Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của một số phân đoạn dịch chiết từ quả bí đao (benincasa hispida cogn ) (LV00647)

1

Lời cảm ơn

Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt ngiệp,
tôi đã nhận được những lời chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của cô giáo: Tiến sĩ
Trần Thị Phương Liên.
Bên cạnh đó, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Trung tâm chuyển
giao công nghệ, các Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo các điều kiện
thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm việc. Cùng với đó là sự hỗ trợ nhất
định từ gia đình, bạn bè và đồng nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

Xuân Hòa, ngày 26 tháng 11 năm 2011
Học viên

Nguyễn Mạnh Cường

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮ DÙNG TRONG LUẬN VĂN


2

ĐTD

Đái tháo đường

HDL –c

High density lipoprotein cholesterol (Cholesterol tỉ
trọng cao)

VLDL –c

Very low dentisy lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng
thấp

LDL –c

liên kết cholesterol)

Low dentisy lipoprotein cholesterol (Lipoprotein
liên kết cholesterol)

STZ

Streptozotocin

TC

Total cholesterol (Cholesterol toàn phần)

TG

Triglyxeride

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài.
Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn trao đổi chất với biểu hiện
chung nhất là chứng tăng đường huyết. Căn bệnh này đang trở thành mối

nguy hại đối với toàn cầu bởi trung bình 10 giây có một người tử vong vì
ĐTĐ.
Hiện trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh đái
tháo đường. Dự báo đến năm 2030, con số này sẽ tăng lên 366 triệu
người
Thống kê của Hội Người giáo dục bệnh ĐTĐ Việt Nam cho thấy,
nếu như năm 2002, tỷ lệ người mắc ĐTĐ chiếm 2,7% dân số thì hiện
con số này đã lên trên 7,2%, trong đó khu vực các đô thị, thành phố lớn
tập trung nhiều người mắc nhất.


3

ĐTĐ không chỉ có tính chất là một bệnh mạn tính, ĐTĐ còn kèm
theo nhiều biến chứng nguy hiểm như các bệnh về thận dẫn đến suy
thận, bệnh về mắt dẫn đến mù lòa, tổn thương hệ thần kinh và đặc biệt là
các biến chứng về mạch máu (xơ vữa động mạch) có thể dẫn đến tử
vong như bệnh mạch vành, nhồi máu não, xuất huyết não…[17], [45],
[23], [7], [16].
Y học ngày nay đã có nhiều loại thuốc chữa bệnh ĐTĐ có hiệu
quả như insulin, sulfonylurea, biguanid, ... Tuy nhiên, hầu hết các loại
thuốc này đều có tác dụng phụ và chi phí điều trị đắt đỏ [10], [30], [2],
[22].
Những kinh nghiệm cổ truyền và cả những công bố khoa học hiện
đại cho thấy bí đao là món ăn bài thuốc hữu hiệu trong phòng chống các
bệnh liên quan đến oxy hoá, trong đó có thừa cân béo phì và các bệnh
tim mạch khác.
Với những lí do trên, nhằm góp phần tìm kiếm và nghiên cứu
thuốc điều trị đái tháo đường từ thành phần hóa học cơ bản của quả Bí
đao (Benincasa hispida Cogn.) trên chuột nhắt gây bệnh ĐTĐ bằng

streptozotocin (STZ), chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu
“Nghiên cứu đặc tính hoá sinh dược của một số phân đoạn dịch chiết
từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)”.
2. Mục đích nghiên cứu.
Đánh giá hoạt tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết
từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.).
3. Nhiệm vụ nghiên cứu.


4

3.1. Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất tự nhiên có trong quả
Bí đao (Benincasa hispida Cogn.).
3.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin –
Ciocalteau.
3.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch
chiết quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) trên mô hình chuột ĐTĐ mô
phỏng type 2.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
5. Phương pháp nghiên cứu
6. Đóng góp mới của đề tài.
Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết của một số phân đoạn
dịch chiết lên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 thông qua chỉ số
glucose huyết, các chỉ số lipit máu trên chuột sau 21 ngày điều trị.


