Nghiên cứu định lượng đồng phân của oflox acin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

m .
Tài liệu tham khảo
1. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2001), Ngũ cốc-Phưong pháp xá c định alíatoxin, Tuyển tập tiéu chuẩn nôngnghiệpViệt
Nam -Tập IV-tiêu chuẩn nông sản, Trung tâm thông tin nông nghiệp và phát triển nông thôn, tr 51-58,
2. Bọ Y tế (2009), D ược a é n Việt Nam IV, Nha xuất bản Y học, P L 9.6.
3. Trần Việt Hùng (2005), Khảo sá t và nghién cú u kiểm nghiệm một só hóa chất báo vệ thục vật và tồn d ư ừong du ọ c liệu, Luận

án

tiến sỹ dược học.
4. K.Arrus, G .Blank, D.Abramson, R .CIear, R.A.Holley (2004), AHatoxin production by Aspergillus flavus in Brazil nuts. Journal of
stored products Research, pp.513-527.
5. International Conference on Harmonization (ICH ) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use,
Validation of Analytical Procedurei.Text and Methodology (1996). ICH-Q2B, Geneva,
6

. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Valida­

tion of Analytical Procedures-.Text and Methodology (1996). ICH-Q2B, Geneva,

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỐNG PHÂN CỦA OFLOX­
ACIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
•

Nguyễn Thị Kiều Anh, Quách Ngọc Luyến, Vũ Thị Minh Quỳnh
Trường Đại học Dược Há Nội
SU M M ARY
A rapid, sim ple a n d accurate high - perfo rm a nce liquid chrom a tog rap hic m etho d with

uv d e tecto r has been developed an d

validated fo r separation, identification a n d quan titation o f ofloxacin enantiom ers in finished products. The chrom atographic codltions
a re a s fo llo w s: Phenom enex C Í 8 (250X 4 .6m m ; 5ụm ) colum n ; m obile ph a se: m ethanol/w ater 14:86 v/v, containing 2,0 m m ol/l L-leudne
a n d 0,6 m m ol/l Cu^* a t flow rate o f 0.9 m l/m ln; u v detection a t 293 nm ; in ject volum e: 5 ụl. Baseline separation o f the tw o enantiom ers
w as o bta in ed with resolution o f 4,63 w ithin ab ou t 17 m ins o f an alytical time. The m etho d was u sed to analyze the ofloxacin enantlom ers In m edicines.
T ừ k h ó a : định lượng, levo flo xad n , sá c k ý lỏng hiệu n ăng cao, tách đô n g phân.

Đặt vấn để
Ofloxacin (OFL) là một kháng sinh quinolon
thế hệ 2, do có một carbon bất đói nén ofloxacin
có một đóng phân đói quang (S)-ofloxacin
(Levofloxacin) và (R)-ofloxacin (dextrofloxacin).
OFL lưu hành trên thị trường cả dưới dạng đơn
thành phẩn là Levofloxacin (LEV) và dạng hỗn
hợp racemic. Ngày càng nhiéu dược phẩm chứa
dạng đơn đống phân LEV được sử dụng vì hiệu lực
kháng khuẩn của nó đã được chứng minh là mạnh
gấp 8-128 lần so với dạng R [2].
Việc xác định đơn đóng phân nói chung và
đóng phân của OFL nói riêng còn chưa có nhiéu
nghiên cứu. ở Việt Nam, LEV được sử dụng dưới
dạng thuốc viên, thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt, ...
Tuy nhiên, việc kiểm tra chất lượng dạng thuóc
nhỏ mát là khó khản hơn cả vì phải chiết tách lấy

lượng hoạt chất lớn để xác định vé mặt định tính,
còn định lượng thì tién hành một phép phân tích
riéng.
Trong báo cáo này, chúng tôi xin trình bày các
kết quả nghiên cứu phương pháp định tính và
định lượng đóng thời đổng phân của ofloxacin

bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Máy móc, thiết bị
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC Agilent
1260 detectơ u v (Mỹ),
Cân phân tích Mettler Toledo AB 204, d =
0,1 mg; e = 1mg (Thụy sĩ),
Hóa chất, chất chuẩn
- Methanol loại tinh khiết dùng cho HPLC (Merck - Đức),

S6 2/2012

Nghiên cúu dượcThỏng tin thuỗc

55


- Các hóa chất, thuóc thử Natri hydroxyd, kẽm Sul­
fat (ZnSO^JHp); đóng Sulfat (CuSO^.SHjO); nhôm clorid (AICụôH^O); L-leucin; L-lsoleucin; L-phenylalanin,
L- valin, L- methionin, L-lysin, L- asparagin, L-threonin
(đạt độ tinh khiết phân tích)
Chất đối chiếu: Ofloxacin chuẩn, hàm lượng
99,99%; levofloxacin chuẩn, hàm lượng 100% do
Viện Kiểm nghiệm thuốcTW cung cấp.
Đối tượng nghiên cứu
Thuốc nhỏ mắt Oflovid, số lô TR3114, HD:
200513; Thuốc nhỏ mát Cravit, số lô CV1251, HD:
130413. Thuốc nhỏ mắt Lecinflox, só lô E101905;
HD 15/11/2013. Thuốc nhỏ mát Levoquin, số
10^10209, HD: 02.2012.

Phương pháp nghiên cứu
Dùng phương pháp HPLC pha đảo với detectơ
uv, tiến hành:
- Khảo sát, lựa chọn và tối ưu hóa điều kiện
phân tích: Chất chọn lọc đóng phân đối quang
(ion kim loại, acid amin), cột sắc ký (loại cột, kích
cỡ,...), thành phẩn pha động, lựa chọn các điều
kiện phân tích khác: thể tích tiêm mẫu, bước
sóng...
-Thẩm định phương pháp phân tích với các chỉ
tiêu: độ chọn lọc, khoảng nóng độ tuyến tính, độ
đúng, độ chính xác.
Kết quả nghiên cứu
Khảo sát và lựa chọn điều kiện phán tích
Tiến hành khảo sát các điểu kiện phân tích và
lựa chọn chương trình sác ký phù hợp để tách,
định tính và định lượng đổng phân của O FL Cụ
thể như sau;
- Cột sác ký: dùng các loại cột Hypersil C18

BDS (4,6x250mm, 5nm); Zorbax C18 (3x150mm;
3,5|jm); Phenomenex C18 (250x4,6mm, 5|im)
- Lon kim loại tạo phức: AP+,
- Chất chọn lọc đổng phân: là các acid amin
L-leucin, L-lsoleucin, L-valine, L-phenylalanin, Lmethionin, L-lysin, L-asparagin, L-threonin
- Pha động: tỷ lệ pha hữu cơ và pha nước, lưu
lượng dòng
- Nồng độ chất phân tích và thể tích tiêm mẫu
- Bước sóng phát hiện: lựa chọn bước sóng
cực đại

- Và đã xác định được điều kiện phân tích cụ
thể là:
- Cột sắc ký: Phenomenex C18 (250 X 4,6mm;
5|im)
- Pha động; MeOH:Hp=14:86 (tt/tt) chứa 0,6
mmol/L Cu^'^va 2mmol/L L-leucin.
- Lưu lượng dòng: 0,9 ml/phút.
- Detector UV ở bước sóng: 293 nm.
- Thể tích tiêm mẫu: 5|jl.
Thẩm định phương pháp phán tích
Độ phù hợp của hệ thống sốc ký
Tiến hành sác ký lặp lại 6 lần dung dịch OFL
chuẩn và dung dịch LEV chuẩn đểu nóng độ
0,05mg/ml theo các điểu kiện sắc ký đã lựa chọn.
Kết quả như sau:
Sau 6 lẩn tiêm lặp lại một dung dịch LEV chuẩn
và một dung dịch OFL chuẩn, cho thấy các giá trị
RSD của diện tích pic và thời gian lưu đều có độ
lặp lại tốt (RSD < 2%), đổng thời trên sắc đồ dung
dịch OFL hai pic (S)-ofloxacin và (R)-ofloxcin tách
rời khỏi nhau (R khoảng 4,20), chứng tỏ các điều
kiện của hệ thống HPLC ổn định và phù hợp để
định tính và định lượng LEV.

Bàng 1. Kẽtqmâánhýáíộĩhiihợpcũahệtììỗagsòckị
O floxacin

Levofloxacin
STT

s (m AU.s)

(phút)

S jim A U .s)

‘ r -s

(phút)

1

1779,8

17,317

950,2

17,121

2

1778,0

17,297

963,7

17,092

3

1764,4

17,303

968,1

17,214

4

1756,7

17,389

942,5

17,033

5

1807,9

17,250

956,8

17,365

6

1786,5

16,898

959,0

17,196

TB

1778,88

17,24

956,72

17,20

RSD%

1 ,0 0

1 ,0 1

0,96

0,74

5 6 1Nghiên CỨU dược Thòng tỉnthuõc: Số2/2012

*R-R
(phút)

19.46
19.17
19..Í8
19.20
19.52
19.36
19.35
0,72

R.
4,20
4,25
4,18
4,15
4,28
4,23
4,22


m .
B

Độ đúng
Tiến hành theo phương pháp thêm chuẩn
(thêm 10% so với nồng độ mẫu thử). Kết quả được

trình bày ở bảng 4.

