Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase trên môi trường lỏng từ aspergi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ LÝ HẰNG
LT08175

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME PECTIN METHYLESTERASE
TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG
TỪ Aspergillus niger

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME PECTIN METHYLESTERASE

TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG
TỪ Aspergillus niger

Giáo viên hướng dẫn:
Ts. Lý Nguyễn Bình

Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Thị Lý Hằng
MSSV: L08175
Lớp: CNTP 34 LT

Cần Thơ, 2010


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

Luận văn đính kèm dưới đây, với tựa đề tài: “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến
khả năng sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase trên môi trường lỏng từ
Aspergillus niger” do Nguyễn Thị Lý Hằng thực hiện và báo cáo đã được hội đồng
chấm luận văn thông qua.
Giáo viên hướng dẫn

Ts. Lý Nguyễn Bình

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

i

Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM ƠN
Xin gửi lòng biết ơn đến thầy Lý Nguyễn Bình đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn
thành bài luận văn tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn quí thầy cô Trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô trong
Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức
cũng như những kinh nghiệm bổ ích trong suốt quá trình học tập tại Trường.
Chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã
tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị cao học, đặc biệt là chị Mai Thiên Hương đã
giúp đỡ và truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm quí báu trong suốt thời gian thực hiện luận
văn.
Cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm đã hỗ trợ, góp ý và cùng tôi học tập, chia sẻ
những kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập tại Trường.
Chân thành cảm ơn!

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

TÓM LƯỢC

Enzyme pectin methylesterase (PME) là một enzyme được ứng dụng nhiều trong
ngành thực phẩm nhờ khả năng phân cắt pectin. Với mục tiêu nghiên cứu để tìm ra
những điều kiện thích hợp để sản xuất PME từ nguồn vi sinh vật, đề tài tiến hành
“Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectin
methylesterase trên môi trường lỏng từ Aspergillus niger”. Thí nghiệm tiến hành
khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm mốc Aspergillus niger (102, 103, 104, 105
CFU/ml); điều kiện môi trường nuôi cấy pH (3,0; 3,5; 4,0; 4,5 và 5,0) trong các
khoảng thời gian khác nhau (64, 88, 112, và 136 giờ) ảnh hưởng đến khả năng sinh
tổng hợp enzyme pectin methylesterase. Qua quá trình nghiên cứu kết quả thu được:
mật số nấm mốc ban đầu 105 CFU/ml, pH môi trường nuôi cấy 4,0 ÷ 4,5 trong thời
gian 88 giờ thu được chế phẩm enzyme có hoạt tính cao.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
TÓM LƯỢC ............................................................................................................ iii
MỤC LỤC................................................................................................................ iv
DANH SÁCH HÌNH................................................................................................ vi
DANH SÁCH BẢNG.............................................................................................. vii
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU....................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề......................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1 Giới thiệu chung ............................................................................................... 3
2.1.1 Enzyme pectinmethylesterase..................................................................... 3
2.1.2 Cấu trúc của pectin methylesterase............................................................. 4
2.1.3 Trung tâm hoạt động của PME................................................................... 5
2.2 Tính chất và kiểu hoạt động của pectin methylesterase ..................................... 5
2.2.1 Tính chất.................................................................................................... 5
2.2.2 Cơ chế hoạt động thủy phân ....................................................................... 6
2.3 Nguồn tổng hợp pectin methylester từ vi sinh vật.............................................. 6
2.4 Hoạt độ enzyme ................................................................................................ 7
2.4.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ...................................................... 7
2.4.2 Đơn vị hoạt độ enzyme .............................................................................. 8
2.4.3 Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme ............ 9
2.4.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme ........................................ 10
2.5 Sản xuất pectin methylesterase từ nấm mốc Aspergillus niger......................... 10
2.5.1 Giới thiệu sơ lược về giống vi sinh vật ..................................................... 10
2.5.2 Môi trường nuôi cấy................................................................................. 11
2.5.3 Cơ chất cảm ứng (pectin) ......................................................................... 12
2.5.4 Phương pháp nuôi cấy chìm (phương pháp nuôi cấy bề sâu) .................... 14
2.5.5 Thu nhận enzyme ..................................................................................... 15
2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme pectin methylesterase.. 16
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

2.6.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy...................................... 16
2.6.2 pH môi trường.......................................................................................... 16
2.6.3 Thời gian nuôi.......................................................................................... 16
2.6.4 Nhiệt độ ................................................................................................... 17
2.6.5 Nguồn khoáng dinh dưỡng ....................................................................... 17
2.6.6 Hàm lượng oxy hòa tan ............................................................................ 17
2.7 Một số nghiên cứu về sản xuất enzyme pectin methylesterase......................... 17
2.8 Ứng dụng của enzyme pectin methylesterase .................................................. 19
2.8.1 Ứng dụng trong chế biến thực phẩm......................................................... 19
2.8.2 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác ........................................... 20
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 22
3.1 Phương tiện nghiên cứu .................................................................................. 22
3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện................................................................ 22
3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất ........................................................................... 22
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 22
3.2 Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 25
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN .............................................................. 28
4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm mốc Aspergillus niger ban đầu đến
khả năng sinh tổng hợp pectin methylesterase....................................................... 28
4.2 Kết quả khảo sát pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh
tổng hợp pectin methylesterase ............................................................................. 29
4.3 Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
pectin methylesterase............................................................................................ 30
4.4 Kết quả tổng hợp ảnh hưởng của mật số nấm mốc Aspergillus niger và điều
kiện môi trường nuôi cấy (pH và thời gian) đến khả năng tổng hợp PME...... 32
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................. 36
5.1 Kết luận .......................................................................................................... 36
5.2 Đề nghị ........................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38
PHỤ LỤC............................................................................................................... viii

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

v


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Sơ đồ thủy phân pectin của PME ................................................................. 3
Hình 2.2 Sự phân cắt bắt đầu từ nhóm carboxyl tự do................................................. 3
Hình 2.3 Cấu trúc bậc II của PME từ E. chrysanthemi, cà chua và cà rốt.................... 4
Hình 2.4 Trung tâm hoạt động của PME cà rốt, cơ chất là đơn vị acid methyl-ester Dgalacturonic được gắn vào trung tâm hoạt động.......................................................... 5
Hình 2.5 Sự thủy phân pectin dưới sự xúc tác của PME.............................................. 6
Hình 2.6 Hình dạng nấm Aspergillus niger............................................................... 10
Hình 2.7 Mô tả vách tế bào thực vật ......................................................................... 12
Hình 2.8 Cấu tạo pectin…. ....................................................................................... 13
Hình 3.1 Máy khuấy từ gia nhiệt .............................................................................. 23
Hình 3.2 Tủ cấy........................................................................................................ 23
Hình 3.3 Máy chuẩn độ acid-bazơ 785 TITRINO ..................................................... 23
Hình 3.4 Thiết bị thanh trùng Autoclave................................................................... 23
Hình 3.5 Tủ ủ ........................................................................................................... 24
Hình 3.6 Máy lắc ..................................................................................................... 24
Hình 3.7 Máy vortex................................................................................................. 24
Hình 3.8 Cân điện tử................................................................................................. 24
Hình 3.9 Qui trình thí nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme pectin methylesterase...... 27
Hình 4.1 Mẫu sau khi thanh trùng............................................................................. 31
Hình 4.2 Chế phẩm enzyme thô................................................................................ 31

Hình 4.3 Đồ thị thể hiện hoạt tính PME trung bình theo mật số nấm mốc ban đầu, pH
và thời gian nuôi cấy................................................................................................. 35

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1: Hoạt tính PME trung bình theo mật số nấm mốc ban đầu ......................... 28
Bảng 4.2: Hoạt tính PME trung bình theo pH môi trường nuôi cấy........................... 29
Bảng 4.3: Hoạt tính PME trung bình theo thời gian nuôi cấy .................................... 30
Bảng 4.4: Hoạt tính PME trung bình theo mật số nấm mốc ban đầu, pH và thời gian
nuôi cấy.................................................................................................................... 32

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein và có ý nghĩa đặc biệt quan trọng
cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật. Hơn nữa enzyme có nguồn gốc
tự nhiên không độc và giúp cho các phản ứng xảy ra với vận tốc nhanh gấp 108 - 1011
lần tạo ra sự tiện lợi tối đa trong quá trình sản xuất nên được ứng dụng rộng rãi trong
chế biến thực phẩm.
Nghiên cứu sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme đã được phát triển mạnh từ thế kỷ
XX đến nay. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các
chế phẩm enzyme được sản xuất nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh
vực như: công nghiệp, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… trong số đó, ngành công nghiệp
thực phẩm là lĩnh vực có lượng tiêu thụ enzyme nhiều nhất.
Đối với một nước nông nghiệp như Việt Nam thì việc ứng dụng enzyme vào ngành
công nghiệp thực phẩm là một vấn đề cần được quan tâm. Và enzyme pectin
methylesterase được xem là enzyme then chốt trong quá trình sản xuất các sản phẩm
từ rau quả. Đặc biệt enzyme pectin methylesterase (PME) có tác dụng to lớn trong
ngành công nghiệp đồ uống như sản xuất rượu vang, sản xuất nước quả và nước uống
không có cồn, sản xuất nước giải khát, sản xuất cà phê và cà phê hòa tan…
PME có thể thu được từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Tổng hợp enzyme từ vi sinh
vật là sự lựa chọn hàng đầu so với từ động vật và thực vật do có nhiều ưu điểm:
- Tốc độ sinh sản mạnh
- Enzyme thu được có hoạt tính cao
- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme từ vi sinh vật rẻ tiền và dễ kiếm, đôi khi
chỉ là phế phẩm của một số quá trình sản xuất
- Tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp
- Một loại vi sinh vật có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau.
Với hi vọng đề ra được một qui trình sản xuất theo qui mô công nghiệp nguồn enzyme
có hoạt tính cao nhưng giá thành thấp và có thể đáp ứng được nhu cầu của thị trường
trong nước cũng như xuất khẩu, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát một số yếu tố
ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase trên môi trường
lỏng từ Aspergillus niger”

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

1


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp
enzyme pectin methylesterase trên môi trường lỏng từ Aspergillus niger với các mục
tiêu sau:
- Xác định mật số nấm mốc Aspergillus niger thích hợp trên một khối lượng mẫu cho
quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase là cao nhất
- Xác định điều kiện môi trường pH nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
enzyme pectin methylesterase từ Aspergillus niger
- Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectin
methylesterase từ Aspergillus niger.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

2


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung
2.1.1 Enzyme pectinmethylesterase
Pectin methylesterase thuộc nhóm enzyme pectinase, nhóm enzyme xúc tác sự thủy
phân pectin. PME còn có tên khác là pectinesterase (PE) và được đánh số trong hệ
thống phân loại là EC 3.1.1.11. Chúng thủy phân pectin tạo thành acid pectinic hoặc
acid pectic và methanol bằng cách tấn công vào các nhóm ester methyl (-COOCH3)
của đơn vị galacturonate nằm cạnh đơn vị không bị ester hóa (-COOH) (Hình 2.1 và
Hình 2.2). Hiệu suất thủy phân có thể đạt đến 98% (Ly Nguyen, 2004).

