, có lông. Chùm tụ tán, dĩnh nhỏ, hoa 1, tiểu nhụy 6, chỉ
dài. Dĩnh quả (hạt gạo lức) dính chặt vào trấu (hạt lúa), 2n = 24 (Phạm Hoàng
Hộ, 2000).
2. Oryza rufipogon Griff. (Lúa hoang hay lúa ma).
Nê thực vật đa niên nổi, có thân nằm rồi đứng, dài 1,5 - 4m, thân to 4 -
6 mm, lóng dài 10cm. Lá có phiến dài vào 20cm, rộng vào 1cm, mép các lá dưới
cao hơn 1,5 - 3cm, có rìa lông. Chùm tụ tán đứng cao 10 - 15cm, gié hoa, nâu
nâu, dài 7 - 9,5mm, rộng 1,8 - 1,9mm, có lông gai dài đến 11cm, dĩnh mỏng, cao
3mm (Phạm Hoàng Hộ, 2000).
Cây lúa hoang (Oryza rufipogon) mọc hoang ở các nơi đầm lầy, hoặc
dọc theo các kênh mương ở Đồng Tháp Mười, và các vùng nước sâu trung bình ở
các tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long, Tiền Giang. Năng suất lúa rất thấp, khoảng 0,2 đến
0,4 tấn/ ha. Ngày nay, khi các cánh đồng đã phủ kín lúa cao sản thì cây lúa hoang

gần như bị tiêu diệt hết, vì vậy để bảo tồn nguồn gen quí này người ta đã đưa
giống lúa hoang sang viện lúa Quốc Tế IRRI để lưu trữ (http://www. viettribune.
com /vt/ index.php?id=629).
3. Đặc điểm sinh trưởng của lúa.
Thời gian sinh trưởng tính từ lúc nảy mầm cho đến lúc chín khoảng 90
đến 180 ngày, tùy theo giống, điều kiện ngoại cảnh và thời vụ gieo cấy.
Về mặt nông học có thể chia thành 3 thời kỳ: sinh trưởng dinh dưỡng
từ lúc nảy mầm; sinh trưởng sinh sản từ làm đòng đến trổ bông và thời kỳ chín từ
trổ bông đến thu hoạch. Nắm được qui luật sinh trưởng, phát triển của cây lúa,
chúng ta có thể chủ động áp dụng các biện pháp kỹ thuật theo hướng có lợi nhất
cho quá trình sinh trưởng và phát triển nhằm tạo năng suất cao.
4. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam.
Đối với Việt Nam cây lúa có vai trò quan trọng trong việc giải quyết
nhu cầu lương thực cho nhân dân. Gắn liền với quá trình phát triển của lịch sử,
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp


Trang 5
cây lúa được coi là người bạn gần gũi nhất đối với đồng ruộng và người nông
dân. Với tập quán canh tác và tiêu dùng lúa gạo, hàng năm lúa gạo đáp ứng trên
80% nhu cầu lương thực của cả nước. Người ta thống kê được, sản lượng lúa
vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tăng từ 9,5 triệu tấn (năm 1990) lên 19,2
triệu tấn (năm 2007) ( và http:
//www. sgtt.com.vn/detail3.aspx?newsid=32713&fld=HTMG/2008/0410/32713).
Vụ lúa đông xuân năm 2008, tổng sản lượng toàn vùng Đồng Bằng
Sông Cửu Long đạt 9,4 triệu tấn, tăng 300 ngàn tấn so với năm 2007. Tính chung
cả nước thì vụ đông xuân năm 2008 này sản lượng lúa đạt 17,2 triệu tấn, tăng
khoảng 200 ngàn tấn so với vụ trước (

/2008/4/27 /236353.tno).
Các số liệu trên cho thấy cần đánh giá lại một cách nghiêm túc vai trò
của lúa gạo cả nước nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng để đảm
bảo vững chắc an ninh lương thực quốc gia và ổn định lượng gạo xuất khẩu.
II. Tầm quan trọng của đạm đối với lúa.
Đạm là một chất có vai trò quan trọng trong đời sống thực vật và động
vật. Đạm là cơ cấu của protein, nhất là của protein nhân, chiếm khoảng 2 - 4%
trọng lượng của chất khô, nó còn là cơ cấu của diệp lục tố, pyrimidine và purine,
thành phần cấu trúc của một số vitamin nhóm B (B
1
, B
2
, B
6
,…) và các hợp chất
khác (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Đạm là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng hàng đầu đối với sự sống tế
bào, là yếu tố giới hạn năng suất cây trồng (Shenoy và ctv, 2001). Bón phân đạm
thúc đẩy quá trình tăng trưởng của cây trồng, giúp cây ra nhiều nhánh, phân
cành, ra nhiều lá, lá có kích thước to giúp cây quang hợp mạnh. Do đó, khi bón
phân đạm sẽ giúp gia tăng năng suất và chất lượng sản phẩm (Vũ Hữu Yêm,
1995).
Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2004) cây thiếu đạm thường
sinh trưởng kém, diệp lục tố khó thành lập nên lá thường bị vàng úa, cây còi cọc,
lùn, năng suất kém; số lá, số chồi, số nhánh ít, kích thước lá nhỏ. Thừa đạm lá có
màu xanh đậm, kích thước lá tăng, nhất là về mặt diện tích lá; cây thường có hệ
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp

Trang 6
thống rễ kém phát triển; lá mỏng, kém hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời, dễ
bị côn trùng phá hoại, đồng thời dễ đổ ngã dẫn đến năng suất giảm.
Đối với cây lúa, đạm là yếu tố rất quan trọng quyết định năng suất,
mùa vụ. Mất khoảng 1kg đạm để sản xuất 15 - 20kg lúa (Shenoy và ctv, 2001).
Trong cây lúa, đạm tập trung nhiều ở phiến lá hơn là các cơ quan khác và cũng là
nguồn protein chủ yếu cho sự hình thành hạt, chính vì vậy đạm mang lại hiệu quả
cao trong thực tế sản xuất rõ hơn các yếu tố khoáng khác.
Theo Nguyễn Huy Phiêu (2000), bình quân từ một ha đất lúa có thể
huy động được 30 - 50kg đạm, nhưng một vụ lúa một ha đất mất đi tới 150kg
đạm. Nếu không bón đủ để bù đắp lượng dinh dưỡng lấy đi do nông phẩm cũng
như thất thoát do rửa trôi thì không thể duy trì độ phì nhiêu và nâng cao năng
suất cây trồng được. Người ta dự đoán, nhu cầu phân đạm ở Việt Nam sẽ tăng từ
1.271.000 tấn (năm 2000) lên 1.627.000 tấn (năm 2010) (inap.
org/vietnam/fertilizer.html).
III. Sự cố định đạm sinh học.
Khí quyển là nguồn dự trữ đạm N
2
rất lớn, trong khoảng không khí
bên trên mỗi km
2
đất đai có khoảng 8 triệu tấn nitơ. Tuy nhiên, loại nitơ này cây
trồng không thể hấp thu được trực tiếp mà phải được vi sinh vật biến đổi thành
NO
3
−
hoặc khử thành NH
4
+

. Một số loài vi sinh vật có thể khử N
2
thành NH
3
và
được gọi là sự cố định đạm sinh học (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Sự cố định đạm sinh học có thể đạt được 175 triệu tấn mỗi năm (http://www.
microbiologyprocedure.com/nitrogen-fixation/biological-nitrogen-fixation.htm).
Trong tự nhiên sự cố định đạm sinh học đã đóng góp một lượng lớn
(khoảng 30 kg đạm/ha/vụ) cho cây trồng hấp thu khi mà phân đạm hóa học chỉ
được cây trồng sử dụng 30 - 40% (Boddy and Dobereiner, 1984).
Sự cố định đạm sinh học phụ thuộc vào hoạt động của enzyme
nitrogenase được xúc tác bởi năng lượng. Để thực hiện phản ứng này cần cung
cấp 17 ATP và enzyme nitrogenase để phá vỡ liên kết ba của phân tử nitơ.
Nitrogenase là một phức hợp enzyme, chúng cấu tạo bởi 2 thành phần là protein
sắt và protein sắt - molybden. Nitrogenase không chỉ xúc tác việc khử N
2
thành
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp


Trang 7
NH
3
mà còn có thể xúc tác việc khử C
2
H
2

, , HCN,…thành các sản phẩm tương
ứng như: C
2
H
4
, CH
3
NH
2
… (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1997).
Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau:

N
2
+ H
2
+ 6e NH
3


NH
3
được tạo thành sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo thành protein:

NH
3
+ Acid hữu cơ Acid amino Protein
Chính vì vậy mà vai trò của sự cố đinh đạm sinh học có một ý nghĩa
hết sức quan trọng đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công
nghiệp sản xuất phân hóa học chưa phát triển mà Việt Nam là một ví dụ điển

hình. Trong tương lai, khả năng cố định đạm trong cây không phải họ đậu có thể
làm giảm và thậm chí là loại bỏ hẳn sự cần thiết sử dụng phân bón vô cơ trong
nông nghiệp, đồng thời cũng có thể cải thiện được năng suất của mùa màng khi
sự cộng sinh cung cấp nguồn đạm liên tục cho cây trồng (achem.
com.vn ).
IV. Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp.
1. Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum
Năm 1974 lần đầu tiên người ta phân lập được một loài xoắn khuẩn
sống trên rễ một số cây cỏ nhiệt đới và đặt tên là Spirillum lipoferum (Döbereiner
và cộng tác viên (ctv), 1987). Về sau căn cứ vào tỷ lệ các base trong ADN người
ta xác định chúng thuộc về một giống mới, được đặt tên là Azospirillum
(Döbereiner và ctv, 1995). Azospirillum có số lượng khá lớn ở vùng rễ và trong
lớp tổ chức ở bề mặt rễ (khoảng 10
6
-10
7
tế bào/gram rễ khô) (Nguyễn Mỹ Nhung
2007).
Từ đó đến nay, người ta đã phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn
Azospirillum. Vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm tự do hoặc kết hợp
với vùng rễ của cây họ hòa bản, đặc biệt vùng rễ của cây cỏ nhiệt đới , lúa nước,
mía, ngô, lúa mì (Boddy và ctv, 1995). Saleeana và ctv (2002) đã tìm ra những
loài vi khuẩn thuộc giống Azospirillum trong rễ lúa trồng ở Tamil Nadu, Ấn Độ.
Nitrogenase
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp


Trang 8

Ngoài ra, Nguyễn Hữu Hiệp và ctv (2005) cũng tìm ra dòng vi khuẩn
Azospirillum cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu.
Vi khuẩn Azospirillum là vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ,
vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây. Chúng sống tự do trong đất hay cộng sinh
với rễ của các loại ngũ cốc, các loại cây cỏ và cây có củ (Döbereiner và ctv,
1995).
Azospirillum lipoferum là một trong bảy loài vi khuẩn đã được phát
hiện: Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense (Tarrand và ctv, 1978);
Azospirillum amazonese (Magalhaes và ctv, 1983); Azospirillum halopraeferrans
(Reinhold và ctv, 1987); Azospirillum irkense (Khanmas và ctv, 1989); hai loài
còn lại là Azospirillum doebereinerae và Azospirillum largomobile được Dekhil
và ctv tìm ra năm 1997. Chúng có những đặc điểm chung như: là vi khuẩn Gram
âm, hình que cong hay hình chữ S, chiều rộng 1,0 - 1,5µm, sinh trưởng tốt ở
30
0
C và pH từ 6,0 - 7,0 (Bashan và ctv, 2004). Azospirillum có thể chuyển động
được trong môi trường lỏng nhờ có những chiên mao dài ở một đầu (polar
flagellum) tế bào (Đào Thanh Hoàng, 2005).
Vi khuẩn thuộc loài Azospirillum lipoferum sinh trưởng dưới 2 điều
kiện hiếu khí và kỵ khí. Tuy nhiên, chúng phát triển thích hợp và tối ưu nhất ở
điều kiện vi hiếu khí với sự có mặt hoặc không của đạm trong môi trường
(Döbereiner và Pedrosa, 1987). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của những vi
khuẩn này là 35 - 37
0
C. Khuẩn lạc của chúng phát triển trên môi trường agar -
khoai tây có màu hồng nhạt hay đậm.
Azospirillum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng thực vật như
IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (Abscisic
acid) và Cytokynin (Bashan và Levanony, 1990). Sự sản xuất hormone thực vật
của vi khuẩn Azospirillum đã làm tăng chiều dài rễ, tăng hấp thu khoáng, từ đó

giúp tăng khả năng sinh trưởng của cây (Okon và Kapulnik, 1986), giúp cây
chống chịu khô hạn. Ứng dụng Azospirillum có thể giảm được khoảng 30%
lượng phân bón trong nông nghiệp (
/2002/04/04/stories/2002040400120400.htm)
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp


Trang 9
Để phát hiện loài vi khuẩn Azospirillum lipoferum, người ta dùng cặp
mồi chuyên biệt dựa trên trình tự gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được công
bố trên website ngân hàng gen để nhận diện chúng (.
nih.gov/Genbank/index.html).
2. Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum.
Thí ngiệm về tác động của các dòng Azospirillum lên năng suất cây
trồng đã được tiến hành ở nhiều loài cây và các nơi trên thế giới.
Năng suất mùa vụ đã tăng từ 3 - 54% khi được chủng Azospirillum là
kết quả của 18 thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện tại Ý (Favilli và ctv, 1987).
Ngoài ra Azospirillum còn làm tăng sản lượng lúa mì ở Mexico từ 23 - 26%
(Paceres và ctv, 1988), ở Argentina 13 - 30 % (Rodriguez - Caceres, 1982).
Thí nghiệm ngoài đồng trên lúa Miến cho thấy khi có chủng giống
Azospirillum brasilense vào hạt lúa Miến (10
7
CFU/hạt) làm gia tăng năng suất từ
10 - 15% (Okon và ctv, 1994).
Ủ hạt với vi khuẩn cho kết quả tốt hơn khi ủ với phân bón hóa học. Ủ
hột lúa mạch với Azospirillum liên tục khoảng 3 năm tại ICRISAT cho thấy
chúng cố định được 26kg đạm/ha so với không ủ và lượng NPK chứa trong cây
tăng 80 - 90% (Fages và ctv, 1994).

Theo dữ liệu của thế giới ở thập kỷ qua, khi ủ thử nghiệm hột giống
với Azospirillum hoặc kết hợp với vi khuẩn cố định đạm khác dẫn đến kết quả là
vi khuẩn có khả năng gia tăng sản lượng nông nghiệp trên những loại đất và khu
vực khác nhau (Sumner và ctv, 1990; Fages và ctv, 1994). Điều này được giải
thích như sau: khi ủ hạt giống với vi khuẩn với Azospirillum không chỉ giúp cố
định đạm trong vùng rễ mà còn làm cho hệ thống rễ phát triển nhiều hơn, gia
tăng diện tích tiếp xúc của rễ với đất nhờ đó mang lại hiệu quả cao trong sự thẩm
thấu nước và chất dinh dưỡng, giúp tăng năng suất cây trồng (Bashan và
Holguin, 1997; Boddey và ctv, 1986).
v Một số nghiên cứu về Azospirillum tại Việt Nam
Theo Nguyễn Thái Huy (1999), sử dụng phân đạm vi sinh (nhóm
Azospirillum, loài Pseudomonas, Enterobacter...) cho thấy lúa có thể tăng năng
suất 10 - 15%, tiết kiệm được 30 - 40 kg đạm/ha.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
SVTH: Lê Hoàng Thăng Lớp: Công Nghệ Sinh Học K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp


Trang 10
Tại Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, ở bộ môn Vi
sinh vật học, thí nghiệm về xử lý mầm mạ với chế phẩm Azospirillum cho thấy
mạ cứng chắc và lớn hơn, chống chịu rét tốt hơn nếu mạ gặp rét đậm kéo dài
(dưới 10
0
C). Lúa chín sớm hơn từ 3 - 5 ngày so với cây lúa không xử lý với chế
phẩm Azospirillum (Nguyễn Bảo Vệ, 2004).
Theo Phạm Thị Ngọc Lan và Lý Kim Bảng (2004), số lượng vi khuẩn
cố định đạm trong mẫu đất phân lập (trong đó có Azospirillum) đạt từ 414,0 -
428,3 CFU/g đất khô tuyệt đối và khi xử lý hạt của giống lúa Khang Dân với
nồng độ vi khuẩn 10

5
, 10
6
, 10
7
tế bào/ml, các chỉ tiêu nảy mầm, chiều dài rễ và
thân mầm đều tăng so với đối chứng, ngoại trừ chỉ tiêu của rễ mầm ở nồng độ 10
7

tế bào/ml.
Nguyễn Khắc Minh Loan và Đào Thanh Hoàng (2005) đã phân lập
được một số dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum trên cây lúa. Riêng Đào
Thanh Hoàng (2005) đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn cố định đạm từ lúa
trồng, lúa hoang hay cỏ dại và đã xác định 3 dòng A16, A28 và A31 là
Azospirillum lipoferum có nguồn gốc từ thân, rễ lúa trồng (lúa cao sản) và lúa
hoang. Tác giả cho rằng nồng độ acid malic, nguồn carbon chính cho
Azospirillum trong môi trường NFb, thích hợp nhất là 4g/lít.
Các kết quả thí nghiệm trên cho thấy loài Azospirillum lipoferum phân
bố rộng và chúng có những đóng góp lớn trong việc tăng năng suất cây trồng,
thay thế phần nào lượng phân hóa học bón cho cây, cải tạo đất đai và giảm thiểu
ô nhiễm môi trường.
V. Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử.
1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và
cộng tác viên phát minh năm 1985. Kỹ thuật này dựa trên hoạt động của ADN
polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các ADN
polymerase đều cần mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung
vào mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của
ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu