Khảo sát quá trình bảo quản enzyme naringinase bằng các phương pháp khác nhau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN NGỌC ĐIỂN

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN ENZYME
NARINGINASE BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
KHÁC NHAU

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN ENZYME
NARINGINASE BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
KHÁC NHAU

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. Nguyễn Công Hà

Trần Ngọc Điển
MSSV: 2071804
Lớp: CNTP K33

Cần Thơ, 2011


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

Luận văn đính kèm sau đây với tên đề tài “Khảo sát quá trình bảo quản enzyme
naringinase bằng các phương pháp khác nhau” do sinh viên Trần ngọc Điển
thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua.

Giáo viên hướng dẫn

Giáo viên phản biện

Nguyễn Công Hà

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2011.
Chủ tịch hội đồng

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

I

Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong bài luận văn này là công
trình nghiên cứu của bản thân theo sự hướng dẫn của giáo viên. Các số liệu và kết
quả là trung thực và chưa từng được ai công bố.

Người viết

Trần Ngọc Điển

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

II


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

LỜI CẢM TẠ
Trong suốt bốn năm đại học, bên cạnh sự nổ lực của bản thân em còn nhận
được sự chỉ bảo tận tình của quý thầy cô. Đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt
nghiệp của mình.
Qua đó em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ
đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn quý
thầy cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm – Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy,

truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu, cũng như hết lòng giúp đỡ em
trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Em xin gửi lời tri ân đến cô cố vấn học tập, cô đã cho em thật nhiều kiến
thức và kinh nghiệm trong quá trình học vừa qua.
Đồng thời, em xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến thầy Nguyễn Công
Hà, người đã truyền đạt kiến thức, tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi để
em có thể hoàn thành tốt bài luận văn này.
Xin cảm ơn tất cả các bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khóa 33 cũng
như các anh, chị cao học đã động viên tinh thần và trao dồi kiến thức cho tôi trong
suốt quá trình làm đề tài.
Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô cùng các bạn luôn dồi dào sức khỏe và
thành công cuộc sống!

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2011

Sinh viên thực hiện

Trần Ngọc Điển

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

III


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

TÓM LƯỢC
Với mong muốn giữ ổn định hoạt tính enzyme naringinase thô, sinh tổng hợp từ
nấm mốc Aspergillus niger theo thời gian bảo quản. Và bước đầu khảo sát phương
pháp kết tủa protein cho quá trình tinh sạch sơ bộ enzyme naringinase bằng
ethanol. Thí nghiệm sẽ được tiến hành như sau:
Sinh tổng hợp enzyme naringinase từ nấm mốc Aspergillus niger.
Bổ sung pectin đã được hồ hóa vào các mẫu enzyme thô với tỷ lệ khác nhau 0%;
0,1%; 0,3%; 0,5% (w/v). Rồi tiến hành bảo quản ở 40C và -160C, theo dõi hoạt tính
trong 4 ngày.
Thực hiện tương tự như trên, maltodextrin đã được hydrat hóa sẽ bổ sung vào dung
dịch enzyme thô với tỷ lệ 0%, 10%, 20%, 30% (v/v). Tiến hành bảo quản ở 40C và 160C, đồng thời theo dõi hoạt tính của các mẫu enzyme trong 4 ngày
Nghiên cứu khả năng kết tủa protein bằng ethanol được tiến hành khảo sát với tỷ lệ
dung môi và enzyme là 1:3, thí nghiệm được thực hiện ở -160C.
Các kết quả thí nghiệm cho thấy:
Bảo quản enzyme naringinase thô ở điều kiện nhiệt độ -160C là tốt nhất.
Việc bổ sung pectin và maltodextrin trong quá trình bảo quản không mang lại hiệu
quả cao. Tuy nhiên nồng độ pectin bổ sung 0,1% ở -160C và nồng độ maltodextrin
bổ sung 20% ở -160C sẽ giữ được hoạt tính enzyme ổn định nhất so với mẫu không
bổ sung và các mẫu còn lại.
Quá trình kết tủa protein đạt hiệu quả ở nồng độ cồn 700, trong điều kiện -160C,
thời gian tủa 4 giờ, với tỉ lệ ethanol : dung dịch là 1:3.

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

IV


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... II
LỜI CẢM TẠ ......................................................................................................... III
TÓM LƯỢC ........................................................................................................... IV
MỤC LỤC.................................................................................................................V
DANH SÁCH BẢNG .......................................................................................... VIII
DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. IX
CHƯƠNG 1.