PME
2H2 O

Hình 2.1 Sơ đồ thủy phân pectin của PME

Pectine esterase

O

OH

OH

O

OH

O

O
O

OH

OH

OH

OH

C O OC H3

CO O H

O

O

O
O

C O OC H3

CO O CH 3

CO O CH 3

O

O

OH
OH

OH

Pectine esterase

O

OH
OH

OH

O
OH

OH

O

O
O

OH

CO OH

CO O H

O

O

O
O

CO OH

CO O H

CO O H

OH

O

O

OH

OH

OH

Hình 2.2 Sự phân cắt bắt đầu từ nhóm carboxyl tự do
(Ly Nguyen, 2004)

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

3


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

2.1.2 Cấu trúc của pectin methylesterase
Cấu trúc bậc I của PME
Cấu trúc bậc I của PME là cấu trúc dạng chuỗi thường gặp ở thực vật như: PME từ cà
chua (Hình 2.3), cà rốt, khoai tây,… Chuỗi acid amin của các PME tương đối giống
nhau và các acid amin tại trung tâm hoạt động thì cố định gồm: hai acid aspartic,
arginine, hai glutamines và hầu hết các acid amin có nhân thơm liên kết với khớp
phản ứng. (Jenkins et al., 2001; Johansson et al., 2002; D’Avino et al., 2003)
Cấu trúc bậc II của PME
Cấu trúc bậc II của PME là dạng cấu trúc β-helix. Đây là cấu trúc vòng xoắn có gấp
nếp β-helix theo hướng phải, bao gồm 3 chuỗi β-sheet song song, và có những đoạn
dạng vòng được kéo ra từ lõi của vòng xoắn, nó tạo ra một vùng sâu giống như khe
nứt. Khe nứt thường tạo nên bởi những gốc có vòng thơm và hai gốc aspartic tương
ứng với trung tâm hoạt động của PME (Jenkins et al., 2001; Johansson et al., 2002;
D’Avino et al., 2003).

PME cà chua

PME cà rốt

PME E. Chrysanthemi

Hình 2.3 Cấu trúc bậc II của PME từ E. chrysanthemi, cà chua và cà rốt
(www.biochemj.org)

Kiểu kiến trúc này gần giống như các enzyme pectinolytic khác. Nói chung kiểu gấp
lại của 3 loại enzyme trên giống nhau, nhưng chúng khác nhau ở chiều dài của đoạn
vòng. Trong đó enzyme PME vi khuẩn có đoạn vòng dài hơn, nói cách khác là nó tạo
ra khe nứt sâu hơn.
Sự sắp xếp các chuỗi của PME để lộ ra một số gốc amino acid. Khi enzyme tiếp xúc
với dung môi thì các gốc này tập hợp lại thành bó và tạo nên khe nứt sâu ở bề mặt.
Vùng này tương ứng với trung tâm hoạt động của PME (Jenkins et al., 2001;
Johansson et al., 2002). Khe nứt này có thể được tạo nên bởi các gốc có chứa vòng
thơm, đặc trưng cho các liên kết của carbohydrate, cùng với 2 gốc aspartate, đây là
những gốc được cho là có hoạt tính xúc tác (Jenkins et al., 2001; Johansson et al.,
2002).
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

4


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

2.1.3 Trung tâm hoạt động của PME
Enzyme PME thủy phân các liên kết ester của các đơn vị ester galacturonic tạo thành
các polymer mang điện tích âm và methanol. Khi enzyme hoạt động không phải toàn
bộ enzyme tham gia vào hoạt động xúc tác mà chỉ có trung tâm hoạt động tham gia.
Trung tâm hoạt động của enzyme do cấu trúc không gian của enzyme tạo ra. Chính
trung tâm hoạt động quy định tính đặc hiệu và hoạt tính sinh học của enzyme.
Ví dụ: Trung tâm hoạt động của PME từ cà rốt (Hình 2.4) nằm ở vùng lõm với 2 gốc
acid ở trung tâm, Asp136 và Asp157.