5

NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về một số hợp chất tự nhiên ở thực vật.
1.1.1. Flavonoid thực vật.
Trong số các polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan
trọng vì chúng phổ biến ở hầu hết các loài thực vật và có nhiều hoạt tính
sinh - dược học có giá trị [9].
1.1.1.1. Cấu tạo hoá học và phân loại.
1.1.1.2. Hoạt tính sinh học của flavonoid.
* Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant)
* Tác dụng kháng khuẩn
* Tác dụng làm bền thành mạch máu
* Tác dụng giảm béo phì và lipid máu
1.1.2. Hợp chất phenolic.
1.1.2.1. Phân loại.
Dựa vào thành phần và cấu trúc, người ta chia hợp chất phenolic
thành 3 nhóm:
- Nhóm hợp chất phenolic đơn giản
- Nhóm hợp chất phenolic phức tạp
- Nhóm hợp chất phenolic đa vòng
1.1.2.2. Vai trò của hợp chất phenolic trong thực vật.
Hợp chất phenolic được hình thành từ những sản phẩm của quá
trình đường phân và con đường pentose qua acid cynamic hay theo con
đường acetate malonate qua Acetyl- CoA. Nhóm hợp chất này có một số
chức năng trong đời sống thực vật [8], [60].


6

1.1.3. Tannin thực vật.
1.1.3.1. Cấu trúc hoá học và phân loại.
Tannin được cấu tạo dựa trên acid gallic và acid tanic. Tannin có 2

nhóm chính: tannin thuỷ phân và tannin ngưng tụ.
- Tannin thuỷ phân
- Tannin ngưng tụ
1.1.3.2. Tác dụng sinh học.
1.1.4. Alkaloid.
1.1.4.1. Khái quát về Alkaloid.
Alkaloid có tính kiềm yếu, do các mạch cacbon chứa nitơ quyết
định. Chúng có thể liên kết với kim loại nặng tạo phức và phản ứng với
một số thuốc thử đặc trưng như: Bouchardat (kết tủa màu nâu sẫm),
Vans-Mayer (kết tủa trắng ánh vàng) hay Dragendroff (màu da cam, nâu
đỏ).
1.1.4.2. Tác dụng sinh học.
Alkaloid được hình thành từ các sản phẩm của quá trình trao đổi
chất như trao đổi protein. Ở trong cây, alkaloid được coi như là chất dự
trữ cho tổng hợp protein, các chất bảo vệ cây, tham gia vào sự chuyển
hoá hydro ở các mức độ khác nhau ... [8], [30].
1.1.5. Hợp chất coumarin.
1.1.6. Terpen thực vật.
1.2. Bệnh béo phì (Obesity).
Tổ chức y tế thế giới (WHO) định nghĩa béo phì (Obesity) là tình
trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng hay toàn
bộ cơ thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe. Tổ chức này dùng chỉ số khối cơ


7

thể BMI (Body Mass Index) để đánh giá tình trạng dư thừa hay thiếu hụt
mỡ của mỗi người.
Bảng 1.1. Phân loại BMI của người trưởng thành châu Âu và châu
Á [2].

1.2.1. Thực trạng béo phì trên thế giới và Việt Nam.
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện nay số người béo phì đã lên
tới 1,7 tỉ người [3], không chỉ gặp nhiều ở các quốc gia phát triển mà còn
gặp cả ở các quốc gia đang phát triển.
Tại Việt Nam, theo tiêu chuẩn cho người châu Á, số người thừa
cân béo phì cũng tăng theo thời gian. Năm 1991 theo điều tra của Lê
Huy Liệu và cộng sự thì tỉ lệ thừa cân mắc bệnh béo phì nói chung tại
Hà Nội là 1,1%. Đến năm 2000 con số này đã là 2,62% tăng gần 2,5 lần
trong vòng 10 năm (điều tra của Lê Văn Hải) [3].
1.2.3. Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì.
Người béo phì có nguy cơ bệnh tật cao hơn so với người thường
do nhiễm độc mỡ máu, tiêu biểu như:
* Bệnh tim mạch
* Rối loạn lipid máu
* Tiểu đường
* Đột qụy
* Ngoài ra béo phì còn làm gia tăng nguy cơ của nhiều bệnh khác
1.2.4. Nguyên nhân và giải pháp phòng, điều trị béo phì.
Nguyên nhân chính dẫn đến thừa cân béo phì là do khẩu phần và
thói quen dinh dưỡng không hợp lý, hoạt động thể lực kém dẫn đến


8

năng lượng hấp thụ vào cơ thể vượt quá mức cần thiết và tích lũy
dưới dạng mỡ.
Thuốc chống béo phì được chia làm hai nhóm lớn.
* Nhóm có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương.
* Nhóm tác dụng lên hệ tiêu hóa.
Thuốc điều trị béo phì phổ biến hiện nay là Metformin thuộc nhóm

hai với tác dụng chủ yếu là ức chế phân giải glycogen thành glucose ở
gan, làm tăng tính nhạy cảm của insulin ngoại vi, tác động hạ glucose
trong khoảng 2 - 4 mmol/l, giảm HbA1C đến 2%.
1.2.5. Rối loạn trao đổi lipid máu.
Để đánh giá lượng mỡ trong máu người ta làm xét nghiệm với các
chỉ số:
* Cholesterol toàn phần (2,9 – 5,2 mmol/l);
* Triglycerid (0,8 – 2,3 mmol/l);
* HDL-c (0,90 – 1,50 mmol/l);
* LDL-c (0,5 – 3,4 mmol/l).
1.3. Bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus).
1.3.1. Khái niệm và phân loại.
Danh từ đái tháo đường (Diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng
Hy Lạp (Diabetes: nước chảy trong ống syphon) và tiếng Latinh
(mellitus: ngọt) [65]. Khoảng 1550 năm trước công nguyên các thầy
thuốc Hy Lạp đã mô tả bệnh này với các triệu chứng ăn nhiều, uống
nhiều, tiểu nhiều, nước tiểu có đường và sút cân nhanh [4]. PGS. TS Tạ
Văn Bình định nghĩa đái tháo đường là một hội chứng có đặc tính biểu
hiện bằng tăng đường máu, do hậu quả của việc mất hoàn toàn insulin


9

hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của
insulin. Bệnh ĐTĐ được xác định dựa vào những tiêu chí trong bảng 1.2
[4].
Bảng 1.2. Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WHO.
Dựa vào những hiểu biết về nguyên nhân phát sinh bệnh, ủy ban
chuyên gia về chuẩn đoán và phân loại ĐTĐ của WHO chia ĐTĐ thành
các loại như sau: ĐTĐ type 1; ĐTĐ type 2

1.3.2. Thực trạng đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam.
Cùng với các bệnh không lây nhiễm khác, bệnh ĐTĐ đang phát
triển với tốc độ nhanh chóng cùng sự phát triển của nền kinh tế xã hội.
Năm 1994, toàn thế giới có 98,9 triệu người mắc ĐTĐ. Năm 1995 đã
tăng lên 135 triệu người chiếm 4% dân số thế giới, cuối năm 2002 có
khoảng 177 triệu người [2] . Dự đoán đến năm 2010 có khoảng 222 triệu
và năm 2025 có khảng 300 triệu bệnh nhân chiếm 5,4% dân số thế giới
[2].
Việt Nam hiện nay ĐTĐ đang gia tăng rất nhanh. Hiện nay, có
khoảng hai triệu người mắc bệnh ĐTĐ nhưng có tới 65% số đó không
biết mình đã mắc bệnh. Theo PGS. TS Tạ Văn Bình: ĐTĐ type 2 ở lứa
tuổi thanh thiếu niên ngày một tăng nhanh, đây là một vấn đề rất đáng
lưu tâm [2].
1.3.3. Tác hại và biến chứng.
ĐTĐ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và khả năng làm việc của
người lao động, nhưng hơn cả là nguy cơ biến chứng của bệnh nhân
thường rất cao [4].


10

Biến chứng mắt
Biến chứng thận như
Biến chứng thần kinh ngoại vi
Tổn thương bàn chân
Biến chứng mạch máu lớn
1.3.4. Phòng và điều trị bệnh ĐTĐ.
Trừ những nguyên nhân di truyền thì ăn uống sinh hoạt hợp lý
điều độ và khám sức khỏe định kỳ là phương thức chung để phòng bệnh

nói chung và bệnh ĐTĐ nói riêng.
1.3.5. Chuyển hóa glucose và sự điều hòa glucose huyết.
1.4. Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường.
Béo phì và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nhưng nguy hiểm
nhất của thế kỉ 21. Hai căn bệnh này có mối liên quan chặt chẽ với nhau
thể hiện ở chỗ tỉ lệ người béo phì luôn tăng tương đương với số bệnh
nhân bị.
Tại Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu của Trần Đức Thọ và cộng
sự năm 1996 thì người có BMI > 25 có nguy cơ mắc ĐTD týp 2 cao gấp
3,74 lần so với người bình thường. Nghiên cứu của Thái Hồng Quang, tỷ
lệ ĐTD ở người có béo phì độ 1 cao hơn 4 lần và béo phì độ 2 là 30 lần
so với người bình thường.
1.5. Phương pháp gây đái tháo đường thực nghiệm STZ.
1.6. Vài nét chung về cây Bí đao (Benincasa hispida Cogn.).
1.6.1. Giới thiệu.
Bí đao hay bí phấn hoặc bí trắng, danh pháp khoa học: Benincasa
hispida Cogn; họ bầu bí (Cucurbitaceae)


11

1.6.2. Nguồn gốc.
Bí đao có nguồn gốc ở Ấn Độ, được trồng rộng rãi ở hầu khắp các
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á và miền đông của châu Đại
dương. Ở nước ta, quả Bí đao cũng được trồng khắp nơi. [69]
1.6.3. Phân loại, mô tả.
Cây thảo một năm, mọc leo dài tới 5m, có nhiều lông dài.
1.6.4. Thành phần hóa học.
Bí đao tươi có tỷ lệ % các chất như sau: nước 67,9, protid 0,1,
lipid 0,1, cellulos 0,7, dẫn xuất không protein 30,5, khoáng toàn phần

0,1. Trong các loại kháng có calcium 26mg, phosphor 23mg, sắt 0,3mg.
Còn có các vitamin caroten 0,01mg, vitamin B1 0,01mg, vitamin B2
0,02mg, vitamin PP 0,03mg và vitamin C 16mg. \
1.6.5. Một số tác dụng Sinh - Dược và công dụng của cây Bí đao.
[69], [70]
Bí đao là loại rau xanh thường dùng trong các bữa ăn của nhân dân
ta, cũng như dưa chuột. Có thể dùng quả Bí đao ăn luộc hoặc nấu canh
tôm, canh cua, làm nộm, xào thịt gà, thịt lợn. Bí đao còn dùng làm mứt;
mứt bí thường dùng trong dịp Tết Nguyên đán. Ăn Bí đao thông tiểu,
tiêu phù, giải khát, mát tim, trừ phiền nhiệt, bớt mụn nhọt.


12

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu.
2.1.1. Mẫu thực vật.
+ Cây Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)
+ Bộ phận sử dụng: quả bí đao.
+ Địa điểm thu mẫu: Xuân hòa – Phúc Yên – Vĩnh Phúc
+ Mẫu thực vật do Bộ môn Thực vật học - Trường ĐH Sư phạm
Hà nội 2 giám định.
2.1.2. Mẫu động vật.
Chuột nhắt trắng (Mus musculus) chủng Swiss 4 tuần tuổi (14-17g)
do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp. Chuột được nuôi trong
điều kiện nhiệt độ phòng 22- 25°C với chu kỳ sáng 12h và tối 12h.
2.1.3. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm.
2.1.3.1. Hóa chất..
2.1.3.2.Các dụng cụ thí nghiệm:
2.2. Phương pháp nghiên cứu.

2.2.1. Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu.
Từ 3000g quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) sấy khô được
ngâm chiết với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng 22oC trong vòng 45 ngày
(quá trình được lặp lại 3 lần). Gộp các dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3
lần và cất lại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không
thu được cao tổng số ethanol được hòa tan trong nước nóng và chiết lần
lượt với các dung môi n-hexan, chloroform, ethylacetate cất dung môi
dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn dịch chiết tương ứng.


13

2.2.2. Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của quả bí đao
(Benincasa hispida Cogn.).
2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên.
Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với
từng loại phản ứng định tính [21]. Các nhóm phản ứng được trình bày
tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng các phản ứng định tính đặc trưng.
2.2.2.2. Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp FolinCiocalteau.
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong
mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So
màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng
chất chuẩn là acid gallic [65].
Các bước tiến hành như sau:
* Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất
* Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic
* Định lượng phenolic
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn quả Bí đao
(Benincasa hispida Cogn.) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh

máu của chuột béo phì thực nghiệm.
2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết quả Bí đao bằng đường uống theo
phương pháp Lorke [51]. Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được
phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg (thể
tích và khối lượng tối đa cho phép). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết


14

trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết quả Bí đao (Benincasa
hispida Cogn.).
2.2.3.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm
sóc bình thường trong 3 - 4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau
đó chúng tôi tiến hành phân chuột thành 2 nhóm với hai chế độ dinh
dưỡng như sau:
Nhóm 1 – Nhóm đối chứng
Nhóm 2 - Nhóm nuôi béo
Bảng 2.2. Thành phần thức ăn giàu lipid [64], [66]
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các
phân đoạn dịch chiết quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) trên mô
hình chuột ĐTĐ type 2
Để tìm hiểu tác dụng của dịch chiết cây quả Bí đao lên đường
huyết, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng
type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của
Srinivasan [66].
2.2.4.1. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
Để có mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ
ăn giàu chất béo và cholesterol sau 8 tuần, được tiêm màng bụng liều

đơn STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0,01M, pH = 4,3).
Đo đường huyết tại các thời điểm 0 giờ (trước khi tiêm STZ), 24
giờ, 48 giờ và 72 giờ (sau khi tiêm STZ) (3 lần, mỗi lần cách nhau 1
tiếng và lấy trung bình). Chuột nào có đường huyết cao (≥18 mmol/l) và
ổn định được lựa chọn để cho uống cao các phân đoạn dịch chiết trong


15

vòng 21 ngày. Đường huyết trong các trường hợp trên đều được đo sau
khi cho chuột nhịn qua đêm (12 giờ), chỉ cho uống nước.
2.2.4.2. Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch
chiết.
Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và
điều trị hằng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn dịch chiết như
bảng 2.3. Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời
điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi
điều trị), ngày thứ 5, thứ 10, thứ 15, thứ 21 khi điều trị.
Bảng 2.3. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các
phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.).
2.2.5. Một số kĩ thuật phân tích hóa sinh.
2.2.5.1. Phương pháp định lượng glucose huyết.
Xác định nồng độ glucose huyết trên máy đo đường huyết với que
thử tự động One Touch Ultra.
2.2.5.2. Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh.
Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid,
HDL-c, LDL-c) được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động
(Phòng hóa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô).
2.2.5.2.1. Định lượng cholesterol toàn phần.
2.2.5.2.2. Định lượng triglycerid.

2.2.5.2.3. Định lượng HDL-c.
2.2.6. Xử lý số liệu.
Các số liệu thu được được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình 
sai số (SE), các số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm MS. Excel


16

với các phép thử t-test cho các mẫu độc lập và phân tích Anova một, hai
nhân tố với mức ý nghĩa
p < 0,05 [21].


17

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ quả Bí đao.
Để tìm hiểu thành phần hóa học của quả Bí đao, chúng tôi tiến
hành chiết như đã mô tả ở phần phương pháp thu được cao ethanol. Phân
bố đều cao ethanol trong nước cất, sau đó chiết phân lớp lần lượt với các
dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, chloroform và ethylacetat.

Hình 3.1. Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ quả
Bí đao [13].
Với quy trình chiết rút như trên, chúng tôi thu được hiệu suất chiết
rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ 3000 gam bột mịn quả Bí đao
như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ quả Bí đao.
Từ bảng 3.1 và hình 3.1 chúng ta thấy rằng hiệu suất chiết rút cao
nhất là ở phân đoạn cao ethanol (15%) so với khối lượng nguyên liệu

khô ban đầu là 50 g, tiếp đến là cao phân đoạn n- hexan (4.94%), cao
phân đoạn ethylacetate là (3.42%), cao phân đoạn nước (3.14%) và thấp
nhất là ở cao phân đoạn chloroform (2.81%). Kết quả này cho thấy trong
quả bí đao có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên.
3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các
phân đoạn dịch chiết quả Bí đao.
Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản
có trong cao các phân đoạn từ dịch chiết quả Bí đao, chúng tôi tiến hành
các phản ứng định tính, định lượng.