Tính chọn lọc
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn LEV 0,05mg/
ml; dung dịch chuẩn OFL 0,05mg/ml và mẫu trắng
là dung môi pha mẫu.Tỉến hành sắc ký theo điếu
kiện đã lựa chọn, kết quả được trình bày ở hình 1:
Kết quả ở hình 1 cho thấy, trên sắc đổ của mẫu
trắng, tại vị trí tương ứng xuất hiện pic của đóng
phân OFL và pic của LEV không thấy xuất hiện pic
lạ. Đổng thời trên sắc ký đổ hình 1C xuất hiện pic
của cả 2 đổng phân của OFL. Như vậy phương
pháp phân tích có độ chọn lọc cao.
Khoáng nồng độ tuyến tính
Chuẩn bị dây dung dịch chuẩn LEV có nổng
độ 0,04-0,06mg/ml. Tiến hành sắc ký, kết quả thu
được như sau:

STT

S,^,;(m AU.s)

^chuín«mlại^^9^
mi)

% tìm lại

1

1680,4

0,00518

100,5

2

1680,7

0,00519

100,7

3

1679,3

0,00514

99,8

4

1680,3

5

1681,2

Bảng 2. Kết quả đáp ứng diện tích pic theo nỗng độ Levofloxacin

0,00517

c (mg/ml)

0,040

0,045

0,050

0,055

0,060

s (mAU.s)

1543,3

1647,1

1764,4

1877,9

1982,7

Phương
trình hói
quy

Y = 22192X + 654,4

= 0,999

Kết quả ở bảng 3 cho thấy
ở nồng độ khảo sát, độ lặp
lại của 5 phép thử song song
là khá tốt, với RSD là 0,45%
(<2,8%) [4], chứng tỏ phương
pháp có độ lặp lại tốt.

% SO với lượng
ghi trên nhãn

0,00520

1 0 1 ,0

(mAU.S) = 1524,7; Sj, (mAU.s) = 1567,7

Kết quả ở bảng 2 cho thấy, diện tích pic và
nóng độ LEV có mối quan hệ tuyến tính trong
khoảng nóng độ khảo sát (R^= 0,999). Chúng tôi
lựa chọn nóng độ OFL và LEV là 0,05mg/ml làm
nồng độ định lượng.
Độ chính xác
Chuẩn bị song song 5 mẫu thử nóng độ LEV
0,05 mg/ml từ thuốc nhỏ mắt Cravit trong pha
động. Tiến hành sắc ký, kết

quả được trình bày ở bảng 3:
S^(mAU.s)
(m g/m l)

100,5

Ghi chú: (-) khôngỉiếnhànhphân tích

Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng
cao với tỉ lệ tìm lại từ 99,8% đến 101,0% và độ lệnh
chuẩn tương đối RSD = 0,44% < 2% đáp ứng yêu
cẩu về độ đúng của phương pháp.
Bàng 3. K ít quàklìáo sá t độ chfnh x á í của phương pháp phân tkh

1513,9

1524,7

1527,5

1518

1530,6

0,00503

0,00499

0,00498

0,00501

0,00497

100,5

99,8

99,6

100,2

99,4

= 1524,7 (m AU.s),

SỐ2 / 2 0 1 2 1

RSD
= 0,45%

= 0,0499 m g/ml

Nghiên Cứu duộc Thông tin thuốc 57


ứng dụng
Tiến hành định tính và định lượng LEV trong
một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt và viên nén lưu
hành trên thị trường, đồng thời so sánh với kết

quả định lượng LEV theo phương pháp của nhà
sản xuất, kết quả được trình bày ở bảng 5.
Băng 5. Kết quỏ SỊĩìíì tính, Síntì lượng lEV trong m ột số thuởc ỉìhỏ m ât

Hàm lượng LEV so với
lượng g hi trên nhãn (%)