Hình 2.4 Trung tâm hoạt động của PME cà rốt, cơ chất là đơn vịacid methyl-ester Dgalacturonic được gắn vào trung tâm hoạt động
(Jonhanson et al., 2002)

2.2 Tính chất và kiểu hoạt động của pectin methylesterase
2.2.1 Tính chất
PME phân cắt liên kết ester giữa methanol và nhóm carboxyl của D-galacturonic.
Pectin methylesterase sẽ thủy phân nhóm methylester giữa 2 nhóm carboxyl tự do
trước, sau đó sẽ thủy phân lần lượt các liên kết ester theo phân tử pectin, kết quả của
quá trình thủy phân là tạo ra acid pectinic, acid pectic và methalnol (Hình 2.5).
Hầu hết các PME nguồn gốc thực vật khử ester của pectin từ đầu khử hoặc không
khử, hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi
đơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Phản ứng khử ester bắt đầu ở gần nhóm carboxyl tự
do hay từ đầu khử của mạch acid polygalacturonic (chỉ tác dụng tại một vị trí trên
mạch), kết quả tạo thành các gốc galacturonic bị khử nhóm ester (Solms and Deuel,
1955). Bởi vì hoạt động cần có nhóm carboxyl tự do trên mạch polygalacturonic nên
PME từ thực vật ít hoạt động trên các pectin có độ ester hóa cao hơn là các pectin có
độ ester hóa từ 20% - 30% (Evans and Machale, 1978; Seymour et al., 1991).
Pectin methylesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm
ở giữa hai nhóm cacboxyl tự do. Và enzyme sẽ thủy phân lần lượt các liên kết ester
dọc theo phân tử pectin.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

5


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

PME của nấm mốc thủy phân pectin và các ester của acid polygalacturonic sâu sắc

hơn PME của thực vật. Hoạt tính của pectin methylesterase phụ thuộc nhiều vào mức
độ ester hóa của pectin và tỉ lệ thuận với mức độ este hóa. Chẳng hạn, đối với tác
dụng của pectin methylesterase từ Aspergillus niger cần thiết phải có pectin ester hóa
ở mức độ cao không ít hơn 70%. Khoảng pH tối ưu của pectin methylesterase từ
nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzyme
polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2,0 đến 6,5. Trái lại pH tối ưu từ nguồn thực vật
thượng đẳng từ 6,0 đến 7,5 - 8.

Hình 2.5 Sự thủy phân pectin dưới sự xúc tác của PME
(www: micro.magnet.fsu.edu)

2.2.2 Cơ chế hoạt động thủy phân
PME loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng tương tác ái nhân của
enzyme lên ester làm hình thành hợp chất trung gian acyl - enzyme và phóng thích
methalnol. Tiếp theo sau là phản ứng đề acyl hóa, là phản ứng thủy phân của hợp chất
trung gian acyl - enzyme để giải phóng enzyme và acid cacboxylic.
2.3 Nguồn tổng hợp pectin methylester từ vi sinh vật
Nguồn PME được sử dụng nhiều nhất trong các chế phẩm pectinase thương mại là
PME từ vi sinh vật. Sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật có những ưu thế như sau:
- Vi sinh vật có tốc độ sinh sản rất nhanh. Nhiều nghiên cứu cho thấy trong một ngày
đêm, tốc độ tạo sinh khối của vi sinh vật cao gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng
sinh khối của động - thực vật. Do đó, trong cùng một thời gian, vi sinh vật có thể tổng
hợp một lượng enzyme hơn hẳn so với động - thực vật.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

6


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

- Hoạt tính enzyme được tổng hợp từ vi sinh vật cao hơn hoạt tính enzyme được tổng
hợp từ động vật và thực vật. Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và
tốc độ tăng sinh khối của vi sinh vật.
- Tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp.
Ta có thể thiết lập và kiểm soát các yếu tố thích hợp, đáp ứng được yêu cầu của một
quá trình sản xuất công nghiệp.
- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme từ vi sinh vật rẻ tiền và dễ kiếm, đôi khi
chỉ là phế phẩm của một số quá trình sản xuất. Chính vì thế enzyme được sản xuất ra
có giá thành thấp hơn enzyme từ các nguồn khác. Điều này có ý nghĩa lớn về mặt
kinh tế và cả về mặt môi trường sống.
- Ngoài ra, một loại vi sinh vật có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau.
PME từ vi sinh vật có khối lượng phân tử từ 27,8 - 40 kDa. Các loại vi sinh vật có khả
năng tổng hợp PME gồm: nấm mốc: Penicillium glaucum, P. ehrlichii, P.
Chrysogenum, P. expanam, P. cilrimim, Aspergillus awamori, A. foetidus, A. niger, A.
terrus, A. saitoi…; nấm men: Saccharomyces fragilis…và vi khuẩn: Bacillus
polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes...
PME từ nấm mốc
PME thường được thu nhận từ các loại nấm sợi. PME từ nấm mốc là các loại enzyme
ngoại bào. Chúng hoạt động trong khoảng nhiệt độ tối ưu 30 - 450C và bị vô hoạt ở
nhiệt độ lớn hơn 550C. pH tối ưu của nấm mốc trong khoảng 3,0 - 5,5. PME từ các
loài Aspergillus là điển hình cho các PME có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong vùng
acid. Hoạt động của PME từ Aspergillus niger đạt tối đa ở pH 5,5 và nhiệt độ 400C.
Trong khi pH tối ưu của PME từ Aspergillus sp. là 3,7 - 4,2 và PME từ Aspergillus
sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
PME từ vi khuẩn
Cùng có nguồn gốc từ vi sinh vật nhưng PME từ vi khuẩn không có tính acid mà lại
có tính hơi kiềm. pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 7 - 8 và hầu hết bị vô hoạt ở