18

3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong quả Bí đao.
Sử dụng các thuốc thử đặc trưng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên,
chúng tôi thu được kết quả trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết quả Bí đao.
Kết quả định tính cho thấy thành phần các hợp chất trong quả Bí
đao khá phong phú, có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến như:
flavonoid, tannin, alkaloid và glycoside. Trong đó, ở phân đoạn cao
ethanol, EtOAc và phân đoạn cao cồn tổng số hầu hết các phản ứng với
các nhóm chất đều là dương tính; phân đoạn cao chloroform có chứa
tương đối đầy đủ các chất trừ các phản ứng Diazo, Mayer, Bouchardat trong đó các chất thấy với hàm lượng nhiều là polyphenol, glycoside;
các chất còn lại có nhưng với hàm lượng ít; Trong phân đoạn nước chứa
nhiều các chất như polyphenol, glycoside; không thấy xuất hiện catechin
cũng như phản ứng với Diazo và Bouchardat. Từ bảng 3.2 ta thấy ở phân
đoạn cao cồn tổng số và phân đoạn cao ethylacetate chứa rất nhiều
polyphenol và mức phản ứng mạnh và rất mạnh, chứng tỏ là hợp chất có
hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống
ung thư. Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hướng để

tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn.
3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết.
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong
các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin - Ciocalteau.
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic.
Đường chuẩn acid gallic được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung
dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành trên


19

máy ERMA ở bước sóng 765nm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và
hình 3.2.
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic.
3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số.
Bảng 3.4. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết
từ quả Bí đao.
Bảng định lượng 3.4 cho thấy rằng, hàm lượng polyphenol tổng số
trong cao phân đoạn EtOH là cao nhất (8.742%), sau đó đến phân đoạn
cao EtOAc (3.146); trong khi đó phân đoạn n- hexan và chloroform có
hàm lượng polyphenol gần tương đương nhau (chiếm 2.242% và 2.322%
tương ứng). Đối với phân đoạn nước hàm lượng polyphenol thấp nhất
(1.032%).
Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong quả Bí đao có
chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong cao ethanol và cao
ethylacetate
3.3. Kết quả xác định liều độc cấp.
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ quả Bí đao trên chuột nhắt
trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [50]. Chuột cho
nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 5 con

và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu
hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết
quả Bí đao.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đường uống.
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng
thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể


20

trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50, nghĩa là
có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao hoàn toàn không
độc dù ở liều rất cao theo đường uống.
3.4. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm.
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban
đầu là 14 - 17g) được chia làm 8 lô.
Lô 1: cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương).
Lô 2 - 8: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao như bảng 2.2.
Sau 8 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng
chuột. Kết quả sự thay đổi trọng lượng của chuột thí nghiệm được thể hiện ở
bảng 3.6 và hình 3.3.
Bảng 3.6. Trọng lượng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng hai
chế độ dinh dưỡng khác nhau.
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2
chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần.
Bảng 3.6 và hình 3.3 đã cho thấy rằng chuột được nuôi theo chế độ
ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về trọng
lượng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thường và sự sai khác
này là có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0.05. Cụ thể là:

Tại thời điểm ban đấu sự khác nhau về trọng lượng không có ý
ngĩa thống kê (p> 0.05).
Sau 8 tuần nuôi, chuột nuôi với thức ăn thường trọng lượng cơ thể
chỉ tăng thêm 24,68 g ứng với 158,82% so với ban đầu, trong khi chuột
nuôi với thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao trọng lượng cơ


21

thể tăng thêm 47,55 g ứng với 311,60% so với ban đầu. Như vậy, chuột
ăn thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao đã tăng trọng hơn so
với chuột ăn thức ăn thường là 22,87g hay gấp 1.93 lần. Đây là một kết
quả khả quan, phù hợp với thực nghiệm nuôi béo chuột của TS. Phùng
Thanh Hương (sau 8 tuần, trọng lượng HFD gấp 1.6 lần ND) [12].
Để đánh giá ảnh hưởng của chế độ nuôi béo đến một số chỉ số
lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cùng của thời gian
nuôi béo sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu
nhiên 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá
sinh. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.4 sau đây.
Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa chuột nuôi
thường và nuôi béo phì thực nghiệm.
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột
TNo.
Kết quả ở bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy các lô chuột ăn thức ăn có
hàm lượng lipit cao đều có rối loạn một số chỉ số lipit máu so với các lô
chuột ăn thức ăn bình thường. Cụ thể:
Hàm lượng LDL –c trong máu chuột ăn thức ăn béo là 1.25 mmol/l,
tăng 86.18% so với nhóm nuôi thường (0.67mmol/l) với P < 0.05. Trái lại,
HDL –c lại có sụt giảm mạnh, giảm tới 47.15% so với chuột nuôi thường
(1.23mmol/l), với P < 0.05.

Hàm lượng glucose của chuột trong nhóm ăn thức ăn béo là 7.51
mmol/l, tăng 15% so với chuột thường (6.52mmol/l). Hàm lượng
cholesterol toàn phần / triglycerid / LDL-c/ Glucose trong huyết thanh


22

của nhóm chuột nuôi béo tương ứng tăng gấp 1.25 / 1.37 / 1.85 / 1.15 lần
so với nhóm chuột nuôi bằng thức ăn thường.
3.5. Tác dụng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết từ
quả Bí đao trên mô hình chuột ĐTĐ type 2.
3.5.1. Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm.
Với nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn béo trong thời gian dài và
tiêm màng bụng STZ (pha trong đệm Citrat 0,01M, pH 4,5) với liều đơn
110 mg/kg thể trọng, chúng tôi đã thành công trong việc gây ĐTĐ type 2
thực nghiệm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 và có so sánh với
các lô chuột chỉ ăn thường tiêm STZ, chuột thường và chuột béo chỉ
tiêm đệm (Citrat 0,01M, pH 4,5).
Bảng 3.8. Nồng độ glucose huyết của các lô chuột trước và sau khi
tiêm STZ.
Nhận xét:
- Giữa chuột béo và chuột thường có tăng nhẹ về mức glucose
huyết (trước khi tiêm). Cụ thể mức glucose ở chuột nuôi chế độ ăn béo
trong thời gian 8 tuần có mức glucose huyết tăng 19.34% so với chuột
thường. Điều này chứng tỏ, những rối loạn về chuyển hóa lipid rất dễ
dẫn đến rối loạn chuyển hóa glucid. Các quá trình chuyển hóa trong cơ
thể luôn có mối quan hệ biện chứng chặt chẽ.
- Đã có sự khác nhau nồng độ glucose huyết của chuột thường
tiêm STZ so với nồng độ glucose huyết của chuột thường tiêm đệm với
độ tin cậy > 95% (tương ứng là 6.80 mmol/l và 8.04mmol/l, p < 0.001).

- Có sự khác nhau không nhiều về nồng độ glucose huyết lúc đói
giữa chuột thường tiêm đệm và chuột béo phì tiêm đệm (tương ứng là


23

6.80mmol/l và 7.35mmol/l, trị số p < 0.4), sự chênh lệnh này có thể có
do sự khác nhau ngay từ đầu về đường huyết giữa chuột nuôi thường và
chuột nuôi béo phì (do chế độ nuôi chi phối - như trên đã trình bày).
- Ở lô béo phì tiêm STZ, nồng độ glucose huyết tăng một cách rõ
rệt so với các lô thường và so với trước khi tiêm. Nồng độ glucose huyết
của các con chuột béo sau tiêm STZ 72 giờ là 21.22mmol/l. Kết quả thu
được phù hợp với nghiên cứu của GS.TSKH Đỗ Ngọc Liên và cộng sự
(2006), Phùng Thanh Hương, Trần Thị Chi Mai và nhiều nghiên cứu
khác [11], [18], khi tiến hành gây ĐTĐ bằng STZ trên mô hình chuột
béo, đều có glucose huyết tăng cao trên 18mmol/l. Điều này chứng tỏ:
hiện tượng - cơ chế béo phì, rối loạn trao đổi lipid khi bị nhiễm chất độc
vào cơ thể (chuột béo phì nhiễm chất độc STZ từ xạ khuẩn Streptomyces
achromogens) sẽ chuyển sang trạng thái ĐTĐ type 2 bền vững, khó phục
hồi (Lenzen, S. 2008) [48].
Hình.3.5. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm
trước và sau khi tiêm 72 giờ
Hiện nay, có rất nhiều mô hình ĐTĐ mô phỏng type 2, như mô
hình ĐTĐ di truyền, chuột thường ĐTĐ, nhưng mô hình chuột béo phì
ĐTĐ vẫn được ưa chuộng nhất bởi vì nó nhiều đặc điểm bệnh lý giống
với ĐTĐ type 2 ở người [48], [67]. Tuy nhiên, khả năng gây ĐTĐ type
2 ở chuột tuỳ thuộc nhiều yếu tố như dòng chuột lựa chọn, thời gian
và chế độ nuôi béo, liều tiêm STZ. Nhiều công trình khác nhau công
bố về hiệu quả mô hình này [10], [16], [45], [48], [49], [55], [58], [61],
[67].