GIỚI THIỆU .................................................................................1

1.1

ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................1

1.2

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ......................................................................1

CHƯƠNG 2.
2.1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.............................................................2

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME.......................................................2

2.1.1

Cấu tạo hóa học của enzyme.................................................................2

2.1.2

Tính chất của enzyme ...........................................................................2

2.1.3

Trung tâm hoạt động của enzyme.........................................................3

2.1.4

Tính đặc hiệu của enzyme.....................................................................3

2.1.5

Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ..........................3

2.1.6

Hoạt độ enzyme ....................................................................................9

2.1.7

Enzyme naringinase (EC 3.2.1.40): ......................................................9

2.2

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN.......................................................12

2.2.1

Nguồn gốc ...........................................................................................12

2.2.2

Cấu tạo của phân tử pectin..................................................................13

2.2.3

Tính chất của pectin ............................................................................13

2.2.4

Phân loại pectin...................................................................................13

2.2.5

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo gel .......................................14

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

V


Luận văn tốt nghiệp khóa 33

2.2.6
2.3

Trường Đại học Cần Thơ

Ứng dụng ............................................................................................16
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ MALTODEXTRIN .....................................16

2.3.1

Cấu tạo và tính chất.............................................................................17

2.3.2

Ứng dụng ............................................................................................18

2.4

CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA PROTEIN ........................................18

2.4.1

Sử dụng muối làm tác nhân gây tủa....................................................19

2.4.2

Tủa protein bằng dung môi hữu cơ.....................................................20

2.4.3

Dựa vào điểm đẳng điện để gây tủa protein .......................................21

2.4.4

Tủa protein bằng các non – ionic polymer .........................................22

2.4.5

Tủa bằng ion kim loại .........................................................................22

CHƯƠNG 3.
3.1

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........24

PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ............................................................24

3.1.1

Địa điểm và thời gian thực hiện..........................................................24

3.1.2

Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .......................24

3.2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................................................25

3.2.1

Phương pháp chuẩn bị mẫu.................................................................25

3.2.2

Phương pháp bố trí thí nghiệm ...........................................................26

3.2.3

Phương pháp phân tích mẫu................................................................26

3.3
3.3.1

NỘI DUNG VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ................................................26
Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả của việc bổ sung pectin, khảo sát

ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme
naringinase. .......................................................................................................26
3.3.2

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin, nhiệt độ

và thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme naringinase...........................27

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

VI


Luận văn tốt nghiệp khóa 33

3.3.3

Trường Đại học Cần Thơ

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu hiệu quả của việc kết tủa protein bằng

ethanol (cồn)......................................................................................................28
CHƯƠNG 4.
4.1

KẾT QUẢ THẢO LUẬN ...........................................................29

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA VIỆC BỔ SUNG PECTIN, KHẢO SÁT

ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN ĐẾN HOẠT
TÍNH CỦA ENZYME..........................................................................................29
4.2

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MALTODEXTRIN,

NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME
NARINGINASE THÔ..........................................................................................33
4.3

NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CỦA VIỆC KẾT TỦA PROTEIN BẰNG

ETHANOL ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME .........................................................38
CHƯƠNG 5.

KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ................................................................40

5.1

KẾT LUẬN ...............................................................................................40

5.2

ĐỀ NGHỊ..................................................................................................40

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................41
PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ..................................................... XI
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỐNG KÊ .............................................................. XIII

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

VII


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme naringinase .................................11
Bảng 2: Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger
sinh tổng hợp enzyme naringinase ..........................................................................25
Bảng 3: Sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase theo nồng độ pectin và nhiệt độ
bảo quản ..................................................................................................................29
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin và nhiệt độ bảo quản đến hoạt tính
enzyme naringinase .................................................................................................33

Bảng 5: Sự biến thiên độ nhớt của dung dịch theo nồng độ maltodextrin bổ sung
và thời gian bảo quản ..............................................................................................35
Bảng 6: Sự biến thiên độ nhớt của dung dịch theo nồng độ maltodextrin bổ sung
và nhiệt độ bảo quản ...............................................................................................36
Bảng 7: Đánh giá hiệu quả của việc kết tủa protein bằng cồn .............................38