850C (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004). PME từ vi khuẩn Erwinia chrysanthemi có pI
là 9,64 (Laurent et al., 1993).
Trong đề tài nghiên cứu này, nấm Aspergillus niger được sử dụng với cơ chất pectin
để sản xuất enzyme pectin methylesterase.
2.4 Hoạt độ enzyme
2.4.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme
Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không
định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

7


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

định độ hoạt động (còn gọi là hoạt độ) của enzyme. Trong phản ứng có enzyme xúc
tác, sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật
lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi
đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ
chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng.
Để xác định hoạt độ của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường
dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học. Các phương pháp so màu, đo khí, đo độ
phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ... được dùng phổ biến trong nghiên cứu định lượng
các phản ứng enzyme.
Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian
nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay

sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định.
- Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự
biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong,
2008).
2.4.2 Đơn vị hoạt độ enzyme
Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốc tế
(hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961 (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong,
2008). Đơn vị hoạt độ của một enzyme được coi là lượng enzyme có khả năng xúc tác
làm chuyển hóa được một lượng cơ chất nhất định trong một đơn vị thời gian nhất
định ở điều kiện tiêu chuẩn. (Đặng Thị Thu et al., 2004)
- Đơn vị IU (đơn vị quốc tế): là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được
một micromol (1µM) cơ chất sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 IU = 1µM cơ chất (10-6 M)/ phút
(Đặng Thị Thu et al., 2004)

- Đơn vị Katal (kat): là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một mol cơ
chất sau thời gian một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 kat = 1 Mol cơ chất/ giây
Và

1 U = 1/60 microkat = 16,67 nkat
(Đặng Thị Thu et al., 2004)

- Hoạt độ riêng:

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

8

Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động còn cần phải đánh
giá độ sạch của nó. Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme là hoạt độ
riêng (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2008).
Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị hoạt độ enzyme trên đơn vị khối
lượng protein. (Đặng Thị Thu et al., 2004)
IU hoặc kat/ 1 mg (ml) protein
- Hoạt độ phân tử (hoặc hoạt độ riêng phân tử)
Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry. Khi đã
biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân tử.
Hoạt độ phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme sau
một đơn vị thời gian (thường là phút). (Đặng Thị Thu et al., 2004)
Hoạt độ phân tử lớn (còn gọi là con số chuyển hóa hoặc con số vòng: turnover
number) có nghĩa là phản ứng được xúc tác xảy ra rất nhanh. Như vậy, hoạt độ phân
tử chính là khả năng xúc tác: hoạt độ phân tử càng cao thì khả năng xúc tác càng lớn
(Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2008).
- Hoạt độ tâm xúc tác: là số phân tử cơ chất bị chuyển hóa bởi một trung tâm hoạt
động sau một phút. (Đặng Thị Thu et al., 2004)
2.4.3 Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme
- Khi xác định hoạt độ enzyme cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân tích ở vùng
thích hợp.
- Bên cạnh pH và nhiệt độ, cũng cần quan tâm đến cơ chất, thành phần đệm, lực ion
hay nồng độ muối, các chất làm bền như Ca2+, glycerol, albumin huyết thanh bò
(BSA) hay một số chất khác.
- Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định, vì vậy phải
dùng một loại đệm hay một hệ thống đệm nào đó. Nồng độ đệm thường dùng là 20-50
nM. Tuy vậy, với các phản ứng sinh acid, base thì phải dùng đệm ở nồng độ cao hơn

để tránh sự thay đổi pH trong quá trình phân tích. Một số đệm (như đệm phosphate)
có thể làm kết tủa một số yếu tố cần thiết cho hoạt động của enzyme như Ca2+, Zn2+,
vì vậy phải lựa chọn loại đệm thích hợp cho phân tích.
- Trong phân tích hoạt độ enzyme, cơ chất và sản phẩm, đệm đều phải đạt cùng nhiệt
độ phân tích khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng. Với các phân tích đồng thời
nhiều mẫu, thời gian bắt đầu và kết thúc phản ứng của tất cả các mẫu phải được duy
trì như nhau.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

9


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

2.4.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme
Nghiên cứu động học enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nồng độ cơ
chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm… đến tốc độ phản ứng do
enzyme xúc tác. Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ cho biết được các vấn đề sau:
- Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme.
- Hiểu biết được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme.
- Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý luận lẫn thực tiễn: khi lựa chọn các đơn vị
hoạt động enzyme cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với hoạt động của
enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chúng.
- Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme, vì cần kiểm tra về
mặt lượng bằng cách xác định có hệ thống hoạt động của chế phẩm enzyme trong các
giai đoạn tinh chế.
(Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2008)

2.5 Sản xuất pectin methylesterase từ nấm mốc Aspergillus niger
2.5.1 Giới thiệu sơ lược về giống vi sinh vật
Aspergillus niger (Hình 2.6) thuộc lớp nang khuẩn Ascomycetes, bộ cúc khuẩn
Plectascales, họ Aspergillaceae. Aspergillus niger là nấm mốc sinh sản vô tính bằng
cách tạo thân quả hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính là tập hợp của những khuẩn ty
cao xuất phát từ một tế bào lớn. Các nang quả phình to ở nang trên, chỗ phình to có
dạng hình cầu, hình bầu dục được gọi là túi định. Từ túi định có vô vàn những mầm
nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các mầm này gọi là các
bào tử đính. Aspergillus niger có bào tử đính màu vàng.
Aspergillus niger có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào như
amylase, protease, pectinase, lipase, xylanase, cellulase, catalase, phytase, glucose
oxidase… (Ly Nguyen, 2004)

Hình 2.6 Hình dạng nấm Aspergillus niger
(www.kacatko.wordpress.com) (www.eurobloodsubstitutes.com)

Nấm Aspergillus niger trên môi trường Czapek 10 ngày tuổi có đường kính 2,5 - 3,0
cm, màu đen. Khối bào tử trần đỉnh bọng hình cầu, sau hình tia tỏa tròn hoặc tách
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

10


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

thành các cột 700 - 800 µm đường kính, đôi khi có các khối bào tử trần nhỏ màu nâu
đen. Giá bào tử trần nhẵn, dài 1,5 - 3,0 cm. Bọng đỉnh giá hình cầu, 45 - 75 µm đường

kính. Cuống thể bình phần lớn 5 - 6 x 20 - 30 µm, đôi khi 6 - 10 x 60 - 70 µm. Thể
bình 3,0 - 3,5 x 8 - 10 µm. Bào tử trần hình cầu, phần lớn 4 – 5 µm đường kính, ráp
hoặc có gai không đều, thành chuỗi gốc non.
Nấm Aspergillus niger khi mọc trên môi trường Sabouraud agar phủ đầy lông tơ và
đầy bột, ban đầu có màu trắng, chuyển dần sang màu nâu và trở thành màu đen đến
đen huyền. Vách của những cuống bào tử đính nhẵn. Xung quanh vách bào tử đính
màu nâu, hình thành những chuỗi hạt.
Hình dạng và kích thước: Đầu của bào tử đính có hình cầu hoặc hình cột tùy theo tuổi.
Kích thước: trên 3 mm x 15 – 20 µm. Bào tử đính có hình cầu. Kích thước: 3,5 - 5,0
µm.
Aspergillus niger có hoạt tính khác nhau ở những chủng khác nhau. Giống mốc này
có thể chịu được pH thấp, nhiệt độ thích hợp 30 - 330C.Vùng phân bố của nấm
Aspergillus niger rất rộng do có thể sinh trưởng trên nhiều cơ chất khác nhau như: các
loại ngũ cốc, quả chín, da động vật phân hữu cơ và trên một số loại nhựa.
Môi trường dùng nuôi cấy nấm Aspergillus niger thường là ba loại môi trường sau:
- Môi trường Czapek dox agar
- Môi trường Sabouraud agar
- Môi trường Potato dextro agar
2.5.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi vi sinh vật thu pectinase bắt buộc phải có mặt chất cảm ứng pectin.
Ngoài ra, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn
đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành enzyme. Nitơ tham gia vào
quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào
sinh vật. Môi trường có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết sẽ tích lũy lượng enzyme
lớn nhất. Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa cấu tử kia, vì
vậy cần phải chọn thành phần môi trường và tỷ lệ các chất dinh dưỡng sao cho thích
hợp với từng chủng. Môi trường dùng trong nuôi cấy chìm thường là môi trường lỏng
và được sục khí liên tục. Thành phần dinh dưỡng chính của môi trường lỏng gồm:
- Nguồn cung cấp cacbon: chủ yếu lấy từ các loại đường dễ đồng hóa như: glucose,
fructose, maltose, saccharose,... dịch thủy phân cellulose, tinh bột... Ngoài ra có thể từ

nguồn phi glucid như: glycerol, các acid béo… (Đặng Thị Thu et al., 2004)
- Nguồn nitơ: Nguồn thức ăn nitơ có vai trò rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp
enzyme pectinase bởi vi sinh vật.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

11


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

+ Nitơ vô cơ: (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NaNO3, NH4NO3,…
+ Nitơ hữu cơ: nước chiết malt, nước chiết ngô, cao nấm men, cao ngô, pepton, bột
cá, khô dầu… (Đặng Thị Thu et al., 2004)
Đối với Aspergillus niger, nitơ tốt nhất cho sự tổng hợp pectinase là (NH4)2SO4, muối
này cho kết quả cao hơn khi dùng các nguồn nitơ hữu cơ như pepton, casein thủy
phân (Đặng Thị Thu et al., 2004).
- Muối khoáng và vitamin: MgSO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, Fe2SO4,… vitamin B1,
B12, Biotin… (Đặng Thị Thu et al., 2004)
Hàm lượng chất khô hòa tan thường là 10 – 15% (Trần Minh Tâm, 2000).
Sau khi bổ sung các chất dinh dưỡng theo tỷ lệ phù hợp, môi trường được thanh trùng
nhằm tiêu diệt các vi sinh vật có sẵn và nhiễm vào trong môi trường. Nếu không,
chúng sẽ ức chế sự phát triển của giống vi sinh vật mà ta nuôi cấy. Thông thường, môi
trường sẽ được thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 1210C trong thời gian 15-30 phút,
sau đó để nguội xuống 300C và cấy vi sinh vật vào. Tỷ lệ tiếp giống nằm trong
khoảng 2-5%, nhưng ở một số chủng tỷ lệ này thấp hơn nhiều (0,5-0,6%). Sau khi
nuôi, ta thu được canh trường lỏng - dạng thô (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong,
2008).
2.5.3 Cơ chất cảm ứng (pectin)

Cơ chất cảm ứng được xem như yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá trình
sinh tổng hợp enzyme. Khi cho cơ chất vào môi trường nuôi cấy với liều lượng tăng
dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng sẽ tăng dần, đến một lúc nào đó quá trình
này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu bởi cơ chất
gây nên. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004) Tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao nhất ở
một liều lượng xác định nên cần sử dụng cơ chất cảm ứng với liều lượng thích hợp.
Nếu vượt quá nồng độ tối đa cho phép thì khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm.
Cơ chất pectin:

Hình 2.7 Mô tả vách tế bào thực vật
(www: micro.magnet.fsu.edu)
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

12


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

Pectin là một thành phần quan trọng của vách tế bào thực vật (Hình 2.7) chủ yếu ở
lớp giữa vách tế bào sơ cấp của hầu hết các mô thực vật bậc cao. Pectin là một
polymer mạch thẳng được tạo thành từ các phân tử acid galacturonic liên kết với nhau
bằng liên kết α-1,4-glucoside (Hình 2.8). Khối lượng phân tử của pectin từ 80000 200000 (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
Pectin thương mại có hàm lượng acid galacturonic thường hơn 75% và độ ester hóa từ
30 - 80 % (Ly Nguyen, 2004). Pectin hòa tan trong dung dịch amoniac, dung dịch
kiềm, cacbonat natri và trong glycerin nóng. Độ hòa tan của pectin trong nước tăng
lên khi mức độ ester hóa trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin
giảm (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).

Hình 2.8 Cấu tạo pectin
(www: sci-toys.com/ingredients)

Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào. Pectin chứa acid
polygalacturonic, araban và galactan. Trong đó lượng acid polygalacturonic chiếm tới
40 - 60%. Khi thủy phân, pectin tách thành hai phần:
- Phần trung tính - phức chất galactanoaraban
- Phần acid - acid pectic.
Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hoà tan. Trong màng tế bào và gian bào, chúng
nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin. Pectin thương mại có hàm lượng acid
galacturonic thường hơn 75% và độ ester hóa từ 30 - 80 %.
Trong tế bào thực vật, pectin liên kết với cellulose tạo thành protopectin tạo nên sự
cứng chắc cho tế bào. Protopectin không tan trong nước, khi bị thủy phân dưới tác
dụng của acid thì chuyển thành pectin. Protopectin ở màng gian bào có chứa lượng
kim loại khá cao và một lượng nhóm methoxyl đủ để làm protopectin bền vững. Còn
protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ methoxyl hóa
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

13


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt. (Nguyễn Đức Lượng et al.,
2004)
Dựa vào độ ester hóa, người ta phân làm ba dạng: pectin hòa tan, acid pectinic và acid
pectic.
- Pectin hòa tan: Pectin hòa tan có 2/3 số nhóm carboxyl của acid polygalacturonic

được ester hóa bằng methanol. Pectin được ester hóa sẽ tạo gel đặc trong dung dịch
acid và trong dung dịch đường có nồng độ cao (khoảng 60 - 65%). Enzyme pectinase
tác động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học
không đồng dạng. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)
- Acid pectinic: Acid pectinic là acid polygalacturonic có mức độ ester hóa trung bình
bằng các nhóm methanol. Muối của acid pectinic là pectinate. (Nguyễn Đức Lượng et
al., 2004)
- Acid pectic: Acid pectic là acid polygalacturonic đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm
methxyl, trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị acid
galacturonic. Muối của acid pectic là pectate. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
2.5.4 Phương pháp nuôi cấy chìm (phương pháp nuôi cấy bề sâu)
Khác với quá trình trao đổi chất ở động vật và thực vật, quá trình trao đổi chất ở vi
sinh vật trong một giới hạn môi trường nhất định được gọi là quá trình lên men. Trong
quá trình lên men, vi sinh vật tham gia quá trình tổng hợp enzyme. Quá trình tổng hợp
enzyme thường xảy ra liên tục cả trong điều kiện yếm khí và trong điều kiện hiếu khí.
Trong công nghiệp enzyme hiện nay, người ta thường áp dụng quá trình nuôi hiếu khí
để thu nhận enzyme. Hiện nay có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thu nhận
enzyme: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm.
Phương pháp nuôi cấy chìm là phương pháp vi sinh vật phát triển, sinh sản và trao đổi
chất trong lòng môi trường. Vi sinh vật hiếu khí chỉ sử dụng được oxygen hòa tan
trong môi trường, vì vậy trong quá trình nuôi cấy phải sục khí và khuấy liên tục. Sự
sục khí không những ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật mà còn ảnh hưởng
đến sự tạo thành enzyme. Khuấy trộn có tác dụng phân phối tế bào vi sinh vật đều
khắp trong môi trường, đồng thời tạo điều kiện cho vi sinh vật tiếp xúc với chất dinh
dưỡng, cơ chất. Khả năng tiếp xúc càng nhiều vi sinh vật phát triển và sinh sản càng
mạnh, khả năng sinh tổng hợp emzyme càng cao. Trong quá trình khuấy trộn, oxy có
trong không khí trên bề mặt môi trường sẽ được hòa tan vào môi trường cho vi sinh
vật sử dụng (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004). Tốc độ sử dụng oxygen cao nhất của
nấm mốc sau khoảng 24 giờ nuôi cấy rồi giảm dần. Sinh tổng hợp enzyme theo
phương pháp nuôi cấy chìm thường khoảng từ 2 - 4 ngày. Đa số các enzyme thủy

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

14


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

phân do nấm mốc, xạ khuẩn tạo thành được tiết ra môi trường xung quanh, phần còn
lại trong hệ sợi sau ba ngày nuôi cấy khoảng 10-15%.
Nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme theo phương pháp chìm được thực hiện trong các
bình lên men có cánh khuấy và sục khí liên tục. Đây là một phương pháp tiến bộ và
hiện đại được áp dung rộng rãi ở nhiều nước phát triển (Đặng Thị Thu et al., 2004).
Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy chìm
- Ưu điểm
+ Có tính liên tục, tiết kiệm được diện tích sản xuất
+ Dễ cơ giới hóa và tự động hóa, do đó năng suất cao
+ Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường
+ Enzyme thu được ít lẫn tạp chất
- Nhược điểm
+ Nồng độ enzyme trong canh trường thấp, do đó phải cô đặc nên giá thành cao
+ Tốn nhiều điện năng do sục khí liên tục
+ Khi không đảm bảo được vô trùng tuyệt đối thì dễ xảy ra sự nhiễm toàn bộ khối môi
trường.
(Đặng Thị Thu et al., 2004; Trần Minh Tâm, 2000)

2.5.5 Thu nhận enzyme
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme thô. Vì ngoài thành

phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước
có trong môi trường.
Tùy theo mục đích sử dụng, ta có thể dùng chế phẩm thô này ngay, không cần qua
quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch
enzyme. Khi enzyme được tách hết nước, sinh khối vi sinh vật và thành phần môi
trường, chúng ở dạng tinh thể, ta thu được chế phẩm enzyme sạch. Sau đó có thể dùng
các tác nhân kết tủa thuận nghịch như aceton, ethanol, muối trung tính để có chế
phẩm enzyme ở dạng sạch hơn. Từ chế phẩm sạch này, bằng kỹ thuật điện di, lọc
gel… ta có thể tách từng phần để có enzyme tinh khiết hơn. (Đỗ Quý Hai và Trần
Thanh Phong, 2008)
Để thu nhận được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được
trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối amonium sulfat.
Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa pectinase có thể là ethanol. Dung môi hữu cơ có
tác dụng làm giảm hệ số điện môi của môi trường thì protein và enzyme bị kết tủa.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

15


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2010

Đại học Cần Thơ

Khi kết tủa bằng ethanol thì lượng ethanol sử dụng phải gấp 3 - 4 lần dịch chiết
enzyme, nên khuấy đều để phân phối ethanol trong dung dịch. Khi có kết tủa thì lọc
hoặc ly tâm để thu kết tủa, rửa kết tủa bằng rượu đậm đặc 2 - 3 lần để tách bớt nước
trong kết tủa và sau đó đem sấy kết tủa. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)
Ngoài ra, cũng có thể dùng muối trung tính là amonium sulfat để kết tủa enzyme vì độ
hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ, không làm biến
tính enzyme, enzyme thu được có hoạt tính cao hơn so với các enzyme thu được bằng

phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ. Tuy nhiên, khi sử dụng muối trung tính cũng
có nhược điểm là lượng dung dịch dùng gấp 5 - 6 lần dịch chiết enzyme và không thể
tái thu hồi được dung dịch muối. (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme pectin methylesterase
2.6.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy
Đặc điểm chung của mọi môi trường nuôi vi sinh vật thu pectinase là có mặt chất cảm
ứng: pectin từ vỏ bưởi hoặc từ nguồn khác. Ngoài ra, tỷ lượng giữa carbon và nitơ
trong môi trường, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý
nghĩa lớn đối vối sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành enzyme, đồng
thời các nguồn khoáng dinh dưỡng phải phù hợp đảm bảo cho sự sinh enzyme ở mức
tối ưu.
2.6.2 pH môi trường
Độ pH môi trường có một ý nghĩa rất lớn nên chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật
và sự tổng hợp enzyme theo mong muốn. pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng
không nhỏ tới sự phát triển của nấm mốc và sự tạo ra enzyme (Trần Xuân Ngạch,
2007). Khoảng pH thích hợp của môi trường nuôi cấy Aspergillus niger sinh PME là
4,0 - 6,5. Khi dùng các muối amonium làm nguồn nitrogen, quá trình phát triển vi
sinh vật sẽ acid hóa môi trường; còn khi dùng nitrate làm nguồn nitrogen môi trường
sẽ bị kiềm hóa. Khi pH dịch về phía acid hoặc phía kiềm, sự tạo thành sinh khối
không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm. (Nguyễn Đức
Lượng et al., 2004).
2.6.3 Thời gian nuôi
Đối với nấm sợi Aspergillus, sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm bắt đầu
sinh đính bào tử. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm
hoạt tính enzyme (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
Nấm mốc Aspergillus niger được nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu nên giai đoạn
sinh trưởng và phát triển kéo dài do nấm mốc khó tiếp xúc với nguồn chất dinh dưỡng
trong môi trường nuôi cấy hơn so với phương pháp bề mặt. Vì vậy, thời gian nuôi cấy
tương đối dài, khoảng 72 giờ - 144 giờ. (Vinod Kumar Joshi et al., 2006).
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

16