24

Qua tham khảo và thử nghiệm chúng tôi thấy rằng: đối với
dòng chuột chủng Swiss, để có thể gây ĐTĐ với hiệu suất cao cần có
thời gian nuôi béo dài hơn thông thường từ 4- 6 tuần, kết hợp với
tiêm STZ liều thấp. Căn cứ vào liều STZ gây ĐTĐ type 2 ở chuột
cống của Reed và cộng sự (thường 50mg/kg thể trọng), chúng tôi
thấy rằng ở chuột nhắt trắng cần tiêm liều cao hơn thông thường từ
90 – 120mg/kg thể trọng. Kế thừa những nghiên cứu trước đây [11],
[10], [13]…, chúng tôi quyết định chọn tiêm liều 110mg/kg thể
trọng. Với liều tiêm như vậy, chúng tôi đã đạt được hiệu suất gây
ĐTĐ là 87% chuột có đường huyết ≥ 18mmol/l.
Lô chuột thường tiêm STZ với liều như trên, nồng độ glucose huyết
lúc đói có tăng nhẹ sau khi tiêm (nồng độ glucose lúc đói trước và sau 72
giờ tiêm tương ứng 6.56 và 8.04 mmol/l). Điều này có thể do chuột ăn
chuẩn có thể tự điều chỉnh nồng độ glucose máu nhờ tăng lượng Insulin
tiết ra để điều hòa lượng glucose trong máu.
Đối với lô chuột béo phì tiêm STZ nồng độ glucose sau 72 giờ
tiêm tăng một cách rõ rệt (từ 7.51mmol/l trước khi tiêm lên 21.22
mmol/l sau khi tiêm 72 giờ).
3.5.2. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao đến nồng
độ glucose huyết lúc đói của chuột ĐTĐ.
Với các mô hình thí nghiệm như trong phần phương pháp nghiên
cứu, chúng tôi thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.9 và hình 3.6 sau:
Bảng 3.9. Kết quả nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột
sau 21 ngày điều trị.

25

Biểu đồ 3.6. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột trước và
sau 21 ngày điều trị.
Phân đoạn chloroform và cao phân đoạn ethylacetate có tác dụng
giảm mạnh ở các ngày điều trị (5, 10, 15) và giảm mạnh nhất, rõ nhất sau
ngày 21 điều trị, lần lượt là (7.7 mmol/l và 8.4 mmol/l) tương ứng với
(giảm 64.5% và 62.3% (p < 0.05)). Phân đoạn cao cồn tổng số cũng có
tác dụng giảm mạnh ở các ngày điều trị (5, 10, 15) và giảm mạnh nhất ở
ngày điều trị thứ 21 (9.3 mmol/l tương đương giảm 58.1%, (p < 0.01)),
tác dụng giảm đường huyết của phân đoạn này tương đối đồng đều qua
các ngày điều trị. Tiếp theo là cao phân đoạn cao nước, với mức giảm tối
đa là ở ngày thứ 21 điều trị (10.1 mmol/l, tương ứng giảm 60.7%).
Thuốc metformin là loại thuốc hiệu quả trong hạ glucose huyết của bệnh
ĐTĐ với mức giảm sau 21 ngày điều trị xuống còn 9.1 mmol/l ứng với
giảm 55.9% (p < 0.01) với liều 500mg/kg thể trọng.
3.6. Tác dụng đến chuyển hóa lipid của quả Bí đao trên mô hình
chuột ĐTĐ type 2.
Để đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến một số
chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cùng của thời
gian điều trị, sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi chọn 2 lô chuột
có chỉ số đường huyết thấp, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ
số hoá sinh. Kết quả được trình bày trong bảng 3.12 và hình 3.9 sau
đây.
Bảng 3.10. So sánh một số chỉ số lipid máu ở chuột ĐTĐ trước và
sau điều trị bằng cao phân đoạn CHCl3 và cao phân đoạn EtOAc.
Hình 3.7. So sánh một số chỉ số lipid máu ở chuột ĐTĐ trước và