Chể phẩm

Theo
phương
pháp
đã thẩm
định

Chuán

17,52

Lecinflo x 5m g/
mL

17,55

101,42

Cravit 5m g/m L

17,53

99,97

Levo quin 5m g/
ml
Sonlexim
500m g
Levom ax
SOOmg

Th eo tiêu
chuẩn
nhà sản
xuất

17,42
100,7

100,3

17,18

100,6

100,8

17,91

99,97

99,57

Kết quả ở bảng 5 cho thấy, thời gian lưu của
LEV trong dung dịch thử tương ứng với thời gian
lưu của LEV trong dung dịch chuẩn và các thuốc
đem định lượng đạt yêu cẩu vé hàm lượng (90%
- 110%) và kết quả tương đổng như định lượng

bằng phương pháp theo tiêu chuẩn đã đăng ký.
Bàn luận
Trên thế giới, để tách đổng phân quang học
người ta hay sử dụng hai phương pháp là CE và
HPLC. Đói với OFL, để tách đống phân quang
học của nó đã có nghiên cứu dùng chất chọn lọc
là carboxymethyl-p-cyclodextrin bằng điện di
mao quản [6], HPLC detector u v dùng chất chọn
lọc L-Leucinnamid [1] hoặc L-lsoleucin [3]....Tuy
nhiên, việc triển khai phân tích các thuốc ở dạng
đổng phân mới bắt đẩu được chú ý ở Việt Nam,
mặt khác thiết bị CE cũng chưa thông dụng tại
các cơ sở kiểm nghiệm. Vì vậy chúng tôi lựa chọn
phương pháp có tính khả thi cao là HPLC trong
nghiên cứu của mình.
Trong các nghiên cứu trước, việc sử dụng
L-leucin kết hợp với Cu^^chỉ dừng lại ở giai đoạn
khảo sát, nên chúng tôi lựa chọn pha động chứa
L-leucin và Cu^+để tiến hành nghiên cứu xây dựng
phương pháp như là một hướng nghiên cứu mới
và nhận thấy cho kết quả tốt hơn các nghiên cứu
[5], [6] với hệ só tương quan cao
0,999).

Kết quả thẩm định phương pháp về độ chọn
lọc, độ đúng, độ chính xác, khoảng tuyến tính đáp
ứng yêu cẩu [4] và cũng tương đổng với kết quả
của các nghiên cứu khác [3], [5], [6],
Kết luận
Phương pháp tách, định tính và định lượng
đổng thời dạng đơn đóng phân của OFL là LEV
có thể triển khai ở nhiều phòng thí nghiệm ở Việt
Nam với tính chọn lọc, độ chính xác và độ đúng
cao. Các thiết bị và hóa chất sử dụng sẵn có, phổ
biến của các phòng kiểm nghiệm ỞViệt Nam. Bước
đẩu áp dụng phân tích một sổ mẫu chế phẩm của
OFL và LEV cho kết quả khách quan và hàm lượng
tương đồng khi tiến hành theo phương pháp định
lượng đâ đăng ký.

Tài liệu tham khảo
1. Abdalla A , Elbashir; Bahruddin Saad ; Abdussalam Salhin Mohamed Ali; Muhammad Idiris Saleh; Hassan Y. Aboul-Enein (2008),
“Determination of Ofloxacin Enantiomers in Pharmaceutical Formulations by Capillary Electrophoresis". Journal o f Liquid Chromatography
& R elated Technologies, 1520-572X, Volume 31, Issue 3, pp. 348 - 360.
2. I Morrissey, K Hoshino, K Sato, A Yoshida, I Hayakawa, MG Bures and LL Shen (1996), “ Mechanism of differential activities of
ofloxacin enant'iomers".Antimicrobial Agents and Chemotherapy, pp. 1775-1784, Vol 40. 3. Karl-Heinz Lehr and Petra Damm (1988),
"Quantification of the enantiomers of ofloxacin in biological fluids by high-performance liquid chromatography”. Journal o f Chromatography
B : Biom edical S cie n ce s and Applications. Volume 425, pp. 153-161.
3. Ludwig Huber, “Validation and qualification in Analytical Laboratories Second Edition’’, 2007, p. 144.
4. Minglei Tian, Hongyuan Yan Row and Kyung Ho Row (2009), “Investigation of ofloxacin enantioseparation by ligand exchange
chromatography”. J Chem Techno! Biotechnol 2009: pp. 1001-1006
5. Minglei Tian, Hyung Sang Row and Kyung Ho Row (2010), “Chiral separation of ofloxacin enantiomers by ligand exchange chroma­
tography”. Journal monatshefle fur Chemle. pp. 285-290.

58

Nghiên CỨU dược Thòng tin thuoc

Số 2/2012