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

VIII


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Đồ thị Michaelis - Menten (ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng
enzyme) .....................................................................................................................4
Hình 2: Ba kiểu phản ứng khi đo enzyme..............................................................5
Hình 3: Ảnh hưởng của pH ....................................................................................8
Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme ...................................8
Hình 5: Sơ đồ thuỷ phân naringin thành prunin, rhamnose, naringenin và glucose
bởi naringinase gồm hai enzyme là α-L-rhamnosidase và β -D-glucosidase.........10
Hình 6: Pectin trong cấu tạo thành tế bào thực vật ..............................................12
Hình 7: Cấu tạo một đơn vị chuỗi pectin .............................................................13
Hình 8: Cấu tạo của chuỗi pectin có độ methoxyl hóa cao..................................14
Hình 9: Cấu tạo của chuỗi pectin có độ methoxyl hóa thấp.................................14
Hình 10: Công thức cấu tạo của maltodextrin........................................................17
Hình 11: Sơ đồ biến đổi tính chất hóa lý của Maltodextrin theo giá trị DE .........17
Hình 12: Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein theo nồng độ muối ....19

Hình 13: Tỷ lệ protein tủa theo pH .......................................................................22
Hình 14: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở
40C, theo nồng độ pectin và thời gian bảo quản .....................................................30
Hình 15: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở 160C, theo nồng độ pectin và thời gian bảo quản ...................................................31
Hình 16: Dung dịch mẫu trước khi bảo quản ........................................................32
Hình 17: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có pectin) bảo quản ở 40C sau thời gian 4
ngày .........................................................................................................................32
Hình 18: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có pectin) bảo quản ở -160C sau thời
gian 4 ngày ..............................................................................................................32

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

IX


Luận văn tốt nghiệp khóa 33

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 19: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở
40C, theo nồng độ maltodextrin và thời gian ..........................................................34
Hình 20: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme naringinase bảo quản ở 160C, theo nồng độ maltodextrin và thời gian ........................................................34
Hình 21: Mẫu ban đầu ...........................................................................................37
Hình 22: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có maltodextrin) sau 4 ngày bảo quản ở
-160C........................................................................................................................37
Hình 23: Sự biến đổi vật lý của các mẫu (có maltodextrin) sau 4 ngày bảo quản ở
40C...........................................................................................................................37
Hình 24: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ cồn đến hoạt tính của enzyme
naringinase ..............................................................................................................39
Hình 25: Phương trình đường chuẩn naringin ...................................................... XI

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

X


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ nhiều thập kỷ trước, enzyme đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến. Sử
dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải
thiện lao động, giảm ô nhiễm môi trường. Cùng với sự phát triển của khoa học cũng
như enzyme học, việc ứng dụng enzyme ngày càng mở rộng, phát triển ở tầm cao
hơn, không chỉ trong lĩnh vực truyền thống mà cả trong nhiều lĩnh vực mới tạo ra
các sản phẩm mới.
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có trong tất cả các tế bào sống (động vật, thực vật
và vi sinh vật). Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết
các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…Có thể nói vi sinh vật là nguồn
nguyên liệu thích hợp và chủ yếu nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong
công nghệ và đời sống do những ưu điểm như: tốc độ sinh sản nhanh, nguồn vật
liệu rẻ tiền, dễ thu hồi, cùng lúc thu được nhiều loại enzyme...Do đó việc gia tăng
sử dụng vi sinh vật đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm enzyme
được tạo ra nhiều hơn.
Tùy mục đích sử dụng mà người ta sản xuất ra nhiều dạng chế phẩm khác nhau:

enzyme thô, enzyme bán tinh khiết và enzyme tinh khiết.
Từ những nghiên cứu trước đây đã khẳng định, việc sử dụng enzyme naringinase
thô, để thủy phân naringin làm giảm chất đắng trong bưởi có hiệu quả đáng kể. Quá
trình khử vị đắng sẽ có hiệu quả cao và kinh tế hơn nếu dùng nấm mốc Aspergillus
để sinh tổng hợp naringinase.
Tuy nhiên enzyme rất dễ mất hoạt tính sinh học khi bị tách khỏi tế bào và cơ thể. Vì
vậy mục tiêu của đề tài này là tìm ra phương pháp bảo quản enzyme thô sao cho giữ
được hoạt tính ổn định nhất.
1.2

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định nồng độ maltodextrin và pectin bổ sung vào dịch chiết enzyme thô. Kết
hợp khảo sát hoạt tính enzyme theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 40C và -160C.
Bước đầu nghiên cứu khả năng kết tủa protein từ dịch chiết thô bằng ethanol ở nhiệt
độ -160C với các nồng độ cồn khác nhau.

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

1


Luận văn tốt nghiệp khóa 33

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1
2.1.1

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME
Cấu tạo hóa học của enzyme

Các enzyme là những protein được cấu tạo từ 20 L-α amino acid. Các acid amin kết
hợp với nhau qua liên kết peptid (-CO-NH-).
Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là enzyme
một thành phần, hoặc là protein phức tạp, gọi là enzyme hai thành phần hay
haloenzyme.
Phân tử haloenzyme bao gồm hai thành phần:
+ Phần không phải protein gọi là coenzyme , có vai trò thực hiện chức năng xúc tác
và làm bền enzyme.
+ Phần protein gọi là apoenzyme, có vai trò quan trọng đối với tính đặc hiệu của
enzyme và làm tăng hiệu quả xúc tác của coenzyme.
2.1.2

Tính chất của enzyme

Enzyme có bản chất là protein nên có tất cả các thuộc tính lý hóa của protein. Phần
lớn enzyme có dạng hình cầu, tan tốt trong nước và dung môi hữu cơ. Kém bền ở
điều kiện nhiệt độ cao, môi trường acid mạnh hoặc bazơ mạnh.
Enzyme có những đặc tính ưu việt hơn các chất xúc tác khác như:
- Hiệu quả xúc tác cao, có thể làm tăng vận tốc phản ứng lên 105 – 1012 lần so với
khi không có chất xúc tác.
- Có thể hoạt động ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường (nhiệt độ 20 - 400C,
pH từ 5 - 8).
- Có tính đặc hiệu cao, tính đặc hiệu lập thể…
- Có thể tham gia phản ứng đến cùng để đạt hiệu quả 100% và không tạo ra phụ
phẩm thừa.
- Chúng có thể tham gia các phản ứng theo dây chuyền. Khi đó, sản phẩm của phản
ứng đầu là nguyên liệu cho phản ứng sau.

- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu tốn năng lượng là ít nhất.
- Trong tế bào sinh vật, enzyme luôn được tổng hợp. Số lượng chúng là rất lớn và
ứng với số lượng các phản ứng cơ thể cần thiết phải thực hiện.
- Không tham gia vào thành phần của sản phẩm cuối và được giải phóng ra ở dạng
ban đầu (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006).

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

2


Luận văn tốt nghiệp khóa 33

2.1.3

Trường Đại học Cần Thơ

Trung tâm hoạt động của enzyme

Trong phân tử enzyme có một phần nhỏ kết hợp với cơ chất, tham gia trực tiếp
trong việc tạo thành, hoặc cắt đứt các liên kết của phần phân tử cơ chất bị chuyển
hóa tạo thành sản phẩm phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. (Phạm
Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006).
- Trung tâm hoạt động chỉ chiếm một phần nhỏ trong phân tử, nằm trong túi
(pocket) hoặc trong khe (cleft) gần trên bề mặt phân tử.
- Trung tâm hoạt động bao gồm: Các nhóm chức khác nhau của mạch bên (gốc R)
của các acid amin trong phân tử, phân tử H2O liên kết, các nhóm chức của
coenzyme.
- Trung tâm hoạt động có cấu hình không gian xác định, sự tương ứng về cấu hình
không gian giữa trung tâm hoạt động và cơ chất hình thành trong quá trình enzyme

tiếp xúc với cơ chất.
2.1.4

Tính đặc hiệu của enzyme

Mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một
kiểu phản ứng nhất định. Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu
hay tính chuyên hóa của enzyme. Mức độ đặc hiệu của các enzyme khác nhau
không giống nhau, người ta thường phân thành các mức sau:
- Đặc hiệu tuyệt đối: Enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một chất nhất định.
- Đặc hiệu nhóm: Các enzyme thuộc nhóm này chỉ tác dụng với những chất có cùng
một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết.
- Đặc hiệu liên kết: mức độ đặc hiệu tương đối thấp, chỉ có tính đặc hiệu đối với liên
kết bị cắt đứt.
2.1.5

Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme

Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Nồng độ enzyme, đặc
tính, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH môi trường phản ứng, các ion kim loại, các chất
vô cơ và hữu cơ khác. Các yếu tố hóa lý không chỉ ảnh hưởng đến độ bền cấu trúc
không gian, độ tích điện của phân tử enzyme, mà còn làm thay đổi hoạt độ xúc tác
của nó.
2.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme ([E])
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào [E]
V = k[E]
V: vận tốc phản ứng; [E]: nồng độ enzyme.

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

3


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

Nhưng nếu nồng độ enzyme quá lớn, chỉ sau khoảng thời gian rất ngắn, vận tốc
phản ứng đã không thay đổi theo thời gian (Phạm Thị Trân Châu, 2006).
2.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ([S])
Sự phụ thuộc giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất được biểu diễn bằng
phương trình Mischaelis – Menten (1).
V=

Vmax × [ S ]
K m + [S ]

(1)

Trong đó V: vận tốc phản ứng
Vmax: vận tốc phản ứng cực đại
[S]: nồng độ cơ chất
Km: hằng số Michaelis-Menten, đặc trưng cho từng loại enzyme

Hình 1: Đồ thị Michaelis - Menten (ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng

enzyme)
(Nguồn: Nguyễn Công Hà, 2008)

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

[S] tăng → tăng tốc độ và tăng cơ hội cơ chất gặp được enzyme
- Giữ số lượng enzyme là hằng số
- Để nồng độ cơ chất gia tăng dần dần → tốc độ phản ứng sẽ gia tăng và đạt đến cực
đại. Sau điểm này, nếu gia tăng nồng độ cơ chất sẽ không còn gia tăng tốc độ phản
ứng nữa.
- Nồng độ cơ chất hiện diện với số lượng rất lớn → phản ứng phải độc lập với nồng
độ cơ chất.
→ Bất cứ sự thay đổi nào của sản phẩm hình thành trong một khoảng thời gian nào
đó sẽ phụ thuộc vào mức độ enzyme hiện diện.

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

4


Luận văn tốt nghiệp khóa 33

Trường Đại học Cần Thơ

Ý nghĩa hằng số Michaelis-Menten
Km nhỏ chỉ ra rằng, enzyme chỉ cần một lượng nhỏ cơ chất để đạt bão hòa. Vì thế,
tốc độ cực đại Vmax đạt đến tại một nồng độ cơ chất thấp tương đối.
Km lớn chỉ ra rằng, cần một nồng độ cơ chất cao để có thể đạt đến tốc độ cực đại
Vmax.

Hình 2: Ba kiểu phản ứng khi đo enzyme.

Giữa A và B, đồ thị biểu diễn phản ứng bậc không, tốc độ là hằng số với thời gian.
Khi cơ chất sử dụng hết, trung tâm hoạt động của enzyme không còn bão hòa, nồng
độ cơ chất trở thành giới hạn của tốc độ, và phản ứng trở thành bậc 1 giữa B và C.

Để đo độ hoạt động lý tưởng, phương pháp đo phải thực hiện trong phần của đồ thị
nơi có phản ứng bậc không. B thể hiện phản ứng bậc không, ở đó cho phép xác định
chính xác độ hoạt động enzyme cho một phần hoặc tất cả thời gian phản ứng. Phản
ứng này bắt đầu là bậc không và sau đó chậm dần.
Độ hoạt động đúng thể hiện bởi đường chấm. Đường C thể hiện một phản ứng với
giai đoạn chậm (lag phase).
Xác định nồng độ sản phẩm nhiều lần sẽ đảm bảo mỗi đường được vẽ ra và độ hoạt
động thực sự được xác định chính xác điểm kết thúc tại E sẽ dẫn đến kết luận sai
rằng tất cả 3 mẫu có nồng độ enzyme giống nhau.
2.1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm
Chất kìm hãm là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Các chất
này có thể là các ion, các chất vô cơ hay hữu cơ, có thể là cơ chất hay là sản phẩm
của phản ứng enzyme. Các chất này có thể tác dụng theo nhiều cách khác nhau như:

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

5


Luận văn tốt nghiệp khóa 33

Trường Đại học Cần Thơ

đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, có thể kìm hãm thuận nghịch hay không thuận
nghịch.
Chất ức chế thuận nghịch tương tác với enzyme thông qua các liên kết không đồng
hóa trị hay các phản ứng phân li. Ngược lại, chất ức chế không thuận nghịch gây ra
sự thay đổi liên kết đồng hóa trị trong enzyme. Vì thế, sự ức chế không thuận
nghịch thường làm giảm nồng độ của enzyme hoạt động. Ức chế thuận nghịch gồm
có ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh (Phạm Thị Trân Châu và Phan

Tuấn Nghĩa, 2006).
Các chất kìm hãm cạnh tranh
Các chất kĩm hãm cạnh tranh (I) thường có cấu trúc tương tự cấu trúc của cơ chất
(S). Do đó, chúng có khả năng cạnh tranh với cơ chất để kết hợp với enzyme (E) ở
trung tâm hoạt động, nhưng khác với S ở chỗ nó không bị chuyển hóa bởi E (Phạm
Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006).
Phản ứng cạnh tranh có thể biểu thị như sau:
E+I

EI

E + S ES

P+E

Các chất kìm hãm không cạnh tranh
Các chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị trí khác với vị trí kết
hợp của cơ chất tạo thành phức ESI không bị chuyển hóa tiếp. Khi chất kìm hãm
không cạnh tranh kết hợp với enzyme sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian theo
hướng không thuận lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme làm giảm vận tốc phản
ứng (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006).
Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng
kết hợp với cơ chất để tạo thành phức hợp EIS như phản ứng sau:
E + S = ES
E+I

E+P
EI

ES + I = ESI

EI + S = EIS
Kiềm hãm do thừa cơ chất
Trong một số trường hợp thừa cơ chất sẽ kìm hãm phản ứng. Giải thích hiện tượng
này có nhiều giả thuyết khác nhau. Ví dụ có thể do nồng độ cơ chất quá cao tạo rào
cản không gian gây khó khăn cho tương tác đúng giữa enzyme và cơ chất (caseine
đối với protease của Bacillus pumilus). Hoặc có thể do cơ chất kết hợp không đúng

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

6


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

cách tạo phức ESS không hoạt động (phản ứng do succinate dehydrogenase xúc tác)
(Lê Ngọc Tú, 2004).
Kiềm hãm bởi sản phẩm của chúng
Các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thể trở thành
chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó.
Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu: S1 + S2

P1 + P2

Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P1 và P2 tương
đương với S1 và S2. Trong trường hợp này P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với
S1 và S2.
2.1.5.4 Ảnh hưởng của các ion kim loại
Các ion kim loại có thể kìm hãm hay hoạt hóa enzyme. Các ion kim loại nặng, ở

nồng độ gây biến tính protein có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch enzyme.
Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ hoạt
hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới hạn
xác định, khi vượt quá nồng độ này, lại có tác dụng kìm hãm enzyme (Phạm Thị
Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006).
2.1.5.5 Các chất hoạt hóa khác
Một số chất có thể làm tăng hoạt độ enzyme bằng cách gián tiếp hay trực tiếp. Gọi
là gián tiếp khi tác dụng hoạt hóa là loại trừ chất kìm hãm khỏi hỗn hợp phản ứng,
hoặc không tác dụng trực tiếp với enzyme. Các chất hoạt hóa trực tiếp thì thường
tác dụng vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm biến đổi cấu hình phân tử
enzyme theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác (Phạm Thị Trân Châu và Phan
Tuấn Nghĩa, 2006).
2.1.5.6 Ảnh hưởng của pH
Hoạt độ enzyme phụ thuộc và môi trường, vì pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa
các gốc R của các gốc acid amin trong phân tử enzyme, ion hóa các nhóm chức
trong trung tâm hoạt động, ion hóa cơ chất. Mỗi enzyme chỉ hoạt động trong một
khoảng pH nhất định, pH thích hợp của phần lớn enzyme vào khoảng 7 (Phạm Thị
Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006), tuy nhiên pH tối thích của enzyme còn bị
ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác như tính chất dung dịch đệm, đặc tính và nồng độ
cơ chất, nhiệt độ phản ứng…(Lê Ngọc Tú, 2004).

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

7


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

Hình 3: Ảnh hưởng của pH

2.1.5.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Bản chất enzyme là protein. Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của
chúng. Tốc độ của phản ứng do enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó
khi mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc.
Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng là hệ số Q10,
là tỷ lệ của vận tốc phản ứng ở một nhiệt độ nào đó so với vận tốc phản ứng ở nhiệt
độ thấp hơn 100C.

Q10 =

kt + 10
kt

Hệ số này càng lớn phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ thường.
Nhiệt độ hoạt động thích hợp của đa số enzyme vào khoảng 40 - 500C (hình 4), trên
500C hoạt độ thường giảm mạnh do cấu trúc enzyme bị phá hủy.
Ở nhiệt độ dưới 00C, hoạt độ enzyme bị giảm nhiều, nhưng lại có thể được phục hồi
khi đưa về nhiệt độ bình thường.

Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

8


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

2.1.6

Hoạt độ enzyme

Trong enzyme học người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà
thường xác định gián tiếp thông qua mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme. Để
xác định hoạt độ của enzyme về nguyên tắc có thể chia ra ba nhóm phương pháp
sau:
+ Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành trong một thời gian
nhất định ứng với một nồng độ enzyme nhất định.
+ Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay
sản phảm ứng với một nồng độ enzyme nhất định.
+ Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự
biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Để tiêu chuẩn hóa việc biểu diễn mức độ hoạt động xúc tác của enzyme theo quy
ước quốc tế, sử dụng các đơn vị sau:
+ Đơn vị UI (International unit): Một đơn vị UI là hoạt độ của một enzyme ở các
điều kiện tiêu chuẩn thích hợp, xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một µ mol cơ chất
trong một phút.
1 UI = 1 µ mol cơ chất/phút = (10-6 mol/60 giây)
+ Đơn vị Katal: Một đơn vị katal là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa
một mol cơ chất trong một giây ở các điều kiện phân tích.
1 katal = 1mol/giây
Như vậy: 1 katal = 60 x 106 UI
Hoạt độ riêng
Là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độ sạch của chế phẩm enzyme.
Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng số đơn vị hoạt độ enzyme trên một đơn vị
khối lượng (miligam hay gam) protein.

2.1.7

Enzyme naringinase (EC 3.2.1.40):

2.1.7.1 Đặc tính của enzyme naringinase
Naringinase từ những nguồn khác nhau sẽ có những đặc tính khác nhau.
Naringinase từ sp. Penicillium bao gồm cả α -L-rhamnosidase và β -D-glucosidase.
pH tối ưu cho hai enzyme này lần lượt là 4,5 và 3,0 (Gabor và Pittner, 1984).
Naringinase từ Aspergillus niger chứa cả α-L-rhamnosidase (EC 3.2.1.40) và β -Dglucosidase (EC 3.2.1.21). Hoạt động của hai enzyme này phụ thuộc vào pH và
nồng độ protein, α-L-rhamnosidase hoạt động độc lập trong dãy pH từ 3-7. Trong
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

9


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

khi đó β-D-glucosidase chỉ hoạt động ở pH 4-6. Hỗn hợp enzyme có thể được tách
rời và hoạt động độc lập bằng phương pháp lọc gel (Puri et al, 2000).
Enzyme α-L-rhamnosidase bị ức chế cạnh tranh bởi rượu và glucose. Nồng độ cồn
12% (v/v) làm giảm 20% hoạt tính của enzyme này. Hoạt tính thủy phân của
naringinase giảm 15% khi có sự hiện diện của 21% (w/v) glucose. Tuy nhiên, tốc độ
thủy phân của enzyme này không bị ảnh hưởng khi có SO2 ở nồng độ 50 ppm
(Gallego và ctv, 2001).
Naringin có thể được thủy phân bởi α -L-rhamnosidase tạo ra rhamnose và prunin
(4,5,7-trihydroxyflavonone-7-glucopy-ranoside). Cũng có thể thu được prunin từ
β -D-glucosidase (Park and Chang, 1979).
Naringinase phân cắt naringin thành naringenin qua hai công đoạn sau:

+ Naringin

+ Prunin

α-L-rhamnosidase
β -D-glucosidase

Prunin + rhamnose

Naringenin + glucose

Hình 5: Sơ đồ thuỷ phân naringin thành prunin, rhamnose, naringenin và glucose

bởi naringinase gồm hai enzyme là α-L-rhamnosidase và β -D-glucosidase

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

10


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

Theo nghiên cứu của Ladaniya (2008) cho thấy các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ
enzyme và thời gian thuỷ phân cũng có ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân naringin.
Khả năng thủy phân của naringinase tăng khi tăng nhiệt độ. Tuy nhiên, mối quan hệ
này không tuyến tính. Ở nồng độ enzyme thấp, khả năng thủy phân tỷ lệ với thời
gian thuỷ phân. Tuy nhiên, ở nồng độ enzyme cao hơn thì khả năng thủy phân ít phụ
thuộc vào thời gian.

Ngoài ra, áp suất cũng có tác động đến hoạt tính thủy phân naringin của enzyme
naringinase. Kết quả cho thấy, ở cùng một nhiệt độ (303 K), hoạt động của enzyme
cao hơn ở áp suất 160 MPa (Vmax = 2,7 mM/phút) so với áp suất khí quyển (Vmax =
0,06 mM/phút) (Helder và ctv, 2006).
2.1.7.2 Sản xuất enzyme naringinase
Trong lịch sử, enzyme naringinase được trích ly từ thực vật như hạt cần tây hay lá
bưởi (Hall, 1938). Tuy nhiên, nguồn naringinase thực vật chưa mang lại lợi ích cao.
Những nghiên cứu về sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật có tính khả thi hơn so
với nguồn thực vật. Nhiều vi sinh vật có thể sử dụng để sinh tổng hợp enzyme
naringinase.
Bảng 1:

Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme naringinase

Vi sinh vật
Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii

Tác giả
Kishi, 1955

Cochiobolus miyabeanus

Ito and Takiguchi, 1970

Coniothyrium diplodiella

Nomura, 1965

Penicilium decumbens
Rhizotonia solani

Rhizopus nigricans

Fukumoto and Okado, 1973
Ito and Takiguchi, 1970
Shanmugam and Yadav, 1995

2.1.7.3 Những ứng dụng khác của enzyme naringinase
Bên cạnh khả năng thủy phân naringin, α-L-rhamnosidase còn có nhiều ứng dụng
trong công nghiệp. Nó được sử dụng để loại tinh thể hesperidin. Đặc biệt
naringinase được sử dụng để sản xuất những glycosides tự nhiên và làm tăng hương
vị cho rượu và nước quả (Pandey, 1984). Theo Sankyo (1988) naringinase còn được
dùng để sản xuất chloropolysporin C, được xem là một chất chống các vi khuẩn
gram (+) hiệu quả (đặc biệt là Staphylococcus aureus và Enterobacteria). Sapogenis
và diosgenis (những tiền chất để tổng hợp multivitamin và hormone sinh học) có thể

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

11


Luận văn tốt nghiệp khóa 33

Trường Đại học Cần Thơ

được sản xuất bằng cách sử dụng naringinase để thủy phân hạt cari (Elujoba and
Hardman, 1987). Những sản phẩm thủy phân này có tiềm năng ứng dụng cao.
Prunin có thể sử dụng để chống lại DNA/RNA của virus. Prunin còn là một hợp
chất ngọt dành cho người tiểu đường và là chất chống ung thư, chống oxi hóa.
Rhamnose là tiền chất trong quá trình tổng hợp nhiều chất hữu cơ và nó là nguồn
nguyên liệu cho dược phẩm, đồng thời nó còn là tác nhân bảo vệ thực vật và tổng

hợp các chất ngọt và chất mùi thương mại (Kaul và Middleton, 1985).
Bên cạnh đó naringinase còn được dùng để tổng hợp dihydrochalcone. Độ ngọt của
dihydrochalcone glucosides của naringin, neohespiridin và hespiridin gấp lần lượt là
300, 1100 và 300 lần so với đường saccharose (Horowitz và Gentili, 1963).
2.2
2.2.1

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN
Nguồn gốc

Pectin là một polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham gia
xây dựng cấu trúc tế bào thực vật. Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng là
pectin hòa tan và protopectin không hòa tan. Dưới tác dụng của acid, enzyme
protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin.
Pectin tồn tại với những hàm lượng khác nhau trong quả, củ, hoặc thân của một số
loài thực vật: trong táo 10 – 15%; quả citrus 20 – 50%; củ cải đường 10 – 20%; đài
hoa hướng dương 15 – 25%. Trong cùng một quả nhưng ở những phần khác nhau
thì hàm lượng pectin cũng khác nhau.

Hình 6: Pectin trong cấu tạo thành tế bào thực vật
(Nguồn: />
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

12


Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp khóa 33

2.2.2

Cấu tạo của phân tử pectin

Hình 7:

Cấu tạo một đơn vị chuỗi pectin

Pectin là một polysaccharide mạch thẳng, cấu tạo từ sự liên kết giữa các mạch của
phân tử acid D-galacturonic (C6H10O71), liên kết với nhau bằng liên kết 1,4glucoside. Trong đó một số gốc acid có chứa nhóm methoxyl (-OCH3).
Phân tử lượng của các loại pectin phụ thuộc vào số phân tử acid galacturonic và
thường thay đổi trong phạm vi 10000 – 100000.
2.2.3

Tính chất của pectin

Pectin tinh chế có dạng bột màu trắng, hoặc hơi vàng, hơi xám, hơi nâu. Nó rất dễ
tan trong nước nhưng không tan trong ethanol.
Pectin bị phá hủy khi đun nóng ở nhiệt độ cao trong thời gian dài làm giảm tính
đông của sản phẩm khi cô đặc. Trong cồn và dung dịch muối thì pectin bị kết tụ.
Tính chất quan trọng của pectin là có thể tạo đông ở nồng độ thấp(1-1,5%) khi có
mặt đường 60-70% và acid 1%. Khả năng tạo đông phụ thuộc vào nguồn pectin,
mức độ methoxyl hóa và phân tử lượng của pectin.
Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là:
+ Chỉ số methoxyl “MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl (–
OCH3) có trong phân tử pectin.
+ Chỉ số este hóa “DE” thể hiện mức độ este hóa của các phân tử acid galactoronic
trong phân tử pectin.
2.2.4
2.2.4.1

Phân loại pectin
Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa

Pectin chia thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl
hóa thấp.
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm

13